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1 Charo Crespo IES MORATALAZ
EL MICROSCOPIO
La palabra microscopio deriva de dos vocablos griegos: micro (pequeño) y scopein (ver). Un microscopio es todo instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o un ser pequeño.
HISTORIA
La invención del microscopio fue realizada, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, según la opinión de los holandeses. Otros investigadores relevantes en el desarrollo del microscopio fueron el médico italiano Marcello Malpighi y el comerciante holandés Antony van Leenwenhoek.
INTRODUCCIÓN
El microscopio es el instrumento común de aumento del laboratorio clínico. En función de la fuente utilizada, podemos distinguir dos tipos:
- Ópticos
- Electrónicos Los ópticos son muy utilizados en el laboratorio clínico para la observación de células, microorganismos, cristales, reacciones inmunológicas, etc.; por lo tanto vemos que se utiliza tanto en hematología, microbiología, bioquímica e inmunología.
FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA
Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ángulo visual y éste parece ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto, éste no se ve con claridad. Este límite se debe a la capacidad máxima de deformación del cristalino. Si se sitúa entre el ojo y el objeto un sistema óptico capaz de aumentar el ángulo visual, se podrá ver el objeto con mayor amplitud y claridad.
PARAMETROS OPTICOS
1. Aumento Es el número de veces que se ve el tamaño de un objeto por encima de su valor real. En el microscopio compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Se reseña mediante un número seguido del signo “por” (x). 2. Poder de resolución Es la distancia mínima entre dos puntos que puede distinguirse en el microscopio y depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de una propiedad óptica de las lentes (objetivo) denominada apertura numérica. Ambos factores vienen relacionados por la expresión:
λ λ Límite de resolución (d) = ------------- = -------------------- , donde
- AN 2. IR. sen α
λ - longitud de onda de la luz utilizada. AN - Apertura numérica, que consiste en la capacidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectada hacia ella. IR - Índice de refracción del medio (aire o aceite) entre la muestra y la lente. IR (^) aire = 1 IRaceite > α – La mitad del ángulo de luz que penetra en la lente (objetivo)
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AN límite de resolución poder de resolución
Para una longitud de onda constante, al aumentar la apertura numérica, disminuirá el límite de resolución y aumentará el poder de resolución (capacidad del microscopio para revelar detalles adyacentes a un objeto). Hay tres formas para disminuir la distancia resoluble o lo que es lo mismo, para aumentar el poder de resolución de un microscopio:
- Disminuir la longitud de onda de la luz empleada.
- Aumentar el ángulo de luz que penetra en la lente (objetivo).
- Aumentar el índice de refracción entre la muestra y el objetivo, ya que hace que se pierdan menos rayos de luz entre el condensador y el portaobjetos. 3. Profundidad de foco Es el espesor del objeto estudiado que se aprecia enfocando. Es inversamente proporcional al aumento y a la AN de la lente. 4. Contraste Es la diferencia en la absorción de luz entre el objeto estudiado y el medio que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tinción.
PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Elementos de sustentación Base o pie. Brazo. Porta-oculares. Revólver portaobjetivos. Platina porta-preparaciones con tornillos para desplazamiento antero-posterior y lateral. Se registra en dos escalas móviles para ver la posición exacta de la preparación. 2. Elementos ópticos y relacionados Ocular (10x) con anillo de ajuste. Objetivos (van provistos de los objetivos de 100x, 40x, 10x y 4x habitualmente). Condensador, está entre la fuente luminosa y la platina. Concentra la luz de la lámpara hacia la preparación. Diafragma. Más cerrado mejora el contraste y empeora la resolución. Tornillo macrométrico o avance rápido. De enfoque. Tornillo micrométrico o avance lento. De enfoque. 3. Fuente de iluminación Mando de encendido y apagado. Lámpara de luz visible. Regulador de intensidad luminosa.
Cono de luz que entra en el objetivo
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DESCRIPCIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UN MICROSCOPIO
El sistema óptico de un microscopio se compone de: objetivos, oculares, condensador y diafragma.
