Bioquímica II
División de Bioquímica y Biología Molecular
1
PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA II
2º Biología
Universidad de Alicante
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Agroquímica y Bioquímica
Área de Bioquímica y Biología Molecular
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Asignatura: bioquimica II, Profesor: , Carrera: Biologia, Universidad: UA
Tipo: Ejercicios
2016/2017
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Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 1
PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA II
2 º Biología
Universidad de Alicante
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Agroquímica y Bioquímica
Área de Bioquímica y Biología Molecular
Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 2
PRÁCTICA 1 : Preparación y propiedades del citocromo c
Introducción.
Los citocromos son proteínas de color oscuro que desempeñan una función vital en el transporte de energía química en todas las células vivas. Las células animales obtienen la energía de los alimentos mediante un proceso llamado respiración aerobia; las plantascapturan la energía de la luz solar por medio de la fotosíntesis. Los citocromos intervienen en los dos procesos. Se tratan de metaloporfirinas (proteínas que tienen un anillo compuesto de 4 pirroles, llamado porfirina, que encierra un átomo metálico mantenido por enlaces coordinados), del tipo hemo, es decir, es el hierro, cuyo estado de oxidación varía de +3 a +2, el que forma parte del anillo. El átomo metálico es el que da al citocromo el color oscuro característico. Hay tres grandes tipos de citocromos llamados a, b y c, clasificados en función del espectro de absorción y del tipo de grupo hemo. El citocromo c es una proteína pequeña, que funciona como transportador electrónico mitocondrial entre los complejos respiratorios III y IV. Se trata de una proteína monomérica, unido a esta estructura hay un grupo prostético constituido por un grupo hemo C, es decir, una protoporfirina IX con un ion de hierro coordinado.
Fundamento
Cuando se homogeneízan corazones con ácido tricloroacético, la mayoría de las proteínas precipitan, mientras que el citocromo c permanece en solución. Al extracto de ácido tricloroacético se le añade sulfato de amonio, el cual completa la precipitación de la mioglobina, hemoglobina y otras proteínas. Una mayor acidificación con ácido tricloroacético precipita el citocromo c que puede ser entonces dializado y caracterizado.
Materiales
- Corazón de cerdo o de cordero.
- Homogeneizadores.
- Muselina.
- Hidróxido de sodio (100 g/L)
- Sulfato de amonio.
- Ácido tricloroacético (200 g/L).
- Ácido tricloroacético (0.145 mol/L).
- Solución saturada de sulfato de amonio.
Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 4 Esto significa que una solución de citocromo c oxidada de concentración 1 mol/L o 1 mmol/mL tiene un coeficiente de extinción de 0.9 x 10^4 en una trayectoria de luz de 1 cm. Forma oxidada. Prepare la siguiente solución y lea la extinción E 1 a 5 5 0 nm frente a un blanco de ferricianuro y amortiguador. Componente mL Amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/L) 1. Preparación convenientemente diluída de citocromo c 1. Ferricianuro de potasio (0.01 mol/L) 0. Forma reducida. Prepare la mezcla siguiente y lea la extinción E 2 frente a un blanco de ditionito y amortiguador. Componente mL Amortiguador de fosfato de sodio (0.1 mol/L) pH 7.4 1. Preparación de citocromo c 1. Solución saturada de ditionito de sodio 0. Use los datos obtenidos para calcular la concentración de citocromo c presente en la cubeta en mg/mL. Ya que hay 3 mL en la cubeta, multiplique esta cantidad por 3; recuerde además que esta cantidad de citocromo c estaba presente en 1 mL de preparación diluida. Por tanto, el rendimiento del citocromo c en miligramos (Y) está dado por la fórmula: Y(mg) = (E 1 /k 1 ) x peso mol x 3 x dilución x V Y(mg) = (E 2 /k 2 ) x peso mol x 3 x dilución x V Peso mol citocromo c = 12300 E 1 = Absorbancia a 550. Exprese el resultado final como miligramos de citocromo c por kilogramo de corazón. El rendimiento calculado para las formas oxidada y reducida debe ser el mismo si el material es relativamente puro. Como prueba final de pureza, puede determinar la cantidad total de proteína presente usando uno de los procedimientos estándar descritos anteriormente (Método de Bradford, Método de Lowry, Método de Biuret).
Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 5 Espectro de absorción. Finalmente realice el espectro de absorción de las formas oxidada y reducida y determine la absorción máxima en la región visible. Máximos para la oxidada 408 nm y 530 nm. Máximos para la reducida 415 nm, 520 nm y 550 nm.
Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 7 etanol para arrastrar los restos de ácido tricloroacético y para ir deshidratando las partículas de glucógeno. Para ello se sigue la serie que sustituye al agua que es: etanol del 95 %, etanol absoluto, etanol-éter y éter etílico, que puede ser eliminado calentando moderadamente la muestra; de este modo se obtiene un glucógeno bastante seco y con un elevado grado de pureza.
Método:
Se toman unos 4 o 5 mejillones en buen estado y de tamaño medio o grande. Se abren mediante la inserción de un cuchillo junto a la charnela cortando el músculo abductor principal. Se extrae la mayor cantidad posible de manto, así como el resto de tejido gonadal aparente; es preferible no incluir el borde del manto ni los órganos centrales, ya que su contenido en glucógeno suele ser bajo. Este tejido es finamente desmenuzado con unas tijeras y pesado dentro de un Erlenmeyer de 500 mL. Se añade a continuación un volumen aproximadamente equivalente a 1.5 veces el peso de la muestra de hidróxido sódico al 20%, agitando bien mediante una varilla o con un suave movimiento rotatorio del matraz. Se deja el conjunto en un baño de agua hirviendo durante unos 5 a 10 minutos o hasta la digestión completa del material, que es cuando al ir agitando ya no se observen fragmentos de tejidos en suspensión. Se enfría el matraz en un baño de agua fría hasta que esté a temperatura ambiente, mejor si se mantiene en un baño de hielo, ya que así tarda menos tiempo en enfriar. A continuación se añade, en un baño de hielo, y en la vitrina o en lugar aireado (campana), ya que se producen vapores nauseabundos de sulfuros formados, agitando constantemente con una varilla, suficiente ácido clorhídrico 5 N, aproximadamente, un volumen igual al de hidróxido sódico añadido, hasta que la reacción sea ácida, obsérvese con papel indicador y una varilla de vidrio, y se produzca una clara floculación de material proteico. Se filtra o centrífuga el conjunto hasta obtener un sobrenadante claro. Es conveniente acelerar este proceso y efectuarlo en todo momento en frío, para evitar la hidrólisis del glucógeno por el ácido en exceso presente en la muestra. Una vez centrifugado o filtrado el material, se eliminan los posibles residuos macroscópicos flotantes mediante un filtrado rápido a través de una torunda laxa de algodón en la rama corta de un embudo. Al sobrenadante limpio se le añade un volumen doble de etanol del 96%, en frío, agitando con una varilla. Se aprecia inmediatamente un precipitado masivo de glucógeno, el rendimiento es mayor si se deja un par de horas el conjunto en un congelador, que se recoge por centrifugación o filtración. Este precipitado, en el fondo de los tubos de centrífuga, es redisuelto en muy poca agua caliente, vertida sobre él y agitando con una varilla limpia de vidrio; la disolución concentrada de glucógeno se enfriada en un baño de hielo y se le añade un volumen igual de ácido tricloroacético al 20%, también frío, mezclando bien con una varilla. El conjunto es de nuevo centrifugado durante 20 minutos a 2000 g o filtrando a través de un buen filtro de poro pequeño, con el fin de eliminar el resto de proteína insolubilizada. Se precipita de nuevo el glucógeno con 2 volúmenes de etanol del 96% en frío, recogiéndose el precipitado por centrifugación en un tubo de centrífuga ancho. El precipitado se resuspende en etanol del 66% en el mismo tubo de centrífuga, con un
Bioquímica II División de Bioquímica y Biología Molecular 8 volumen al menos unas 10 veces mayor que el del precipitado, y se vuelve a recuperar el precipitado por centrifugación, descartándose el líquido de lavado. Se repite el procedimiento con etanol del 96% y luego con etanol absoluto. En cada ocasión es conveniente deshacer el precipitado con una varilla de vidrio roma, asegurándose de un íntimo mezclado con el disolvente y que el precipitado sea lo más pequeño posible. Tras el lavado con etanol absoluto y éter etílico, por último se resuspende el precipitado en éter etílico puro. El último precipitado, una vez extraído el éter, se seca en una suave corriente de aire seco y caliente o bien se deja durante unos 10 minutos en una baño de agua mantenido a unos 40- 50ºC, con el fin de evaporar todo el éter. En el mismo tubo, el precipitado se desmenuza de nuevo con una varilla de vidrio, hasta obtener un polvo muy fino y seco de glucógeno puro. La muestra obtenida se pesa a continuación, para determinar el rendimiento de la operación de extracción y purificación. Se guarda en un tubo eppendorf para la práctica de la amilasa. RESULTADOS ESPERADOS Una vez finalizada la parte práctica, hay que presentar los resultados obtenidos. Para ello se debe indicar el rendimiento total en glucógeno y calcular el contenido en glucógeno del mejillón, expresándolo en mg de glucógeno por g de tejido fresco. mg de glucógeno puro Rendimiento =
g de muestra
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- Almidón (azul).
