Microbiología Ambiental: Apuntes de Clase 2017, Apuntes de Microbiología

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Microbiología

Ambiental

Mi

cología

1 Microbiología Ambiental

Objetivos:

 Adquirir buenas prácticas para el manejo de técnicas de

micología

 Realización de macro y microcolonias para la identificación

de hongos filamentosos.

 Realización de cultivo y pruebas de identificación de

levaduras.

INDICE

Micología

Objetivos 1

Características generales de los hongos 2

1. Levaduras 2

2. Mohos (Formas miceliares) 3

Clasificación de los hongos filamentosos 6

 Micelio no tabicado 6

 Micelio tabicado 6

Medios de cultivo 7

Estudios morfológicos de los hongos filamentosos 8

 Observación Macroscópica de la colonia 8

 Observación Microscópica 9

Estudio inicial de levaduras 10

Glosario 14

2. Mohos (Formas miceliares)

Forma multicelular de crecimiento de un hongo. La unidad estructural fundamental son tubos o filamentos llamados hifas , que se pueden dividir en cadenas de células por la formación de paredes transversales, o tabiques, o presentarse en forma continua, en largos tubos, como hifas no tabicadas. Un grupo de hifas entrelazadas y ramificadas constituye el micelio , y la parte que crece sobre su extremo y absorbe el alimento es el micelio vegetativo , mientras que el que se proyecta por arriba del mismo y contiene los esporos se denomina micelio aéreo o reproductor. En el micelio aéreo, se producen los esporos característicos que, al ser sembrados en un sustrato adecuado, producen un proceso tubular (tubo germinal) que se desarrolla en micelio y eventualmente en una colonia de hongos. Los mohos se reproducen en forma sexuada o asexuada o ambas, según la especie y las condiciones del ambiente que los rodean. La reproducción sexual supone la formación de estructuras de morfología complicada, lo que facilita la fecundación y la consiguiente fusión nuclear y da por resultado la producción de esporos especializados llamados cigotos (por ejemplo: oosporos, ascosporos y cigosporos). El hongo que presenta fase sexual se denomina hongo perfecto. Los imperfectos son los que no muestran fase sexual; en ellos los esporos son producidos directamente por el micelio o a partir de el. El tipo de esporo que producen y la forma en que se efectúa la esporulación es importante para la identificación de los diferentes hongos. A continuación, se definen algunos términos habituales en micología: Blastospora (blastoconidios). Célula fungía que se forma como consecuencia de un proceso de gemación, por ej células de levadura . Clamidospora. Espora esférica formada en las hifas, ya sea en posición intercalar o terminal, de pared gruesa y cuyo diámetro es mayor que el de los filamentos en los que se forma. Artrospora (artroconidio). Espora formada directamente por división y transformación de una hifa.

Conidio (conidia). Espora formada como consecuencia de un proceso de reproducción asexual. Micelio. Conjunto de hifas o filamentos de un hongo. Pseudomicelio Micelio. Formado por determinadas levaduras, que se diferencia de un micelio, por la presencia de estrangulamientos, en lugar de verdaderos sextos. Conidiosporos: son esporos asexuales producidos aisladamente o en grupos, por hifas vegetativas especializadas llamadas conidioforos. Los conidios se separan del punto de unión por pinzamiento o compresión. Algunos conidioforos se dilatan en su extremo, y sobre esta superficie se forman numerosos pedúnculos en forma de frasco, de donde salen los conidios en cadenas (catenoide). La porción dilatada del conidioforo se denomina vesícula, las estructuras en forma de frasco son los esterigmas o fiálides. Por su tamaño los conidios pueden clasificarse en: a. Microconidios: pequeños, unicelulares, redondos, elípticos o piriformes. b. Macroconidios: grandes, pluricelulares, por lo general tabicados, en forma de clavas o fusiformes. Esporangiosporos: son esporos asexuales contenidos en los esporangios producidos terminalmente en los esporangioforos (tallos no tabicados). La esporulación se produce por un proceso denominado de hendidura progresiva. Luego de la maduración, la pared del esporangio se rompe para liberar las esporas.

Medios de Cultivo

La mayoría de los hongos son nutricionalmente poco exigentes y desarrollan en medios sencillos que contengan medios sencillos que contengan hidratos de carbono como fuente de carbono (glucosa, maltosa, sacarosa, almidón, celulosa), sales de nitrógeno inorgánico o peptonas, como fuente de nitrógeno y pequeñas cantidades de oligoelementos (Fe, Mg, P, K Zn,Cu, Mn y Mo). Hay tres tipos generales de medios de cultivo para hongos:

1. Medios Naturales: Trozos o infusiones de frutas, vegetales,

granos de cereales o tejidos animales. Varían mucho en su composición y no son reproducibles. Tampoco son de amplio uso.

2. Medios Semisintéticos: Extractos de plantas, peptonas, agar y otros

compuestos son de amplio uso.