1. Objetivos Son sistemas de lentes que generan una imagen real, invertida y aumentada del objeto. Los de mayor aumento poseen un sistema de amortiguación que dificulta su rotura al chocar con la preparación. Tienen dibujado un anillo coloreado que indica su número de aumentos Los objetivos se clasifican:
- Objetivos secos : Se utilizan directamente y lo único que se interpone entre la lente y el objeto es el aire. Los más utilizados son: x4, x10 y x40.
- Objetivos de inmersión (x100): necesitan un líquido entre la lente y el objeto; que suele ser el aceite de cedro, que posee un índice de refracción igual que el del vidrio. 2. Oculares Los oculares son lentes que amplían más la imagen formada por el objetivo. Su amplificación es constante, de forma que cuanto mayor es la distancia entre el objetivo y el ocular (longitud óptica del tubo) mayor es la amplificación. Los primeros microscopios eran monoculares, pero en la actualidad la mayoría de los utilizados son binoculares, lo cual requiere un sistema de prismas que desdoblen los rayos luminosos. 3. Condensadores Concentran la luz sobre el objeto situado en la platina del microscopio. Su posición será baja para objetivos de poco aumento (x10), media para objetivo de x40 y alta para objetivo de x100. 4. Diafragma Los condensadores generalmente llevan acoplado un diafragma, que es un dispositivo ajustable que regula el cono de la luz que pasa a través del objeto y unos filtros. Cuanto más se cierra, más mejora el contraste y más empeore la resolución del microscopio.
MATERIAL NECESARIO PARA LA VISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA
1. Portaobjetos o porta Es una lámina de vidrio que sirve de soporte para la muestra. 2. Cubreobjetos o cubre Es una lámina muy fina de vidrio que sirve para cubrir la muestra. El cubre suele utilizarse siempre, pero puede no emplearse con el objetivo de inmersión.
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3. Líquido o aceite de inmersión Los aceites sintéticos son mejores que los de cedro porque no se secan tan fácilmente Su empleo es imprescindible cuando se observa una muestra desecada con el objetivo de inmersión.
MANEJO DEL MICROSCOPIO
1- Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. 2- Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 3- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 4- Comenzar la observación con el objetivo de 10x o el de 40x. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 6- Empleo del objetivo de inmersión: a) Bajar totalmente la platina. b) Subir totalmente el condensador y abrir el diafragma para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c) Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión, dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. d) Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e) Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. f) Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g) Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x, por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h) Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i) Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
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Microscopio de campo oscuro: Consta de un condensador especial, con un disco opaco, que debe estar muy cercano a la preparación, y que lanza un cono hueco de luz, cuyo punto vértice (o focal) es el plano de la muestra. Debido a este tipo especial de iluminación, si la muestra es totalmente transparente y homogénea, la luz la atraviesa y no entra en el objetivo. Sin embargo, si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un índice de refracción diferente al del medio que los circunda, la luz es refractada por ellos e incide sobre el objetivo, por lo que pueden ser visualizados. Con esta iluminación, el campo microscópico se ve como un fondo oscuro en el que resalta el elemento que se estudia. Permite la observación de seres microscópicos transparentes y no teñidos que, a causa de su bajo contraste son escasamente percibidos con la iluminación de campo claro. Este es el caso, por ejemplo, del Treponema pallidum en una preparación en fresco.
Microscopio de contraste de fases: El índice de refracción de los distintos elementos que están presentes en la muestra provoca diferentes alteraciones en la fase de onda de los rayos de iluminación, pero estas alteraciones no son percibidas por el ojo humano. En este microscopio se sitúa un diafragma anular en el plano focal del condensador. Este diafragma especial proyecta hacia la muestra un haz de luz
Treponema palidum en microscopio campo oscuro
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anular, que al interaccionar con los elementos de la muestra se produce difracción de los rayos. Estos rayos son recogidos por el objetivo y proyectados, a su vez, en el plano focal posterior a éste, donde se coloca un anillo de fase que produce un desfase entre la luz difractada y la no difractada que se aprecia por una diferente luminosidad que ayuda a hacer visibles elementos que de otra forma no lo son. Este microscopio facilita, por lo tanto, el estudio de objetos transparentes y no coloreados, por ejemplo, los encontrados en un sedimento de orina.
