TÉCNICAS DE
CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
TOTALES
Microbiología experimental 2020-1
Elaboró: Micro Exp.
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Mate para estudiantes de nachillerato que desean estudiar mate
Tipo: Esquemas y mapas conceptuales
2015/2016
Subido el 10/09/2023
usuario desconocido 🇵🇪
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TÉCNICAS DE
CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
TOTALES
Microbiología experimental 2020-
Elaboró: Micro Exp.
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Dudas y sugerencias en Inbox Micro Exp
Versión 3.0.
¿Por qué cuantificar? (^) Expresar numéricamente una magnitud (RAE,2015) (^) Uso de microorganismos como indicadores de calidad (^) Usos de microorganismos en procesos biotecnológicos= seguir un proceso
Métodos indirectos: Métodos espectrofotométricos Turbidimetría Nefelometría Es la medición de la luz transmitida a través de una suspensión Es la medición de la luz dispersada en dirección distinta a la emitida (15-90º).Uso de filtro verde ( nm) Longitudes de onda para microorganismos: Bacterias 540 nm Protozoarios 580 nm Levaduras 600 nm Señal (unidades):D.O – densidad óptica ( Absorbancia/Transmitancia) Señal (unidades): Unidades Klett,
NTU (Unidades de Turbidez Nefelométrica, por
sus siglas en ingles
Factor de conversión de nefelometría (UK) a DO U.K (nefelometría)= DO/0.
CURVA ESTANDAR DE MC FARLAND *Modificación de la tabla 2 NOM-181-SSA1- mL 1% de BaCl 2 mL de Solución 1% H 2 SO 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tabla para la preparación de la curva de Mc Farland
TRAZANDO LA CURVA ESTANDAR DE MC FARLAND
- Leer cada uno de los tubos de la escala en el nefelómetro/ espectrofotómetro (600nm). (^) *¡Cuidado! Recuerda lavar la celda de lectura entre muestras, no tocar la parte inferior con los dedos y limpiar la parte exterior antes de realizar la lectura. (^) *Agita los tubos vigorosamente para homogeneizar la suspensión antes de vaciar a la celda y realiza la lectura rápidamente para evitar la sedimentación del BaSO 4
- Asociar la concentración (nunca número de tubo de escala) con la señal del equipo (unidades Klett/absorbancia) (^) E.g. x=300X10^6 , y=110 U.K –Caso del tubo 1 (^) 3. Ajustar a un modelo lineal (quitar valores anómalos- volver a evaluar). Buscar un valor de R^2 >0. (^) -Los valores anómalos pueden presentarse especialmente en altas concentraciones, ya que las partículas no se mantiene en suspensión fácilmente y colapsan rápidamente, disminuyendo su aportación a la densidad óptica del medio Valores anómalos
TRAZANDO LA CURVA ESTANDAR DE MC FARLAND
CALCULANDO LA CONCENTRACIÓN DE MICROORGANISMO EN UNA MUESTRA
Nefelómetría:
2. Ajustar el blanco del método, introduce el tubo del
matraz nefelométrico con medio estéril, sin inocular en la
ranura del nefelómetro
3. En equipos digitales, pulsa la tecla de “Lectura” /”Read.
En equipos analógicos, girar la perilla hasta nivelar el
señalamiento del lector.
4. Registra el resultado en bitácora en U.K..
5. Repite para cada tiempo de incubación/muestreo
6. Traduce con ayuda de la curva de McFarland de U.K. a
concentración UFC/mL.
-eg. Si la muestra tuvo una señal de 450 UK, la
concentración de microorganismos/mL será :
(microorg./mL)= ((450+5.7653)/4X10-7))=
12X10^9 microorg./mL
El informe debe realizarse con 2 cifras significativas,
expresado en notación científica
VENTAJAS Y DESVENTAJAS VENTAJAS (^) Método rápido de evaluación del crecimiento microbiano. (^) Permite realizar un seguimiento rápido de las cinéticas de crecimiento. DESVENTAJAS (^) No diferencia entre microorganismos vivos y muertos (método totales) (^) Microorganismos capsulados pueden presentar dificultades al ser evaluados (no homogéneo). (^) Metabolitos secundarios que aportan turbidez pueden interferir.
EJERCICIO: IDENTIFICA LAS FASE DE CRECIMIENTO Fase lag o latencia Fase exponencial (Sirve para cálculos cinéticos) Fase estacionaria ((Equilibrio dinámico vivos-muertos) (Muerte y lisis celular)^ Fase de muerte
DETERMINA LOS PARÁMETROS DE CINÉTICOS DE CRECIMIENTO
- El log 2 X, resulta de la resolución de la ecuación diferencial yde del hecho de considerar el fenómeno de reproducción bacteriana es por fisión binaria
Si lo deseas también puedes utilizar log 10
- Esto lo podrás consultar en la edición 14 de Biología de los microorganismos (Cuidado porque ediciones anteriores contienen algunas imprecisiones)
CÁLCULO DE PARÁMETROS CINÉTICOS- MÉTODO GRÁFICO. (^) m = μ = log 10 2/g=n log 10 2 /t incubación tanto: (^) La velocidad específica de crecimiento (μ) será: (^) μ = 0.0702 h- (^) La velocidad de división (v) será: v= μ / log 10 2 (^) v= 0.2332 h- (^) El tiempo de generación (g), será: (^) g= log 10 2/0.0702= 4.3 h (^) El número de generación para un tiempo de incubación de 4.3 h, será: (^) m= n log 10 2 /t (^) incubación, por tanto n=m t (^) incubación, (^) Asi que, n=(0.0702) log 10 2 (4.3)=1, por tanto, n=1, es decir, en 4.3 h recién se esta formando una nueva generación (como se esperaba) En general este modelo primario de evaluación cinética es el más sencillo y no considera la influencia de la variación de sustrato con respecto al tiempo en el crecimiento, para eso hay otros modelos matemáticos que tratan de modelar este fenómeno
EVALUACIÓN POR DECOLORACIÓN DE RESAZURINA En este caso incubamos por una hora y realizamos la evaluación, aunque también podríamos hacer seguimiento por triplicado por 3 h, registramos el color y realizamos la evaluación ¡Cuidado! La presencia de sustancias reductoras en la muestra provocarán una sobreestimación.
MÉTODOS DIRECTOS: RECUENTO MICROSCÓPICO
Cámara de Neubauer/
Cámara de Petroff- Hausser Cuenta de Breed (Samuel C. Prescott y Robert S. Breed,1910. Leche) Área de Extensión Am (μm^2 ) Área de campo Ac (μm^2 ) Observación a 100x 10 campos (Promedio Ẋ) Tinción VENTAJAS Permite evaluar morfologías distintas. Permite evaluar movilidad Para ciertos microorganismos (moviles) puede ser un método de cuantificación de viables. DESVENTAJAS Presenta un sesgo por la presencia de asociaciones microbianas en muestras reales. En muestras con altas concentraciones el conteo no es confiable