practicas bioquímica, Ejercicios de Bioquímica

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BIOQUÍMICA

1º GRADO DE ENFERMERÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CURSO 2016 - 17

Profesores:

Dr. Juan Ferrer Casanova

Dra. Chiquinquira Cadenas Caba

CONTENIDOS

Las prácticas de Bioquímica. Modo de trabajo en el laboratorio.

Evaluación de las prácticas de laboratorio.

P.1 .- Determinación y cuantificación de biomoléculas en orina.

P.2 .- Cinética enzimática. Lactato deshidrogenasa

P.3 .- Identificación de colesterol, HDL, TG en suero normal y suero patológico.

P.4 .- Aislamiento de DNA a partir de células de Escherichia coli y electroforesis de agarosa.

Anexos:

 Instrucciones para utilizar las micropipetas  Símbolos de peligrosidad  Material de laboratorio básico  Realización de gráficas

 En cada práctica se os indicará el recipiente en el que debéis eliminar cada residuo.  Deben lavarse las manos después de terminar las prácticas o en los descansos si implican la salida del laboratorio.

Material o productos peligrosos

 Manejo de material de vidrio : examinar siempre el material de vidrio antes de usarlo. Ocasionalmente podemos encontrarnos con material roto que puede causar cortes en las manos. Una vez usado el material de vidrio debe ser lavado con agua y jabón, y posteriormente aclarado con agua, en primer lugar, y por último con agua destilada.  Sustancias tóxicas y corrosivas. El manejo de productos químicos tóxicos o corrosivos tales como sosa, ácidos fuertes, etc. debe de llevarse a cabo con gran cuidado. ¡ESTÁ PROHIBIDO PIPETEAR PRODUCTOS CON LA BOCA!  Solventes inflamables. El riesgo de producir fuego en el laboratorio debe ser tenido en cuenta siempre que se utilicen solventes inflamables como alcohol, éter, acetona, etc. Cuando se trabaja con ellos hay que hacerlo lejos de los aparatos eléctricos o de la llama.  Centrífugas. Cuando se utilicen centrífugas hay que asegurarse de que los tubos están bien equilibrados.  Balanzas. Después de utilizar las balanzas hay que dejarlas limpias y taradas.  Uso de material biológico. Para la medida de volúmenes de orina o sangre hay que utilizar material desechable.

EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

 La asistencia a prácticas es obligatoria. Sólo se podrá justificar un 20% de ausencia por causa mayor.  En el laboratorio se trabajará en grupos de 2 personas. Los miembros del grupo se deberán mantener en las cuatro sesiones de prácticas.  Esta parte de la asignatura se evaluará mediante la realización de un examen escrito.  La nota obtenida en el examen supondrá un 20% de la nota final de la asignatura.

RECOMENDACIONES

 Respecto a las sesiones prácticas:

• Leer el guión de la sesión correspondiente antes de asistir al laboratorio.
• Leer detenidamente los anexos del guión.
• Repasar conceptos de teoría relacionados con los temas a tratar en cada sesión práctica.
• Anotar en una libreta todos los datos obtenidos en las sesiones prácticas, explicaciones impartidas por los profesores, observaciones, posibles incidencias en la realización de los experimentos…etc.
• El uso de la bata es obligatorio, siendo expulsados del laboratorio aquellos alumnos que no cumplan esta medida de seguridad.

 Respecto a las preguntas propuestas en cada práctica:

• Utilizar correctamente el lenguaje científico (pH, absorbancia…etc.).
• Utilizar correctamente subíndices y superíndices.
• Formular correctamente compuestos químicos.
• Indicar las unidades de todos los datos.
• Comentar lógicamente los valores obtenidos en cada práctica.
• Representar adecuadamente las gráficas: cuidar proporcionalidades, unidades, distribución de datos, indicar qué parámetro se representa en cada eje, extrapolar datos correctamente…etc.
• Desarrollar los cálculos realizados para obtener un dato, concentración, etc.