- Amilodextrinas (violeta).
- Eritrodextrinas (rojo).
- Acrodextrinas (incoloro*).
- Maltosa (incoloro*).
- Glucosa (incoloro). _ Tener en cuenta el ligero color amarillo propio del iodo._ El almidón también puede hidrolizarse enzimáticamente. Uno de los enzimas que hidrolizan el almidón es la amilasa, que se halla presente en el jugo pancreático y la saliva. Este enzima ataca al azar los enlaces (14) del interior de la cadena. Así, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. La amilasa no ataca los enlaces (16), base de las ramificaciones de la amilopectina. Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificador. La -amilasa, una enzima de la saliva humana, cataliza la hidrólisis rápida y desordenada de los enlaces -1, glicosídicos del glucógeno y almidón, siendo por lo tanto la primera enzima que se encuentra durante la ingestión de alimentos que degrada polisacáridos dando glucosa, maltosa e isomaltosa. En esta práctica primero se va a cuantificar la amilasa presente en saliva y en segundo lugar se realizará la hidrólisis del glucógeno de mejillón aislado. La práctica consta de 2 partes. La -amilasa, una enzima de la saliva humana, cataliza la hidrólisis rápida y desordenada de los enlaces -1,4 glicosídicos del glucógeno y almidón, siendo por lo tanto la primera enzima que se encuentra durante la ingestión de alimentos que degrada polisacáridos dando glucosa, maltosa e isomaltosa.
Materiales y métodos
Materiales:
- Saliva o glucógeno - Solución de almidón al 1% (w/v) - Solución del cloruro sódico al 1% (w/v) - Solución diluida de yodo (Preparada disolviendo 1 g de yoduro potásico y unos 10 g de yodato sódico en un litro de agua). - Tampón fosfato 0.2 M a pH 6.6. - Baño de agua a 38ºC - Reactivo de antrona (Antrona al 0.1% en ácido sulfúrico del 84% (w/v); puede ser necesario calentar ligeramente para permitir la disolución de la antrona, pero el reactivo debe utilizarse a temperatura ambiente y en todo caso recientemente preparado). - Glucógeno aislado al 1% - Glucosa
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Procedimiento:
Parte I
En este experimento el tiempo de ensayo es hasta la completa desaparición del sustrato. Como sustrato se utilizará almidón siendo este detectado con una solución de yodo. 1. Obtención del enzima. Tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de papel de filtro para estimular la salivación. Los líquidos segregados se van recogiendo en un erlenmeyer para recoger la suficiente cantidad de saliva para realizar la práctica. La saliva así obtenida se diluye 1:10 con agua destilada, obteniendo así la preparación de enzima base.
2. Medida de actividad de la enzima Pipetear 5 mL de la solución al 1% de almidón en un tubo, añadir 2 mL de cloruro sódico al 1% y 2 mL de tampón fosfato pH 6.6, mezclar bien y situarlo en un baño a 38ºC. (Esta disolución contiene el sustrato, tampón y el activador). Solución A. Preparar una serie de 10 tubos que contengan 2 mL de solución de yodo. Añadir 1 mL de saliva diluida a la mezcla de almidón ( Solución A) y volver a situar el tubo en el baño de agua a 38ºC inmediatamente. Apuntar el tiempo cuando se ha producido la adición de la enzima. Al final de cada minuto, extraer 2 gotas de la mezcla de reacción y añadirla a uno de los tubos de la solución de yodo. Apuntar el tiempo cuando no ocurra un cambio de color al añadir las 2 gotas a la solución de yodo. Si el tiempo es menor de 5 min o mayor de 20 min, repetir el experimento usando una dilución diferente de saliva, el tiempo final debe estar sobre los 10 min. Cuando el almidón está hidrolizado no produce ningún cambio de color a la solución de iodo (punto acromático). El tiempo necesario para alcanzar tal punto da idea de la actividad de la enzima. La inversa de dicho tiempo equivale a la velocidad de la reacción enzimática.
