PRÀCTIQUES DE MICROBIOLOGIA
GRAU DE VETERINÀRIA
DEPARTAMENT DE SANITAT I D’ANATOMIA ANIMALS
FACULTAT DE VETERINÀRIA
U.A.B.
F. Javier Cabañes Saenz
M. Rosa Bragulat Ararà
M. Lourdes Abarca Salat
Gemma Castellá Gómez
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Orientación Universidad
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Busca documentos
Prepara tus exámenes con los documentos que comparten otros estudiantes como tú en Docsity
Busca tu universidad
Encuentra los documentos específicos para los exámenes de tu universidad
Video Cursos
Estudia con lecciones y exámenes resueltos basados en los programas académicos de las mejores universidades
Quiz
Responde a preguntas de exámenes reales y pon a prueba tu preparación
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Comunidad
Pregúntale a la comunidad
Pide ayuda a la comunidad y resuelve tus dudas de estudio
Ebooks gratuitos
¡Nuestros e-books salva-estudiantes!
Descarga nuestras guías gratuitas sobre técnicas de estudio, métodos para controlar la ansiedad y consejos para la tesis preparadas por los tutores de Docsity
Asignatura: microbiologia, Profesor: , Carrera: Veterinària, Universidad: UAB
Tipo: Ejercicios
2014/2015
1 / 63
Esta página no es visible en la vista previa
¡No te pierdas las partes importantes!
Vista previa parcial del texto
¡Descarga Micro practiques y más Ejercicios en PDF de Microbiología solo en Docsity!
PRÀCTIQUES DE MICROBIOLOGIA
GRAU DE VETERINÀRIA
DEPARTAMENT DE SANITAT I D’ANATOMIA ANIMALS
FACULTAT DE VETERINÀRIA
U.A.B.
F. Javier Cabañes Saenz
M. Rosa Bragulat Ararà
M. Lourdes Abarca Salat
Gemma Castellá Gómez
PRÀCTICA 1
Tècniques d’asèpsia Microscopi òptic compost. Funcionament. Tècniques d'observació dels microorganismes.
Tècniques d’asèpsia.
Tenint en compte l’explicació de l’ Annex II (Introducció al laboratori de Microbiologia) , haurem de manipular els cultius, les preparacions i els estris de forma adequada.
- Esterilitzar la nansa de nicrom que farem servir per agafar part del cultiu que hi ha en el tub. Tornar-la a esterilitzar un cop hem acabat de fer la preparació.
- Flamejar la boca del tub després de treure el tap i abans de tornar-lo a tapar.
- Evitar la contaminació.
Microscopi òptic compost.
Hem de recordar que per enfocar es comença amb petits augments i finalment s’utilitza l’objectiu d’immersió (afegir una gota d’oli d’immersió).
L’enfocament es fa sempre per allunyament de la preparació respecte l’objectiu (protecció de les lents).
Capçal
Braç
Desplaçament platina
Macromètric
Micromètric
Condensador
Oculars
Revòlver
Objectius
Platina
Focus
Base
PRÀCTICA 2
A. Recompte i detecció dels microorganismes d'una mostra de pinso B. Aïllament dels microorganismes presents en una mostra de llet C. Tècnica de l’antibiograma D. Efecte de la pressió osmòtica sobre els microorganismes E. Efecte de la radiació ultraviolada sobre els microorganismes F. Aïllament de mutants resistents a un antibiòtic ESQUEMA de treball diari
- Per realitzar aquesta pràctica és imprescindible la lectura dels Annexes II, III i IV
A. Recompte i detecció dels microorganismes d'una mostra de pinso.
Utilitzar les explicacions corresponents de l’apartat: Medis de cultiu, tècniques de sembra i incubació dels microorganismes.
A.1. Recompte de microorganismes (bacteris i fongs) d’una mostra de pinso (UNITATS FORMADORES DE COLÒNIES: UFC).
A.1.1. Preparació de la mostra. Obtenció del banc de dilucions decimals.
- A partir d'una mostra homogeneïtzada, es prepara la suspensió mare 10-1^ amb 10 g en 90 ml de sèrum fisiològic estèril ( o bé 1 g en 9 ml de sèrum fisiològic estèril).
- Amb una pipeta estèril o micropipeta amb puntes estèrils s'agafen 0.1 ml de la dilució 10- i es passen a un tub amb 9.9 ml de diluent, obtenint així la dilució 10-3^ (Si agafem 1 ml de la dilució 10-1^ i es passa a un tub amb 9 ml de diluent, s'obtindria la dilució 10-2).
- Agafar 0.1 ml de la dilució 10-3^ i passar-lo a un tub amb 9.9 ml de diluent, obtenint així la dilució 10-5.
- Agafar 0.1 ml de la dilució 10-5^ i passar-lo a un tub amb 9.9 ml de diluent, obtenint així la dilució 10-7.
A. 1.2. Sembra de les dilucions
- Es realitzarà la sembra en superfície en els medis de cultiu adients, dipositant 0.1 ml de cada una de les dilucions a sembrar en 3 o 5 plaques.
