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10. MICROSCOPIA
• INTRODUCCIÓN:
En la cultura griega y egipcia, en esta última menos, hay evidencias de que empleaban ya instrumentos ópticos, lupas, lentes, utilizando para ello frascos.
- ARISTÓFANES: escritor griego que habla de una lente que enfoca los rayos para encender o prender algo. Se basa en Aristóteles y en el espejo con el que pretendía derribar este a las tropas enemigas. Existen en esta época diferentes discusiones filosóficas sobre la luz o temas condicionados por nuestro sistema óptico, como por ejemplo el mito de la caverna.
- PLINIO: científico discípulo de Nerón, el cual describe todos los fenómenos naturales en su obra Sistema naturalis. En este libro también se hace mención a una serie de pequeños cristales que modifican la visión.
- AL HAZEN: estudió los ojos (en concreto los nervios), realizó la descripción de las lentes y habla sobre la refracción de la luz.
En la Edad Media, se realizaba todo con velas, se empleaba cuarzo como lentes.
- SALVINO: creó gafas.
- En los siglos XV, XVI y XVII se realizaron los primeros telescopios para ver fenómenos estelares. El más destacable es Galileo quien elabora un microscopio muy simple.
- S.VII, destaca KIRCHER, quien escribe el libre microscopilum, es decir, un catálogo de microscopios que había en su época.
- HOOKE: escribe micrografía en el cual aparece una descripción de sus experimentos con su microscopio.
- LEEUWENHOEK: se encargará de realizar lentes con resolución.
- Zeiss (industrial), Abbe (físico que realiza la teoría de como la resolución del microscopio) y Shott, se reúnen en el siglo XIX y XX con el fin de mejorar la calidad de las lentes.
- Siglo XX: se desarrolla el microscopio electrónico de ultra micrótomo y el de barrido. En 1986, se llevaron el Premio Nobel, por la invención del efecto túnel.
- PODER RESOLUCIÓN:
- Capacidad del microscopio para presentar como separado dos objetos próximos. Distancia mínima que puede resolver, solo si la resolución del aparato es mayor.
- TEORIA DE ABBE
La resolución delta depende de la longitud de la onda independientemente de la onda o del objetivo. Cuanto más corta sea landa mas pequeño será el delta, y por tanto mayor la resolución. El denominador es la apertura numérica. Depende del índice de refracción de la lente y del tamaño de la lente. Depende de la luz que usemos y
variando la longitud de onda tendremos mas o menos definición. Intentaremos utilizar luz monocromática con longitud de onda muy corta (azul o violeta.)
Dependen del material y de la curvatura. Las convenxas dan un punto focal determinado por la curvatura de la lente. Las cóncavas dispersan rayos paralelos. Utilizaremos lentes convenxas para los microscopios. Según la relación entre la distancia a la imagen y la pantalla de proyeccion o el observador, obtendremos distintos tipos de imágenes. Tenemos lentes biconvexas, que son simétricas o no. Encontramos:
- PROBLEMAS MICROSCOPIO:
- ABERRACIONES:
Defecto en la imagen producido por un defecto en la lente que lo forma. Dependen, por tanto, del cristal. Depende de:
El material: son las aberraciones cromáticas que se producen cuando una lente no está pulida por igual o contiene índices refractarios diferentes, es decir tienen índices refractarios diferentes qye generan imágenes borrosas o cambios de colores. Hay lentes que evitan esto con fluorita.
La forma: aberración esférica. Se debe a que el cristal no está muy nítido debido a su pulido, y presenta una curvatura igual.
Produce diferentes planos focales.
- DISTORSIÓN
- TIPOS DE MICROSCOPIO:
- CAMPO CLARO
Permite una observación directa ampliada de la muestra. Se visualiza según las diferencias de absorción, es decir, en los cambios en la longitud de onda (objetos de amplitud)
Uso: el más sencillo y utilizado. Permite ver colores originales y tinciones histológicas. Se pueden incluir filtros para aumentar el contraste.
Desdobla los haces de luz en una polarización perpendicular, pasando por la muestra y uniendo los dos haces de luz, el cual pasa por un filtro que elimina otros planos de luz.
Se basa en la birrefringencia, consecuencia de la organización de algunas moléculas. La función es sencilla, se utiliza un filtro de polarización, el material que desdobla el haz de luz. El filtro es similar al que está en el micro de birrefringencia, y con el principio de la suma y sustracción de las ondas tenemos mayor o menor intensidad. Se emplea estructuras moleculares largas, paralelas o apiladas, con una orientación (células musculares, colas de espermatozoides, cloroplastos, bastones, cadenas de ADN, huso mitótico).
Basado en la absorción de luz por un fluoróforo (o fluorocromo) y su emisión en otra longitud de onda. La tinción con fluorescencia, absorbe luz de una frecuencia de onda corta, absorbiendo parte de la energía y emitiendo luz en una onda más larga. Algunas de estas sustancias son fluorescentes y se pueden ver, otras no son fluorescentes pero se pueden usar marcajes.
Se emplea en la detección de cantidades mínimas de algún material (anticuerpos (Se genera un anticuerpo primario que se une a lo que se quiere, y después anticuerpos secundarios que se unen a ese primario) histonas, actina, miosina); visualización de componentes de difícil observación y determinación de su orientación (ácidos nucleicos); detección de anomalías (bandas cromosómicas).
Utiliza distintas técnicas. La base es un micro de fluorescencia que utiliza una eliminación monocromática de un láser de alta intensidad, haciendo un barrido de muestra, eliminando los puntos fuera de foco y se procesan después por ordenador. Se toman distintos planos y se puede obtener una imagen tridimensional. Es lo máximo en resolución y nitidez. Si se utiliza luz de onda corta obtendremos una imagen con más resolución. En los años 30 se inventó un medio en el que se utilizaban electrones en vez de fotones. Así se obtiene 1000 veces más resolución que un microscopio óptico. Hay micro electrónico de barrido y de transmisión. El primero es como el de campo oscuro, y el segundo se corresponde con el de campo claro.
- MET (MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN)
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MET:
La preparación de las muestras en un MET son los mismos pasos que en el de microscopio óptico. Para fijarlo se usan otras sustancias, las muestras deben ser finas y deben estar más endurecidas. Normalmente se usan resinas monoméricas, no se pueden usar ceras como parafinas. Para producir secciones finas se usa un ultramicrotomo. Se hace un sombreado con un vapor de metal, se produce una réplica, se disuelve el tejido biológico y lo que observa es la réplica. Las tinciones son también similares, no se utilizan colores sino una sustitución de material biológico con metales pesados, yoduro de cadmio o acetato. Se bañan las muestras con estos metales, con estructura que absorben el metal. Se obtiene una especie de negativo que será lo que observaremos al retirar el material biológico. Se puede hacer un marcaje específico para el estudio de un anticuerpo bajo un, pero con la diferencia de que en lugar de cromoforos se utilizan metales. Estos se adhieren a la estructura a estudiar pudiendo ser observados.