Microscopio de luz polarizada Un polarizador limita a un solo plano las ondas de la luz, obteniéndose la luz polarizada. Si se colocan dos polarizadores girados 90º uno con respecto al otro, la luz se extinguiría, ya que el primero deja pasar sólo la luz en un plano y el segundo la eliminaría. Si se coloca la muestra entre los dos polarizadores, los elementos cristalinos descruzan el plano de los rayos luminosos y se observan los cristales como estructuras brillantes que resaltan sobre el fondo oscuro creado por los dos polarizadores. Con este método se obtienen imágenes de colores vivos y es posible percibir características en la estructura y composición de los elementos cristalinos. Este microscopio sirve, por ejemplo, para identificar las distintas sustancias cristalinas que pueden estar presentes en un sedimento urinario.
Microscopio de fluorescencia La fluorescencia es la propiedad que tienen ciertas sustancias de emitir, cuando son iluminadas por una radiación de corta longitud de onda, otra radiación de longitud de onda mayor. Así pues, si la luz incidente es ultravioleta (invisible), la sustancia flluorescente se excita y emite una radiación visible de color característico.
Esquema de microscopio de contraste de fases
Imagen de cristales en el microscopio de luz polarizada (dcha)
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Microscopio de luz polarizada Microscopio de fluorescencia
Microscopia confocal En la última década, se han desarrollado procedimientos que permiten incrementar significativamente la resolución del microscopio óptico. Minski, en 1961, propuso un nuevo tipo de microscopio para la observación de especímenes vivos con un alto contraste y mejor resolución, comparable únicamente a la que se obtenía anteriormente con microscopios electrónicos de barrido a bajo aumento o después de complejos procesos de análisis digital de imágenes.
Se hace pasar la luz que incide sobre la muestra por un pequeño agujero o ranura ( pinhole ) y se enfoca en el plano de la imagen de un objetivo de gran apertura numérica. De esta manera, la luz que es reflejada por el punto que se encuentra en el plano focal del objetivo, regresa al mismo y es reenfocada y transmitida a su vez por un pequeño agujero o ranura ( pinhole ) sin ninguna pérdida. En cambio, la luz dispersada o emitida por los puntos que se encuentran fuera del plano de la imagen es atenuada o bloqueada completamente. De esta manera, se obtiene una imagen de alto contraste y definición de un punto en el
OCULARES
FILTRO DE BARRERA
MUESTRA
EXCITACIÓN^ FILTRO DE
FUENTE LUMINOSA
Luz fluorescente
Luz fluor Luz ultravioletaescente
Luz ultravioleta
Luz desde infrarroja hasta ultravioleta
OCULARES
ANALIZADOR
MUESTRA
FUENTE LUMINOSA
Esquema de funcionamiento del microscopio de fluorescencia
CONDENSADOR POLARIZADOR-
Esquema de la posición de las lentes, con respecto a la muestra, en el microscopio de polarización
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plano focal, sin que haya una contribución significativa de las regiones que se encuentran fuera de foco.
Debido a que las aperturas, tanto de la iluminación como del retorno de la imagen, tienen un foco común, se ha denominado este tipo de microscopios como "microscopio confocal". Puede resumirse su función diciendo que la microscopía confocal se basa en mejorar la relación entre la señal y el ruido de la imagen.
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ANEXO
La difracción es un fenómeno que consiste en la desviación que experimenta una onda cuando encuentra un obstáculo en su camino. La refracción es el cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio material a otro. Sólo se produce si la onda incide oblicuamente sobre la superficie de separación de los dos medios y si estos tienen índices de refracción distintos. La refracción se origina en el cambio de velocidad de propagación de la onda. La reflexión es el cambio de dirección de un rayo o una onda que ocurre en la superficie de separación entre dos medios, de tal forma que regresa al medio inicial. Ejemplos comunes son la reflexión de la luz, el sonido y las ondas en el agua.
Bibliografía
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Autores: Faustina Rubio, Benjamín García y Manuel Carrasco Editorial Paraninfo, 2004
Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos
Autores: María García, Enrique Gutiérrez, y Eduardo Martínez Editorial Editex, 2002
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Autor: J. Muñoz Editorial Masson, 2005
Laboratorio clínico. Principios generales
Autor: Santiago Prieto Editorial Mac Graw Hill
Imágenes internet