PROCEDIMIENTO

Depositar 2 mL de orina normal en un tubo de ensayo y en otro tubo 2 mL de orina con proteínas. Adicionar en ambos tubos, con ayuda de una pipeta Pasteur, unas 3 o 4 gotas de ácido acético hasta alcanzar un pH alrededor de 4,5 (pH cercano al punto isoeléctrico de la albúmina). Incubar los tubos en un baño con agua hirviendo durante 5 min. Al cabo de unos segundos aparece una turbidez en la muestra que presenta albúmina, mientras que la orina normal permanece transparente. En función de la turbidez que aparece, se puede estimar la concentración de albúmina en orina utilizando un turbidímetro. Esto último no lo vamos a determinar.

CUESTIONES

1. ¿Por qué precipita la albúmina tras la adición de ácido acético?
2. ¿Podrías estimar cuantitativamente la concentración de albúmina en orina con el método empleado?

2. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LA PRESENCIA DE GLUCOSA POR EL MÉTODO DE BENEDICT

Las células vivas necesitan una fuente constante de combustible a partir de los cuales obtener ATP para el mantenimiento de la función y desarrollo celular normal. Por lo tanto, debe conseguirse un equilibrio entre la ingestión de hidratos de carbono, grasas y proteínas, su almacenamiento cuando se encuentran por encima de las necesidades inmediatas y su movilización y síntesis cuando hay demandas. El balance entre necesidad y disponibilidad se denomina homeostasis metabólica. El papel especial de la glucosa en la homeostasis metabólica está dictado por el hecho de que muchos tejidos dependen de la glucólisis para todas o algunas de sus necesidades energéticas, y necesitan un aporte continuo de glucosa para satisfacer su ritmo rápido de utilización de ATP. En el adulto, se necesitan diariamente un mínimo de 190g de glucosa, 150g para el cerebro y 40g para otros tejidos. Los descensos significativos de la glucosa sanguínea por debajo de 60mg/dL limitan el metabolismo de la glucosa en el cerebro y desencadenan síntomas hipoglucémicos. Actualmente existen varios métodos para determinar la concentración de glucosa en sangre y en orina. En esta práctica, determinaremos de forma cualitativa la presencia de glucosa en orina mediante la reacción de Benedict, en la cual azúcares reductores reducen el Cu2+^ que tiene color azul a Cu+^ que precipita.

MATERIAL

• Reactivo de Benedict - Gradilla
• Tubos de ensayo - Pipetas de vidrio: 5 mL
• Propipetas - Pipeta Pasteur
• Baño termostático - Frascos de orina estériles
• Orina de un individuo sano - Orina de un posible diabético
• Orina + glucosa

PROCEDIMIENTO

Pipetear 5 mL de reactivo de Benedict en tres tubos de ensayo y calentar en un baño hirviendo durante 5 min. Posteriormente, marcar los tubos con un rotulador permanente de la siguiente forma: C (control, individuo sano); 1 (orina de un posible diabético); 2 (orina + glucosa). Añadir a cada uno de los tubos 8 gotas de la orina correspondiente, agitar e incubar la mezcla durante 3-5 min. en un baño hirviendo. CUESTIONES

1. ¿Qué ha sucedido tras la última incubación en el baño de agua hirviendo?
2. ¿Observáis alguna diferencia en los resultados obtenidos a partir de las tres muestras de orina? ¿a qué pensáis que es debido?
3. ¿Podríamos emplear esta reacción para la determinación de cualquier tipo de azúcar? ¿Por qué?
4. A partir de estos datos, ¿se podría determinar de forma cuantitativa la concentración de glucosa en orina? ¿por qué?