- Amb la nansa de Digralsky esterilitzada per flamejat amb alcohol s’extendran els 0.1 ml uniformement per la superfície del medi de cultiu.
Per fer el recompte de bacteris, s'utilitzen medis de cultiu generals com el TSA ("Triptic Soy Agar" Agar tripticasa soja) o el PCA ("Plate Count Agar" Agar per a recompte en placa).
Per fer el recompte de fongs miceliars i llevats s'utilitza normalment l'agar glucosat de Sabouraud amb antibiòtic/s (normalment cloramfenicol, o penicil·lina més estreptomicina). L'antibiòtic s' afegeix per inhibir el creixement dels bacteris presents a la mostra.
A.1.3.Incubació
- Un cop sembrades les plaques, es col·loquen a l'estufa en posició invertida per tal que l'aigua de condensació del medi de cultiu no caigui sobre el medi i dificulti el recompte.
Pels bacteris, les plaques s'incuben a 37ºC durant 24 - 48 hores Pels fongs, la incubació es realitza a 25-28ºC durant 3 - 7 dies.
A.1.4. Lectura: Recompte d'UFC
- Passat el temps d'incubació es compten les colònies que s'han desenvolupat en cada placa i es selecciona aquella dilució en la que el nombre d'UFC/placa estigui entre 30 i 300 en el cas dels bacteris, i entre 10 i 100 en el cas dels fongs.
- Tenint en compte el factor de dilució i l'inòcul sembrat en cada placa, es calcularà el nombre de microorganismes viables per unitat de mostra, que expressarem com a UFC/g o UFC/ml.
Resultats obtinguts en la mostra:
Recompte de bacteris. Càlculs :
Resultat: ..................... UFC/g de pinso
Recompte de fongs. Càlculs:
Resultat: ..................... UFC/g de pinso
B. Aïllament dels microorganismes presents en una mostra de llet
B.1. Observació directa de la mostra
- Fer una tinció de Gram de la mostra de llet.
- Descriure els diferents tipus dels microorganismes que s'observen:
B.2. Aïllament dels microorganismes presents a la mostra
- Sembra en una placa de TSA.
- Incubar la placa a 37ºC durant 24 hores.
B.2.1. Observació de les colònies desenvolupades en el medi
En un medi sòlid , es podran observar les següents característiques de les colònies:
- Forma : circular, irregular, filamentosa, etc.
- Mida : Es mesurarà el diàmetre de les colònies en mm. Quan el diàmetre és inferior a 1 mm, s'anomenen colònies puntiformes.
- Pigmentació o cromogènesi : Considerarem la presència o absència de pigmentació de les colònies. En alguns casos, el pigment pot difondre en el medi de cultiu.
- Opacitat : Transparents, opaques
- Elevació : Planes, elevades, etc.
- Superfície : llisa, rugosa, brillant, mate, etc.
- Marges o cantell de la colònia : sencer, dentat, lobulat, filamentós, etc.
- Consistència de la colònia : viscosa, seca, mantegosa, etc. Aquesta característica es determina tocant la colònia amb la nansa de Nicrom estèril.
**- Seleccionar i descriure els diferents tipus de colònies desenvolupades en el medi de cultiu.
- Fer una tinció de Gram de cada colònia diferent** (utilitzar només una petita part de la colònia) - Descriure els diferents microorganismes que s'observen a cadascuna de les tincions.
B.2.2. Aïllar cadascun dels diferents bacteris observats.
B.2.3. Determinar si s'han aconseguit cultius axènics.
- Observacions:
- Emmagatzemament inadequat dels disquets d'antibiòtics o de les plaques de medi de cultiu.
- No haver estandarditzat la densitat de l'inòcul.
- Incubació perllongada o a una temperatura inadequada.
- No utilitzar cultius axènics.
- Aplicació de la tècnica per microorganismes de creixement lent i/o microorganismes anaerobis.
- No realitzar cada cert temps un control de qualitat.
- etc.
C.1. Realitzar un antibiograma a partir d'un cultiu axènic.
C.2. Lectura i interpretació dels resultats obtinguts:
D. Efecte de la pressió osmòtica sobre el creixement de microorganismes
D.1. A partir dels cultius de Escherichia coli , Staphylococcus aureus i Saccharomyces cerevisiae sembrar 4 plaques de TSA que tenen diferents concentracions de NaCl (de 0,5% a 20%) i 4 plaques de TSA amb diferents concentracions de sacarosa (de 0% a 50%).
- Retolar les plaques amb el vostre nom i el nom del microorganisme.
- Sembrar totes les plaques mitjançant la tècnica per esgotament.
- Incubar a 37ºC durant 24-48 h.
- Lectura: Observar i anotar el creixement a les diferents concentracions de NaCl i sacarosa.
E.coli S. aureus S. cerevisiae
0,5% NaCl
10% NaCl
15% NaCl
20% NaCl
0% Sacarosa
10% Sacarosa
25% Sacarosa
50% Sacarosa
- Observar si hi ha variacions morfològiques en augmentar la pressió osmòtica.