Cálculos:
Una unidad de amilasa se define como la cantidad de amilasa que puede catalizar la hidrólisis de 5 mL de solución de almidón al 1% en 10 min bajo las condiciones del experimento. Unidades de amilasa = (factor de dilución) x 10 / T min T = tiempo de reacción para la completa desaparición del almidón.
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PRÁCTICA 4 : Aislamiento de RNA de levadura
Introducción:
El RNA total de levadura se obtiene extrayendo un homogenado celular con fenol. La solución concentrada de fenol destruye los enlaces de hidrógeno en las macromoléculas produciendo la desnaturalización de la proteína. La suspension turbia se centrífuga y aparecen dos fases: la fase inferior fenólica contiene DNA y la fase superior acuosa contiene carbohidratos y RNA. Las proteínas desnaturalizadas, que están presentes en ambas fases, se elimina por centrifugada. El RNA se precipita con etanol. El producto obtenido está libre de DNA pero contaminado con polisacáridos. Se puede purificar posteriormente por tratamiento de la preparación con amilasa.
Materiales:
- Levadura liofilizada o fresca
- Solución de fenol (90%)
- Acetato potásico (20%, pH5)
- Eter dietílico
- Baño de agua a 37ºC
- Centrífuga
Procedimiento:
- Resuspender 3 g levadura en 12 mL de agua destilada previamente calentada a 37ºC. Dejar durante 15 min a esta temperatura y añadir 16 mL de solución concentrada de fenol (CUIDADO!!).
- Agitar la suspension mecánicamente durante 30 min a temperatura ambiente, centrifugar a 3000 xg durante 15 min en frio para romper la emulsión.
- Recoger cuidadosamente la fase acuosa superior con una pipeta Pasteur y centrifugar a 10000 xg durante 5 min en una centrifuga refrigerada para sedimentar la proteína desnaturalizada. Recoger el sobrenadante.
- Añadir acetato potásico al sobrenadante a una concentración final del 2% y precipitar el RNA añadiendo 2 volúmenes de etanol.
- Enfriar la solución en hielo y dejarla durante al menos una hora. Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 minutos en frio.
- Lavar el RNA con etanol-agua (3:1), etanol y finalmente éter; secar al aire y pesar. Nota: La levadura contiene aproximadamente un 4% de RNA por peso seco.
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- 14 - Espectro de absorción del RNA y determinación de la pureza del RNA obtenido. Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA. La absorción de UV de DNA es una característica de la molecula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA) puede ser ignorado. Sin embargo, esas contribuciones son más significativas cuando se trata de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración. Los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm. A esta longitud por lo tanto, la absorción es proporcional a la concentración. Comprobar la densidad óptica a 260 nm. Si fuera preciso, diluir la muestra (o incrementar su concentración añadiendo más muestra y menos agua a la cubeta) hasta que la medida de densidad óptica se encuentre dentro del rango apropiado. Comprobar la densidad óptica a 280 nm. Ello es un índice de la posible contaminación proteica. Determinar el espectro entre 230 y 300 nm. Debe obtenerse un pico romo claro. Protocolo para medir la absorbancia.
- Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamineto y seleccionar la longitud de onda a 280 y 260nm
- Usar agua destilada o agua MilliQ en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
- A 990 μl de agua destilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10μl de solución de ácido nucleico, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.
- Leer la absorbancia a 280 y 260nm de la muestra Las proteínas tienen un máximo de absorción a A 280 (principalmente por residuos de triptófano y tirosina) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. El cálculo de la relación A 260 /A 280 es una manera común para expresar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1. a 1.9 indican una muestra pura. Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A 260 /A 280 puede no necesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces también, una muestra con una baja relación A 260 /A 280 puede secuenciarse bien. El método mas común de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol para eliminar la proteína contaminante. El fenol tiene una absorción máxima a 270nm. Las preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificialmente altas a A 260 y la concentración de DNA será sobrestimada.