3. REALIZACIÓN DE UN UROANÁLISIS MEDIANTE TIRAS REACTIVAS

Las tiras reactivas son métodos de química seca, algunas de las cuales son de uso habitual en el ámbito de la atención primaria. Consisten en bases plásticas en las que hay adheridas diversas áreas reactivas para determinar de forma semicuantitativa glucosa, bilirrubina, cuerpos cetónicos, pH, sangre, proteínas, urobilinógeno, nitritos y leucocitos. Por lo tanto, los resultados obtenidos por las tiras reactivas proporcionan información referente al metabolismo de carbohidratos, función hepática y renal, balance ácido-base e infecciones del tracto urinario. Las tiras reactivas están listas para utilizarse y son desechables. Estas pueden ser leídas visualmente, aunque existen otro tipo de tiras que pueden ser leídas empleando autoanalizadores. En esta práctica vamos a determinar simultáneamente diferentes parámetros, los cuales se detallan a continuación:

• Densidad específica: Esta prueba refleja la concentración de iones en la orina.
• Leucocitos: su determinación se basa en la presencia de la actividad esterásica de granulocitos. Se detectan leucocitos intactos y también lisados.
• Nitrito: es detectado gracias a la presencia de patógenos de las vías urinarias, ya que estos microorganismos transforman el nitrato absorbido con la alimentación en nitrito.
• pH: se determina empleando papel reactivo con varios indicadores. El valor de pH en orina fresca oscila entre 5 y 6 en personas sanas.
• Proteínas: la reacción se basa en el principio del error proteico de indicadores de pH y reacciona habitualmente con la albúmina.
• Glucosa: su detección se lleva a cabo por el método específico de la glucosa oxidasa peroxidasa.
• Cuerpos cetónicos: detección basada en el principio de la prueba de Legal y reacciona más intensamente con el ácido acetilacético que con la acetona.

colorimétricos hay que construir una curva de calibrado mediante una disolución de proteína estándar, de concentración conocida, representando absorbancias frente a concentraciones. Si se sigue la Ley de Lambert-Beer y "l" se mantiene constante, esta representación será una recta que pase por el origen, mientras que si se hace un gráfico del porcentaje de transmitancia frente a la concentración da una curva negativa exponencial. Cuando se obtiene la recta se interpolan los valores obtenidos en la disolución problema para obtener su concentración. En el método de Biuret las proteínas y los péptidos, debido a los enlaces peptídicos, dan un complejo de coordinación entre los iones cobre y los grupos CO y NH del enlace peptídico cuando se encuentran en disolución alcalina. Este complejo, de color violeta, da un máximo de absorción a 545 nm. Si una disolución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO 4 ) se añade a una disolución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un máximo de absorción a 545 nm. Las características más importantes de la reacción son:  Se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.  Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.  No depende de la composición de aminoácidos.  Algunos compuestos (NH 4 +, Tris, etc.) dan la reacción.

MATERIAL

- Pipetas de vidrio y propipetas - Gradillas

• Tubos de ensayo - Baño termostático
• Colorímetro o espectrofotómetro - Reactivo de Biuret
• Albúmina 2,5mg/ml - Muestra problema

PROCEDIMIENTO

Preparar nueve tubos de la forma siguiente.

Nº tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H 2 O destilada 2 1 , 6 1 , 2 0 , 8 0 , 4 0 1 , 5 1 0 , 5 Albúmina 2 ,5mg/ml 0 0 , 4 0 , 8 1 , 2 1 , 6 2 -- -- -- Problema -- -- -- -- -- -- 0 , 5 1 1 , 5

Añadir 5 ml de reactivo de Biuret a cada tubo y agitar bien con el vortex, dejando reposar durante 10 minutos a 37 ºC. Al cabo de ese tiempo se dejan enfriar y se leen las absorbancias a 545 nm frente al tubo nº 1 que hace de blanco. (El blanco en todas las determinaciones colorimétricas se hace con todos los reactivos que intervienen en la reacción, en las mismas proporciones, sustituyendo el volumen de la proteína con agua destilada).

