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Tema Nº 1 0 RECUENTO DE LEUCOCITOS 12 .1. INTRODUCCIÓN El recuento de los distintos elementos formes presentes en sangre, es una de las prácticas más antiguas en hematología. Siendo además muy útil los resultados obtenidos, puesto que permiten la detección y alteraciones cuantitativas (en la cantidad o número) de las distintas células sanguíneas. Los recuentos celulares que se realizan por con métodos manuales utilizan los hemocitómetros o cámaras de recuento, actualmente ya se están utilizando contadores hematológicos. El principio del recuento celular manual es sencillo y similar para elementos sanguíneos, solo varía la dilución, el diluyente y el área contada expresada en cantidad por mm^3 , por el volumen obtenido en el hemocitómetro; el contador hematológico expresa en litros (L), pues los equipos automatizados cuentan una mayor cantidad de células suspendidas en una solución diluyente isotónica. Todos los recuentos celulares constan de 3 fases: Dilución de la sangre. Profundidad de la cámara Número de células contadas en 1 mm3 de sangre Para la realización del recuento manual y los cálculos finales de los mismos es necesario describir los materiales a utilizar: 12.2. DESCRIPCION DE LOS MATERIALES 12.2.1. CÁMARA DE RECUENTO NEUBAUER También se llama Hemocitómetro. Consiste en una placa gruesa de vidrio, en forma de portaobjetos que mide 30 x 70 mm y 4 mm de grosor, cuya porción central está dividida en 3 segmentos en forma de H por 4 ranuras transversales y el segmento central dividida en dos por una ranura perpendicular. Figura 1. Cámara de neubauer
De ellas, el segmento central tiene una profundidad de 0,1 mm. respecto a los segmentos laterales y en la cual está grabado dos retículos cuadrangulares denominados retículo de neubauer (véase figura 2 ). Figura 2. Profundidad de la cámara Retículo de neubauer En la Cámara de Neubauer en un primer plano como se observa en el microscopio el retículo con las áreas de conteo; los cuadros externos de color celeste se emplean para contar leucocitos y los cuadraditos centrales de color rojo para eritrocitos y plaquetas. 12.2.2. RETÍCULO DE CONTEO DE LA CÁMARA Se observa el retículo en el microscopio con los siguientes objetivos: Primero con el objetivo 4x. Se puede observar todo el cuadro con todas las secciones del retículo. Con el objetivo 10x. Se puede observar el cuadro central de 25 cuadrados y el cuadro periférico de 16 cuadrados. Por último, con el objetivo 40x. Observamos uno de los 16 cuadraditos y uno de los 25 cuadraditos pequeños. Las líneas reforzadas, o triples, sirven únicamente como límites de cada cuadrado grande que contiene los 16 cuadrados pequeños. Fig. Figura 3. Líneas triples de división
3 mm / 3 cuadros grandes = 1mm cada cuadro grande. b). Cuadrante periférico: (Leucocitos). Cada cuadrado grande que mide 1mm se divide entre los cuatro cuadrados medianos por lado: (véase lado izquierdo fig. 4) 1 mm/ 4 cuadrados medianos = 0,25 mm cada cuadrado mediano c). Cuadrante central: (Eritrocitos y plaquetas). Se puede observar a la izquierda cuadro grande central con 25 cuadros medianos y abajo derecha, cuadro mediano periférico subdividido en 16 cuadros pequeños Figura 5. Cuadrante central grande y cuadrante mediano Teniendo en cuenta que la longitud de cada lado del cuadrado grande es de 1 mm, calculamos: El cuadrado grande central contiene 5 cuadrados medianos por lado. 1 mm total / 5 cuadrados medianos = 0,2 mm cada cuadro mediano La longitud del cuadrado mediano central tiene 4 cuadrados pequeños por lado. 0,2mm / 4 cuadrados pequeños = 0,05 mm cada cuadrado pequeño Volumen de sangre diluida : Teniendo en cuenta que la longitud del espacio comprendido entre el retículo y el cubre es de 0,1 mm, calculamos el volumen de sangre del retículo entero: 3mm largo x 3mm ancho x 0,1 mm alto = 0,9 mm cúbicos de sangre diluida
12.2.3. CUBRECÁMARA