E.4.4. Com afecta la radiació als formadors d'espores i als pigmentats?
E.4.5. Examinar les plaques fotoreactivades.
E.4.6. Comparar les plaques fotoreactivades amb les no fotoreactivades. Explicar el fenomen que s'observa.
E.4.7. Examinar les colònies per veure si hi ha mutació. Es veuen colònies diferents a les del control? Descriure-les.
F. Aïllament de mutants resistents a un antibiòtic
F.1. Sembrar Staphylococcus aureus en TSB.
F.2. Incubar a 37ºC durant 24 h.
F.3. Centrifugar el cultiu líquid a 4000 rpm durant 20 minuts. Decantar el sobrenedant. Inocular 100 μl sobre una placa de TSA amb antibiòtic (200 μg/ml d'estreptomicina) i 100 μl del sediment sobre una placa de Petri que contingui TSA.
F.4. Incubar a 37ºC durant 24 h.
F.5. Lectura
**- Observar si hi ha colònies mutants.
- Descriure la seva morfologia.**
F.6. Confirmació
F.6.1. Agafar un placa de TSA addicionat d'antibiòtic i dividir-la en dues parts.
F.6.2. En una de les parts, sembrar una colònia qualsevol que hagi crescut a la placa de TSA.
F.6.3. En l'altra part de la placa, sembrar una colònia mutant.
F.6.4. Incubar a 37ºC durant 24 h.
F.6.5. Lectura de la placa
PRÀCTICA 3. ESTUDI DE LA MICROBIOTA DEL CONDUCTE AUDITIU
EXTERN DE L’ANIMAL SA
Objectiu: estudiar la microbiota del conducte auditiu extern d’animals sans.
1. Recollida de la mostra En primer lloc caldrà realitzar la correcta presa de mostra. Cal posar-se guants i immobilitzar l’animal de forma adequada per tal d’impedir que l’animal o nosaltres prenguem mal. En el cas del gos, caldrà posar-li el morrió, mentre que en el cas de l’ovella i la cabra caldrà subjectar-les amb la palanca immobilitzadora del tancat mecànic. Un cop tenim l’animal ben subjectat, introduïm un hisop estèril a dins del conducte auditiu, fins a l’alçada del terç superior del canal auditiu, no fins el fons (veure esquema de l’oïda, Annex V ). Recollim l’exsudat auditiu (cerumen) realitzant un suau fregament de l’epiteli. Un cop recollida la mostra, es torna a posar l’hisop al seu tub de transport. Ràpidament processarem la mostra al laboratori. 2. Processament de la mostra al laboratori Caldrà sembrar una placa de medi Agar sang i una placa de medi MacConkey amb la tècnica per esgotament. Un cop s’han sembrat les plaques, s’incubaran a 37ºC durant 24-48 h en l’estufa de CO 2 (5%).
A més a més, es faran dos frotis en porta per tal de fer la tinció de Gram i la tinció de Diff-Quik ( Annex III ). Un cop fetes les tincions es procedirà a la seva observació al microscopi.
- Observació directa T. Gram:
- **Observació directa T. Diff-Quik:
- Lectura de les plaques** Caldrà quantificar i descriure macroscòpica i microscòpicament cadascun dels diferents tipus de colònies que creixen en ambdós medis de cultiu.
Agar Sang:
MacConkey:
4. Diferència entre els microorganismes detectats a l’observació directa i al cultiu.
PRÀCTICA 4. IDENTIFICACIÓ MICROBIANA
A. Identificació bacteriana B. Identificació fúngica
A. Identificació bacteriana
La identificació bacteriana és el procés pel qual es determina la inclusió dels nous aïllaments dins dels grups taxonòmics establerts. Per identificar una soca desconeguda, cal caracteritzar-la tant com sigui possible i comparar els seus caràcters amb els dels bacteris coneguts, classificats i amb nom.
En aquesta pràctica treballarem amb tècniques de bacteriologia que s’utilitzen rutinàriament en els laboratoris de diagnòstic microbiològic. Veurem dues formes d’utilitzar aquestes tècniques: mètodes convencionals i micromètodes. En l’ Annex VI hi ha el fonament i la interpretació de les proves bioquímiques i les taules d’identificació que necessiteu per aquesta pràctica.
Fins fa només uns pocs anys les característiques morfològiques, les tincions diferencials, les proves bioquímiques i algunes proves serològiques eren les principals eines d’identificació disponibles. Les proves basades en l’anàlisi del DNA eren utilitzades fonamentalment en recerca i per la classificació dels microorganismes, degut a la seva complexitat tecnològica i els seus costos. Amb l’abaratiment de les tècniques de seqüenciació del DNA, cada dia s’estan utilitzant més aquestes tècniques moleculars per la identificació dels microorganismes (veure Annex VII ).
Abans de començar a realitzar l’estudi de qualsevol microorganisme, és fonamental que el tinguem en cultiu pur i, a més a més, un cultiu jove. Un cop ho hem comprovat, es sembraran les proves bioquímiques necessàries i/o s’utilitzarà el micromètode més adient.