CUESTIONES

1. Construye la recta de calibrado, representando las absorbancias frente a la concentración de la disolución patrón de albúmina.
2. Calcula la concentración de proteína en los tubos problema: tubos 7, 8 y 9 del método de Biuret. ¿Deberían ser iguales? ¿Por qué?
3. ¿Cuál es la concentración de proteína problema de la muestra que se os ha proporcionado?

DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE HÍGADO

a) Obtención del extracto de hígado de cordero

Como fuente de enzima se utilizará hígado de cordero homogenado en sacarosa 0,25 M (1g en 10 ml), centrifugado a 15000 rpm durante 20 min a 4ºC. El sobrenadante se utilizará diluido (1:25) en sacarosa 0,25 M.

b) Determinación de Km y Vmax

Disponed siete tubos de ensayo en una gradilla a los que se les añade tampón y piruvato con arreglo al siguiente esquema (las cantidades están en ml): Nº Tubo 1 2 3 4 5 Vol. (ml) Vol. (ml) Vol. (ml) Vol. (ml) Vol. (ml)

Tampón Fosfato 2,5 2,4 2,3 2,2 2, Piruvato 1 mM 0,2 0,3 0,4 0,5 0, Extracto hígado 0,2 0,2 0,2 0,2 0,

En el espectrofotómetro se ajusta la absorbancia a 340 nm, y se realiza el blanco (calibrado de la medida de absorbancia) utilizando 3 ml de tampón fosfato.

A continuación, se añade al primer tubo 0,1 ml de NADH se agita y se vierte rápidamente el contenido en la cubeta del espectrofotómetro o colorímetro, leyéndose el cambio de absorbancia a 340 nm por un periodo de unos 1,5 minutos, cada 10 segundos. Se repite este proceso consecutivamente con todos los tubos. El volumen final del medio de reacción es siempre de 3 ml.

c) Estudio de inhibición

Disponed tres tubos de ensayo en una gradilla y preparad las siguientes reacciones enzimáticas: Nº Tubo 6 7 8 Vol. (ml) Vol. (ml) Vol. (ml) Tampón Fosfato 1,9 1,9 1, Piruvato 1 mM 0,8 --- 0, Piruvato 21 mM --- 0,8 --- Oxalato 15 mM --- --- 0, Extracto de hígado 0,2 0,2 0,

El blanco se ajusta con 3 ml de tampón fosfato. A continuación se añade al primer tubo 0,1 ml de NADH se agita y se vierte rápidamente el contenido en la cubeta del espectrofotómetro o colorímetro, leyéndose el cambio de absorbancia a 340 nm por un periodo de unos 1,5 minutos, cada 10 segundos. Se repite este proceso consecutivamente con todos los tubos. El volumen final del medio de reacción es siempre de 3 ml.

CUESTIONES

1. Calculad las velocidades iniciales de reacción de cada ensayo representando los valores de absorbancia frente al tiempo.
2. Calculad los valores de Km y Vmax mediante la representación de Lineweaver Burk.
3. Tras realizar el estudio de inhibición, ¿qué conclusiones podéis deducir a partir de los resultados obtenidos?
4. Elabora una tabla en la que aparezcan los distintos tipos de LDH, su composición y localización.
5. ¿Cómo varían los niveles de LDH 1 y LDH 2 en sangre después de un infarto de miocardio?

Segundo, la cuantificación del colesterol presente en dicha lipoproteína como se indicó anteriormente. Entre estos reactivos precipitantes están el ácido fosfotungstico y el magnesio que precipitan a las LDL y VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solución. En esta solución determinaremos el colesterol presente con los reactivos correspondientes.

DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS

Para la determinación de triglicéridos en suero se utilizan reactivos comerciales (Kit comercial de Spinreact) que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificación por espectrofotometría visible. Las reacciones que tienen lugar son:

1. Una lipasa hidroliza los triglicéridos dando glicerol más ácidos grasos libres. Triglicéridos + H 2 O → Glicerol + Ac. Grasos
2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa (GK) que en presencia de ATP lo fosforila a glicerol 3P. Glicerol + ATP → Glicerol-3-P + ADP
3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato oxidasa (GPOD) dando también peróxido de hidrógeno. Glicerol-3-P + O 2 → Dihidroxiacetona + H 2 O 2
4. El peróxido de hidrógeno junto con los cromógenos p-clorofenol y 4-AP son sustrato de una peroxidasa (POD) para formar una quinona roja cuantificable a 505 nm. La quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra. H 2 O 2 + p-clorofenol + 4-AP → Quinona + H 2 O

MATERIAL

• 10 Tubos de ensayo - Gradilla
• Propipeta y pipetas de 1mL y de 2mL -Pipetas automáticas (para: 20L, 40 L)
• Espectrofotómetro - Baños
• Suero Estándar de colesterol (200 mg/dL) - Reactivo de trabajo para el colesterol
• Reactivo precipitante - Estándar de triglicéridos (200 mg/dL)
• Reactivo de trabajo para triglicéridos - Suero Problema (Spintrol normal y patológico)
• Eppendorf - Centrífuga

PROCEDIMIENTO

Por comodidad prepararemos primero la muestra de HDL-colesterol, una vez extraído el mismo de la muestra la apartaremos y determinaremos su contenido en colesterol junto con las muestras en las que queremos determinar el colesterol total (ColT).

1. Determinación de HDL-colesterol

1. Mezclar 0,4 mL del suero con 0,04 mL del reactivo precipitante en un tubo de centrífuga. Incubar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 20 min a 4000 rpm (ó 2 min a 12000 rpm).
2. La determinación de HDL-colesterol se realiza con 10 μL del sobrenadante como se indica en la Tabla I y utilizando el reactivo indicado en la determinación de colesterol total. 2. Determinación de colesterol total
3. Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estándar, muestra ColT y muestra HDL-col. La muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar. (4 tubos)
4. Pipetear los componentes indicados en la Tabla, añadiendo en último lugar el reactivo de trabajo de colesterol.

Tabla I. Protocolo para la cuantificación de colesterol total y HDL colesterol Blanco Estándar (200mg/dL)

Colesterol total Suero NP/P

HDL-colesterol Suero NP/P Estándar de colesterol - 10 μL - Suero - - (^10) L 1 0 μL React. de trabajo 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

• Mezclar e incubar 5 min a 37ºC (ó 10 min a temperatura ambiente).
• Leer la absorbancia a 505 nm. La coloración es estable 60 min. Calcula la concentración de colesterol total de cada una de las muestras de suero del siguiente modo: mg/dl Colesterol Total=( Amuestra / Aestándar ) x Conc. Estándar

Calcula la concentración de colesterol de las HDL del siguiente modo: mg/dl HDL-colesterol = Amuestra x 320

Linealidad: Hasta valores de 600mg/dL. Para concentraciones superiores se deberá diluir la muestra a 1:2 con solución salina, multiplicando el resultado por 2.

3. Determinación de triglicéridos.

Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estándar y muestra. La muestra se refiere al suero a valorar y se colocan tantos tubos como sueros se desee valorar. Pipetear los componentes indicados en la Tabla II, añadiendo en último lugar el reactivo de trabajo de triglicéridos.

RESULTADOS ESPERADOS

Los resultados esperados son aquellos que se indican a continuación y se corresponden con los valores de referencia encontrados en la población sana y que varían según sexo y edad.