El cubrecámara (Fabricadas de vidrio especial óptico con bordes esmerilados y pulidos) se utilizan para cubrir la suspensión de células en la cámara de recuento, se coloca en los segmentos externos y la planicidad de las superficies permitiendo que el Figura 6. Cubrecámara cubrecámara se adhiera bien. Así, limita exactamente la ranura capilar entre el fondo de la cámara y el lado inferior del cubrecámara y define el volumen de la suspensión sobre el retículo. Cuando está bien ajustado sobre la cámara, se observan unas irisaciones de colores entre las dos láminas de vidrio llamadas anillos de Newton. Algunas cámaras también constan de dos pinzas especiales que parten, cada una, de una de las bandas laterales de la cámara y que tienen por función la de asegurar la fijación del cubre a la misma. Figura 7. Pinzas sujetadoras 12.2.4. PIPETAS DILUIDORAS DE THOMA Son pipetas especiales de vidrio que están constituidas por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar termina en punta a nivel del extremo inferior y se continúa con el bulbo a nivel del otro extremo superior. El capilar inferior está dividido en 10 partes iguales y en su superficie tiene marcada la 5ª división (con un 0,5) y la 10ª (con un 1). Figura 8. Pipetas diluidoras: A = pipeta para recuento de glóbulos rojos B = pipeta para recuento de glóbulos blancos.
A
B
A
B
Material para dilución en pipeta: Pipeta de Thoma para leucocitos (perla blanca) Boquilla blanca Papel Parafilm Cámara de Neubauer Cubrecámara Microscopio Material para dilución en tubo: Tubo de hemólisis o eppendorf. Micropipeta de 100 a 500 ul. Micropipeta de 2 0 ul. Hemocitómetro - Cámara de Neubauer. Cubrecámara. Parafilm. Microscopio. Papel. Reactivos: Líquido de Turk: o 2 ml ácido acético glacial. o 1 ml Azul de metileno o Agua destilada, cantidad suficiente para completar a 1000 ml. Deberá filtrarse a menudo para evitar interferencias de precipitados, levaduras y hongos. Muestra Sangre anticoagulada con EDTA 12.5. PROCEDIMIENTO. Se realiza mediante dos técnicas: Dilución en pipeta de Thoma 1. Con la pipeta en posición vertical aspirar la sangre hasta la marca 0. para realizar una dilución de 1/20, y hasta 1 para la dilución de 1/10. El exceso de sangre se elimina tocando la punta de la pipeta con una gasa o papel. 2. Limpiar cuidadosamente la sangre adherida a las paredes externas de la pipeta con gasa o papel, sin tocar la punta de la pipeta para evitar bajar el nivel de sangre.
1. Introducir la pipeta en posición vertical en el tubo o frasquito que contiene el líquido de Türk y aspirar hasta la línea superior de enrase 1 1. Si se aspira más diluyente y rebasa la línea de enrase se desecha todo y se vuelve a iniciar el cargado. 4. Retirar el adaptador de boquilla de la pipeta obturando con Parafilm la punta de la pipeta para evitar la pérdida del líquido, luego obturar de la misma manera el extremo opuesto, mantener la pipeta en posición horizontal, colocar en el agitador automático para pipetas durante 3 o 4 min. (tb. Se puede mezclar manualmente haciendo rotar o por inversión). 5. Situar un cubrecámara sobre las dos superficies elevadas de la cámara para cubrir los dos retículos de la cámara. Para facilitar su adhesión a ésta, se ejerce una ligera presión al tiempo que se desliza el cubre sobre las bandas laterales, previamente humedecidas con H2O. 6. Destapar la pipeta y descartar las primeras 4 0 6 gotas del diluyente que queda en el capilar y que no se diluye con la muestra, (tapar con el dedo índice el capilar superior de la pipeta). 7. Cargar por capilaridad ambos lados de la cámara manteniendo la pipeta en un ángulo de 45º, durante esta operación se debe evitar que se formen burbujas y que rebase la sangre diluida hacia las hendiduras en forma de H de la cámara. Para ello se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se disminuye algo la presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira ésta justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara. 8. Dejar reposar 3 a 5 min. para que los leucocitos se distribuyan y se asienten en el fondo de las cuadrículas. Dilución en tubo: 1. Colocar en un tubo de hemólisis 380 ul. (0,38 ml), de líquido de Türk para una dilución 1/20. 2. Agregar 20 ul de sangre anticoagulada. 3. Homogeneizar suavemente de 3 a 5 min.