3. Medios Sintéticos: Composición química definida. Tal vez el más conocido y

utilizado de estos medios es el Agar Sabouraud cuya descripción se realiza a continuación. AGAR GLUCOSADO SABOURAUD Este medio puede ser utilizado para el aislamiento, identificación y conservación de hongos saprófitos y patógenos. Es un medio nutritivo cuya alta concentración de glucosa y el pH ácido actúan inhibiendo el desarrollo bacteriano. El agregado de antibióticos aumenta la selectividad del medio y permite eliminar bacterias y hongos saprófitos indeseables a partir de muestras contaminadas. Los antibióticos que frecuentemente son utilizados son estreptomicina (100 ug/l), cloranfenicol (500 mg/l) y cicloheximida (0.5 mg/l) los cuales son agregados al medio de cultivo ya estéril y fundido a 45- 50ºC. Algunos cultivos no esporulan ni producen pigmento en agar de Sabouraud. Para favorecer esto, han resultado útiles los medios especiales, como el agar con papa y dextrosa, el agar con papa y zanahoria, el agar con harina de maíz, agar arroz, o agar de Sabouraud con el agregado de tiamina e inositol. AGAR CON PAPA Y DEXTROSA Hervir las papas en agua durante 15 minutos, filtrar a través de un algodón, y reponer el volumen con agua. Agregar los ingredientes secos y disolver el agar por medio del calor. No es necesario ajustar el pH. Distribuir en forma conveniente y autoclavar. Se emplea este agar para estimular la producción de esporos. Composición Pluripeptona 10 gr. Glucosa 40 gr. Agar 15 gr. Agua Destilada

ml Ph 5,

Composición Infusión de papas 200 gr. Dextrosa 20 gr. Agar 20 gr. Agua Destilada 1000 ml AGAR CON PAPAS Y ZANAHORIAS Lavar las papas y las zanahorias, aplastarlas y colocarlas en agua destilada durante una hora. Hervir durante 5', filtrar por papel de filtro, reconstituir el volumen a 1l y agregar 15 g de agar y 5 ml de Tween 80. Autoclavar y distribuir. Este medio es excelente para demostrar las características de color de las colonias de hongos.

Estudios morfológicos de los hongos filamentosos

El reconocimiento de mohos u hongos filamentosos se basa en el estudio macroscópico y microscópico de las colonias. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA DE LA COLONIA El examen macroscópico se realiza a partir de una “macrocolonia” obtenida por sembrado de la especie fúngica en estudio en la parte central de una placa con medio de cultivo (Agar Glucosado Sabouraud). Para ello se emplea una aguja aplanada en uno de sus extremos en forma de espátula. Las placas son luego incubadas a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ºC) durante 3 a 15 días con observaciones diarias. De esta colonia gigante se describirá: a. Velocidad de crecimiento: es el tiempo que tarda la colonia en ocupar las 2/3 partes de la placa  Rápido: entre 1 y 2 semanas.  Moderado: entre 2 y 3 semanas.  Lento: entre 3 y 4 semanas. b. Topografía de la colonia:  Forma: circular, irregular, filamentosa  Elevación: plana y extendida, elevada y limitada, umbilicada  Margen: entero, lobulado, desflecado, rizoide  Superficie: plegada, con surcos radiados, cerebriforme c. Pigmentación en anverso y reverso de la colonia o pigmento difusible en el medio. d. Textura: granulosa, pulverulenta, vellosa, aterciopelada, algodonosa. e. Tamaño: crecimiento limitado o crecimiento invasivo. Composición Zanahoria peladas 20 gr. Papas peladas 20 gr. Agua Destilada 1000 ml

Estudio inicial de levaduras

La identificación de especies de levaduras puede llevar a cabo atendiendo a cuatro criterios deferentes: morfológicos, bioquímicos , inmunológico o genéticos, en el practico llevaremos a cabo solo los dos primeros. Aspectos morfológicos Las colonias de levaduras suelen ser de color blanco crema, más o menos lisa ( ej., Candida albicans ) o de aspecto seco y plegadas (ej., Candida krusei ) con algunas excepciones que forma un micelio (ej., Geotrichum, Trichosporon ), las colonias mucoide sugiere la formación de cápsula (ej., Cryptococcus neoformans ). Las colonias de color rojo -anaranjado de aspecto cremoso o rugosa con características de las especies del género Rhodotorula. Características microscópicas Las características microscópicas observadas a partir de una suspensión en agua o solución fisiológica de la levadura en estudio, preparado directo, o tinciones ordinarias usadas para bacterias (por ejemplo, Gram) puede describirse la morfología de las células y también puede observarse la presencia de elementos en gemación. Estas tinciones enmascaran el contenido celular que puede evidenciarse por coloraciones específicas como, por ejemplo: hematoxilina férrica (observación del núcleo), sudán III (glóbulos de grasa), rojo neutro (gránulos metacromáticos y vacuolas), azul de metileno (nucleoproteínas), IK (gránulos de almidón y