Colesterol total Hasta 30 años: 120-215 mg/dL 30- 39 años: 135-240 mg/dL 40-49 años: 140-280 mg/dL 50- 59 años: 145-295 mg/dL Colesterol-HDL Hombre > 55 mg/dL Mujer > 65 mg/dL Triglicéridos 36-165 mg/dL LDL colesterol < 150mg/dL

ANEXO:

SOLUCIONES

Estándar de colesterol: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de colesterol que se prepara según las indicaciones del fabricante y que contiene: 300 U/l de colesterol estearasa, 300 U/l de colesterol oxidasa, 1250 U/l de peroxidasa, 0, mmol/l de 4-AP, 26 mmol/l de fenol en tampón pipes 90 mM, pH 6, Reactivo precipitante: 14 mmol/l ac. fosfotungstico y 2 mmol/l MgCl 2 Estándar de triglicéridos: 200 mg/dl Reactivo de trabajo de triglicéridos que se prepara según las indicaciones del fabricante y que contiene: 150000 U/l de lipasa, 500 U/l de GK, 2500 U/l de GPO, 440 U/l de peroxidasa, 0,1 mmol/l de 4-AP, 0,126 mmol/l de fenol, 0,5 mM de ATP, 2 mmol/l de p-clorofenol en tampón fosfato 50 mM pH 7,5.

MATERIAL BIOLÓGICO

Suero, estable 6 días a 2-8ºC.

P 4: AISLAMIENTO DE DNA A PARTIR DE Escherichia coli Y ELECTROFORESIS DE AGAROSA

La bacteria gram negativa Escherichia coli es el microorganismo procariota más estudiado hasta la fecha. Se trata de una enterobacteria simbiótica e inocua que habita en el intestino de los seres humanos y otros mamíferos. Gracias a ésta, y a otras bacterias, el funcionamiento del proceso digestivo es correcto y además se favorece la absorción de ciertas vitaminas, especialmente de la vitamina K. Actualmente, se conocen muchas cepas de E. coli , la mayoría de las cuales son inofensivas. Sin embargo, algunas cepas son capaces de producir enfermedades relacionadas con el tracto gastrointestinal y el aparato urinario. Las infecciones urinarias por E. coli son muy frecuentes entre la población sana, generalmente por contaminación del tracto urinario por flora fecal. Estas infecciones son fácilmente tratables con los antibióticos adecuados y no suelen revestir gravedad. En relación a las infecciones gastrointestinales, destaca por su frecuencia la conocida “diarrea del viajero”, problema de salud que ocurre con mayor incidencia en viajeros internacionales, especialmente cuando se visita una zona tropical. La infección se manifiesta por fiebre y deposiciones acuosas, y suele remitir espontáneamente en unos 3-5 días. El tratamiento es básicamente la ingesta de líquidos en abundancia para evitar cuadros de deshidratación. Caso aparte son las infecciones producidas por una cepa muy agresiva de E. coli , la O157:H7, que produce un cuadro de diarrea inflamatoria de mayor gravedad y que puede complicarse con un síndrome hemolítico-urémico, aunque afortunadamente son poco frecuentes.

Desde el punto de vista de la biotecnología, la estructura y propiedades de E. coli son muy bien conocidas. De hecho, esa bacteria se emplea con mucha frecuencia en técnicas de biología molecular y genética. Por ello, en esta práctica se aislarán los ácidos nucleicos de este microorganismo y se visualizarán mediante electroforesis en gel de agarosa.

MATERIAL

• Eppendorf - Etanol absoluto
• 5 mL de cultivo de E. coli JM109 - Agua ultrapura
• Centrífuga - Gradilla
• Micropipetas - Cubeta y fuente de electroforesis
• Pipeta Pasteur de plástico - Agarosa
• Fenol - Red Safe
• Tampón de lisis: NaOH 0,2 M, SDS 1%
• Tampón de carga 6x

PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento DNA: Células procedentes de un cultivo reciente de E. coli se cosecharán en primer lugar para eliminar todo el medio de cultivo. Para ello, adicionar en un eppendorf 1,5ml de cultivo con una pipeta Pasteur de plástico y centrifugar a 10.000 rpm durante 3 minutos. A continuación, eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y repetir el paso una vez más. Una vez que tenemos el