12.6. CÁLCULOS
Se calcula el número de leucocitos por milímetro cúbico de sangre cuando se toma en cuenta: N° de leucocitos en el área contada Profundidad de la cámara Dilución de la sangre Los recuentos de leucocitos, se expresan por unidad de volumen de sangre, que es 1mm^3. Por ej. Después de contar los glóbulos blancos de los 4 cuadrados externos, se suman el total de ellos y con dicha cantidad se aplica el siguiente cálculo: N= Número de leucocitos contados D =Dilución 1:20 ó 1: Profundidad de la cámara = 10 4= Cuadros (c/u 1 mm^2 ) N° de leucocitos x mm^3 = N° de leucocitos contados x 50 Como ejemplo tenemos la siguiente distribución y recuento de leucocitos. Leucocitos/mm^3 = 111 x 20 x 10: 4 =5.5 50 mm^3 Leucocitos/mm^3 = 111 x 50 = 5.550 mm^3 Si la cuenta de leucocitos menor de 2.000/mm^3 , es recomendable hacer nuevamente la cuenta de leucocitos, pero con una dilución 1:10, si por el contrario la cuenta en muy elevada, se debe emplear una dilución 1: 100 ó 1:200. 12.7. VALORES DE REFERENCIA Leucocitos/mm3 = N x D x 10: 4 Nº de leucocitos Edad Recién Nacido (^) 10 a 25 mil/ mm Al año de edad (^6) a 1 8 mil/ mm De los 4 y 7 años 6 a 1 5 mil/ mm De los 8 a los 1 8 años 4 a 13 mil/ mm Adultos (^) 5 a 10 mil/ mm
Los Leucocitos representan el 1% total de la sangre, los valores o proporciones que tenemos en el cuerpo pueden indicarnos ciertas enfermedades ligadas a bacterias o alergias. Producimos los glóbulos blancos en la médula ósea y desde ahí maduran en los ganglios linfáticos, bazo, hígado o riñones. Normalmente, las personas producen unos 100.000 millones de glóbulos blancos (leucocitos) al día, una cantidad muy alta o muy baja de glóbulos blancos indica un trastorno. 12.8. Alteraciones del número de leucocitos Leucocitosis , un aumento en el número de glóbulos blancos (leucocitos) de más de 11.000 células por ml de sangre, está causada a menudo por una respuesta normal del organismo para ayudar a combatir una infección o inflamación. Sin embargo, también algunas neoplasias de la médula ósea (como la leucemia) o la liberación de glóbulos blancos anormales o inmaduros de la médula ósea al torrente sanguíneo provocan un aumento del número de glóbulos blancos (leucocitos) en la sangre. Causas fisiológicas: Ejercicio intenso, stress, embarazo y parto. Enfermedades del sistema hemocitopoyético: Hiperplasia maligna (leucosis o leucemia). Causas patológicas: Hiperactividad del sistema hemocitopoyético que afecta en forma exclusiva o predominante, a uno de los tres sectores del sistema: Mieloide, Linfoide o SER. Se observan, además, células juveniles en sangre periférica que en la sangre normal no existen. La fórmula absoluta nos informa sobre qué alteraciones se produce (aumento o disminución de los leucocitos en todo el sistema o solo en alguno de los sectores). Esto nos demuestra la importancia y la calidad de realizar y analizar un hemograma. La leucopenia, que es una disminución del número de glóbulos blancos (leucocitos) por debajo de 5.000 células por microlitro de sangre, suele hacer que las personas sean más vulnerables a las infecciones. Las causas que pueden llevar a la producción anormalmente elevada de leucocitos y, con ello, a una leucocitosis son: Una producción elevada de glóbulos blancos para combatir una infección viral o bacteriana. Una reacción a un medicamento que aumenta la producción de glóbulos blancos como pueden ser corticoesteroides y/o epinefrina. Una enfermedad de la médula ósea, que provoca la producción anormalmente elevada de glóbulos blancos.
