power explicación genoteques, Diapositivas de Biología Molecular

¡Descarga power explicación genoteques y más Diapositivas en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!

OBTENCIÓ DE GENS O

FRAGMENTS DE DNA PER CLONAR

TEMA 6

GENOTEQUES

Col·lecció de clons cada un dels quals conté un vector al

qual se li ha inserit un fragment de DNA d'interès

Tipus de

genotequ

es

GENOTEQUES GENÒMIQUES  Es construiran en

els casos en els què ens interessen regions

reguladores i hem d’assegurar-nos que no hi hagi

contaminacions.

GENOTEQUES DE cDNA  Es construiran quan per

exemple busquem un gen eucariota ja que ens

interessa partir del mRNA que expressi el gen que

ens interessa clonar

Depenent de quin

fragment volem clonar i

depenent del que

busquem

UTILITAT  Trobar gens que no coneixem en un clon i clonar-lo

1. GENOTEQUES GENÒMIQUES

Provenen de DNA

genòmic

• (^) El % de DNA codificant només és el

1,5%. La resta de DNA segur que no é

el nostre gen

• (^) Hi ha la presència d’introns
• (^) Serà bo quan vulguem trobar la seq.

De tot el genoma ja que conté tota la

informació

Fraccionament del DNA

genòmic

Fragments en diferents

vectors

DNA desordenat

Digestions

parcials per

saber l’ordre

correcte i

reconstruir la

seqüència

Digestions parcials

• (^) S’utilitza (normalment) un sol enzim de restricció ja que hi ha

múltiples dianes

• (^) Ens hem de quedar amb la mida òptima perquè pugui

transformar  No perdre informació del genoma

En les digestions parcials, els enzims de restricció tallen de manera

que es generen diferents fragments amb trossos de la seqüència

iguals. D’aquesta manera es solaparan les seqüències i el genoma

podrà ser ordenat gràcies a aquestes coincidències en les

seqüències.

Després de les digestions parcials es fa una etapa de centrifugació

per eliminar els fragments del genoma massa llargs o massa curts

(els vectors no accepten qualsevol mida de DNA)

Es treuen les seqüències repetides en els

diferents fragments. S’ha de vigilar en

no perdre informació

S’introdueix en gel d’agarosa i s’observa el

tros que concorda amb el PM que ens

interessa per el vector

2. GENOTEQUES DE CDNA

Molèc. de DNA no genòmic i sense

introns

( molèc. que només conté la seq.

del gen d’interès)

A partir de mRNA com a cadena

motlle

cDNA

• (^) Expressar una determinada proteïna

Ens interessa

• (^) Clonar gens eucariotes

Necessitem aïllar el

mRNA d’una cèl·lula

que estigui

expressant el gen

Amb transcriptasa inversa

Passos

1. Eliminar totes les proteïnes per tal que no interfereixin
2. Cromatografia amb oligodT per aïllar el mRNA d’interès  obtenim un híbrid DNA:RNA

És monocatenari i poc estable per tant, el

transformem en cDNA

Transformació de mRNA monocatenari a cDNA

bicatenari

mRNA

cDNA

monocatenari

complementari al

segment de

mRNA

Transcripta

sa

inversa

Síntesi de la

segona cadena

complementaria

de cDNA

sscDNA

cDNA

bicatenari

Primera cadena

Segona cadena

Mètode random primer

Consisteix en utilitzar un conjunt d’encebadors que reprodueixen

qualsevol seqüència que trobin a la cèl·lula

1. Barregem aquests encebadors amb els mRNA  s’unirà un o varis a la cadena de mRNA i

hibridaran (s’uniran)