10 Microbiología Ambiental pretación: Se consideran positivos aquellos tubos que presenten turbidez visible, tomando como testigo el correspondiente glucógeno). Se utiliza la tinción negativa, realizada con tinta china para la visualización de elementos capsulados, resulta de particular importancia en la identificación de un hongo levaduriforme de importancia clínica denominado Criptococcus neoformans. Una prueba de utilidad es el tubo germintivo, que es una extensión filamentosa de la levadura, si estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser lamida dela célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre. Prueba de tubo germinativo: es una determinación de gran utilidad en el laboratorio clínico para la identificación de Cándida albicans , una levadura que produce más del 75% de las infecciones causadas por hongos. Esta levadura cultivada en suero produce al cabo de 3 hs una protuberancia denominada tubo germinativo. Técnica: Un pequeño inóculo de una colonia aislada de levaduras se suspende en 0,5 ml de suero y se inocula a 37ºC durante 3 horas. Luego de la incubación, se coloca una gota de la suspensión de levaduras en un portaobjeto limpio, se cubre con un cubreobjetos y se examina con bajo poder en busca de tubos germinativos. Características fisiológicas Las distintas especies de levaduras no difieren ni macro ni microscópicamente unas de otras, por lo tanto para su identificación se requiere de pruebas fisiológicas tales como: a. Pruebas de utilización de glúcidos (Auxonograma de sustancias carbonadas): Mediante esta prueba se ensaya la capacidad de asimilación de distintas fuentes de carbono. Para su realización se utiliza un medio base líquido (g/l: sulfato de amonio, 5; fosfato diácido de potasio,1; sulfato de magnesio, 0.5) al que se le agrega los siguientes azúcares: glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, rafinosa, xilosa, y otros. Si la levadura puede utilizar estos glúcidos como única fuente de carbono crecerán en el medio de cultivo enturbiándolo. Técnica: 1- Distribuir el medio base en tubos estériles a razón de 2 ml por tubo y agregarles 50 ul de la solución de azúcares (20%) a probar. 2- Con un cultivo de 24 -72 hs de la cepa en estudio preparar una suspensión con turbidez equivalente al tubo Nº1 de Mac Farland. 3- Sembrar 100 ul de la suspensión de levadura en cada tubo. 4- Incubar a 28ºC durante 48 -72 hs (en caso de no haber desarrollo conservar hasta 14 días con observaciones periódicas). b. Prueba de utilización de NO3K (Auxonograma de sustancias nitrogenadas): Mediante esta prueba se ensaya la capacidad de asimilar

Glosario:

 ARTROCONIDIA: esporo asexual formado por la desarticulación del micelio.  ASCO: estructura como un saco que contiene (habitualmente ocho) ascosporos desarrollados durante la reproducción sexual.  ASCOMYCOTA: gran división de hongos superiores que se distinguen por hifas tabicadas y por esporos sexuales formados en ascos o sacos de esporos.  ASCOSPORO: esporo sexual característico de ascomycota, producido en una estructura como un saco conocido como asco, después de la unión de dos núcleos.  BASIDIO: célula especializada con forma de palo de golf de los Basidiomycota en la cual se originan los basidiosporos exógenos.  BASIDIOMYCOTA: gran división de hongos que se distinguen por hifas tabicadas, a menudo grandes, con frutos y esporos que nacen en un característico basidio de forma de clava.  BASIDIOSPORO: esporo sexual característico de los basidiomycota, producido después de la unión de los núcleos en una estructura especializada con forma de palo de golf conocida como basidio.  BLASTOCONIDIA: esporo producido por un proceso de gemación a lo largo del micelio o por un esporo único.  CLAMIDOSPORA: elemento de resistencia formada por la diferenciación directa del micelio, con pared celular gruesa y citoplasma concentrado.

 RUGOSO: arrugado o plegado.  SAPROFITO: cualquier microorganismo vegetal que obtiene su nutrición de materia orgánica muerta.  SESIL: adherido directamente por la base, sin un pedículo.  SEUDOHIFA: hifa no verdadera; habitualmente se refiere a blastoconidias elongadas formadas por levaduras con brotes.  SEUDOMICELIO: grupos dispuestos en cadena unidos de células formadas por gemación que cuando son elongadas, se parecen a hifas miceliales.  TABICADO: dividido por paredes transversales.  TALOSPORO: esporo derivado de una célula vegetativa del tallo.  TALO: cuerpo del hongo.  VEGETATIVO: referido a hifas que se extienden hacia el sustrato que constituyen la porción que absorbe alimentos de un hongo.  ZYGOSPORO: esporo sexual de pared gruesa producido por fusión de dos gametos similares.