2. Afegim Klenow per estendre els fragments dels primers
3. Afegir DNApol que copiarà el segment fins a trobar el següent encebador  Es tenen moltes

molèc. complementaries de DNA

4. Afegim DNA-lligasa perquè uneixi covalentment els fragments construïts

Mètode de transferasa terminal

• (^) Partim d’híbrids de DNA:RNA
• (^) No hem de tractar amb nucleasa S

1. Eliminem el mRNA a partir de la solució bàsica i escalfant
2. Afegim la transferasa terminal a la ssDNA  permet

addicionar nucleòtids al extrem 3’  afegim cua de guanines

3. Afegim un oligoC (seq. de citosines) complementària a la cua

de guanines de l’extrem 3’ de manera que hibriden

4. Afegim Klenow i dNTPs per sintetitzar el que quedi de cadena

(seguit de la cua de citosines

Mètode de Nick Translation  desplaçament d’osca

• (^) Partim d’híbrids de DNA:RNA

2. Afegim DNA pol dNTPs  utilitzaran els encebadors i copiaran de

5’-3’ i de 3’-5’

3. Afegim DNApol1 que té activitat exonucleasa 5’-3’ per eliminar les

cadenes sintetitzades de RNA i per tal de que s’omplin aquells

forats

4. Afegim DNA lligasa per tal de que uneixi els fragments reomplerts

A temps controlat no es degrada completament  tenim

fragments situats en diferents posicions

1. Eliminem el mRNA amb ribonucleasa H
   • (^) Si ens passem de ribonucleasa H ens quedem sense

RNA

• Si a l’extrem 5’ tenim un fragment de RNA, la DNApol-I

no podrà transformar-lo a DNA perquè no pot sintetitzar

en 5’. DE manera que o tenim un tros de RNA a la

segona cadena o, perdem part d’informació

ESTIMACIÓ DE LA MIDA D’UNA GENOTECA

ESTRATÈGIES PER FACILITAR L’EXPRESSIÓ DE GENS POC

EXPRESSATS

1. Fraccionar el mRNA total per mida (ultracentrifugació)

Fraccionar el mRNA

segons la mida que

esperem que tingui el

nostre gen

• (^) Si el nostre gen és petit  ens quedarem

amb els mRNA petits

• (^) Si el nostre gen és gran  ens quedarem

amb els fragments grans

Separa en funció de la

densitat o coeficient de

flotabilitat de la

molècula

Un cop traiem les mostres de la ultracentrifugadora  en gel d’agarosa per separar les mostres

en mides 

Passem el

mRNA a cDNA

4. Aïllament de polisomes per immunoprecipitació

Complex format pel mRNA amb el ribosoma que està traduint

la proteïna

Precipitació utilitzant anticossos. En el nostre cas, un Ac

que reconegui específicament la proteïna que volem

clonar

**5. Protocols d’aïllament i precipitació de RNA més efectius per addició de “carriers”

6. Ús d’adaptadors
7. Amplificació per PCR dels cDNAs emprant encebadors complementaris a les cues**

afegides mitjançant el mètode de la transferasa terminal

Unir agarosa + proteïna A + fracció conservada de

l’Ac per tal de que precipitessin en forma de

complex

RASTREIG DE GENOTEQUES

Permet trobar el clon d’interès de la

nostra genoteca amb la seq. de DNA

que ens interessa

L’objectiu és trobar el nostre clon amb la

seqüència d'interès

Rastreig d’una genoteca per hibridació amb una sonda marcada radioactivament

En aquest cas, coneixem un tros de la seqüència de DNA que estem buscant, és a dir, coneixem uns

determinats nucleòtids

Estratègia similar a un

Southern

Filtre de nitrocel·lulosa o

nylon sobre la placa

Alguns bacteris de cada

colònia de la placa

quedaran adherits al filtre

Lisem les cèl·lules

bacterianes amb lisozim i

NaOH, irradiem el filtre

amb UVA per fixar les

molècules de DNA i

incubem una sonda

radioactiva

complementaria al nostre

gen

Exposem la placa sota

raigs X i veurem les

colònies amb la nostra

sonda

Millor filtre de nitrocel·lulosa ja

que les proteïnes i el DNA

queden més adherits