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Asignatura: Bioquímica, Profesor: Varios Varios, Carrera: Biología, Universidad: UAM
Tipo: Ejercicios
2013/2014
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PRÁCTICAS
DE
BIOQUÍMICA
El tampón 1 se hace con 0,04mL de Tris 0,04 mL de NaCl y 3,956 mL de agua.
Preparación de Tampón 2
{ }
El tampón 2 se hace con 0,04mL de Tris 0,12mL de NaCl y 3,876 mL de agua.
Preparación de Tampón 3
El tampón 3 se hace con 0,04mL de Tris 0,24mL de NaCl y 3,756 mL de agua.
Preparación de Tampón 4
El tampón 4 se hace con 0,04mL de Tris 0,4mL de NaCl y 3,596 mL de agua.
PRÁCTICA 1.4: Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
En este experimento se ha usado los datos de mi compañera:
Muestra ST F1 F2 F Concentración media sin diluir (μg/mL) (^) 33300 712 6600 6960
Es importante destaca que no se usó mis datos para este experimento, pues tendremos que coger 40 μg de cada muestra, y como las tenemos diluidas, necesitamos usar las concentraciones para hallar el volumen que debemos tomar.
Tabla 2: En esta tabla se relaciona el peso molecular con el Rf, no incluimos los valores del peso molecular 250, 150 y 15-10 debido a que no se distinguen tan claramente como los otros. Para completar la columna del log (peso molecular) de las proteínas, se sustituye Rf de éstas en la ecuación de la recta patrón, indicada en la Gráfica 2, y para completar la columna del peso molecular de la proteína se hace el antilogaritmo de la columna del log (peso molecular).
Gráfica 2 : Esta gráfica representa la relación entre el logaritmo del peso molecular y el Rf de la muestra de PM, utilizaremos esta gráfica para determinar el peso molecular de las proteínas de nuestras muestras.
Los pesos moleculares de las proteínas de nuestras muestras que anteriormente hemos enriquecido y purificado, son:
Proteínas A = 24,946 kD Proteínas B = 43,551 kD Proteínas C = 78,611 kD
La inmunoglobulina más pequeña que se conoce hasta ahora es la Inmunoglobulina G, de 150 kD, por lo que parece que ninguna de estas proteínas puede ser una inmunoglobulina, pero lo que en realidad se ha hecho, es romper los puentes disulfuros que unen las cadenas pesadas con las ligeras. Según indica el guión, las cadenas ligeras tienen un peso molecular entre 20 y 25 kD, por lo que podríamos sospechar que las “proteínas A” pueden corresponder a estas cadenas; Las cadenas pesadas, se estima que tienen un peso entre 50 y 55 kD, el valor que más se aproxima es el de las “proteínas B”, aunque no sea muy exacto. Y por último, nos falta decir qué tipo de proteína son las “proteínas C”, pues corresponden a la albumina que utilizamos en la práctica 1.2, su peso molecular es de 66-70 kD, nuestro dato se sale un poco de lo esperado pero no es inconcluyente, así que podríamos decir que hemos conseguido, aproximadamente, enriqueces y purificar nuestras fracciones en inmunoglobulinas.
PRACTICA 2: Química Ácido-Base. Valoración pH-métrica
Tabla 3: En esta tabla quedan recogidos los diferentes pH que hemos obtenido tras añadir NaOH haciendo más básico el medio, y la relación moles de OH-^ y mol de aminoácido.
Gráfica 3: Esta gráfica representa la curva de titulación del pH de nuestro aminoácido problema, se va a usar para averigua qué aminoácido es el que hemos analizado. Nuestro frasco tenía la letra B. Podemos observar que desde el 0 hasta el 2 (moles de OH-/mol de aminoácido), no se produce mucha variación ni saltos de pH, por lo que deducimos que en ese rango debe de haber dos pKa. La primera está entre el 0 y el 1 (moles de OH-/mol de aminoácido), pues es donde se ha desprotonado un grupo del aminoácido (recordemos que un mol de OH-^ desprotona un mol de aminoácido), por lo que haciendo la media de los diferentes valores de pH en ese intervalo, obtenemos que la pKa 1 = 1,46. La segunda pKa, se encuentra en el intervalo del 1 al 2 (moles de OH- /mol de aminoácido) pues es donde se desprotonará otro grupo, y haciendo la media conseguimos una pKa 2 =3,20. Si seguimos es transcurso de la gráfica observamos que de 2 a 3 (moles de OH-/mol de aminoácido) hay otra vez una región en el que el pH no varía mucho, por lo que volvemos a deducir que hay otra pKa, la cual estimamos que es pKa 3 =10,10. En un primer análisis, no hay duda de que es un aminoácido ácido , por lo que o es el Ácido Aspártico (Asp) o el Glutámico (Glu). Según nuestros datos, podemos establecer que el punto isoeléctrico de nuestro aminoácido es pI=2,33. Al final se trata del Ácido Glutámico (pK α-COOH= 2,19; pK α-NH3+=9,67; pKR=3,86; pI=3,025)
PRACTICA 3: Actividad Butiril-colinesterasa de suero de caballo
Tabla 4.1 : Esta tabla recoge los datos de absorbancia que tenían nuestras muestras, los μmoles de producto que se han generado y los datos de la Enzima. La [producto] se ha averiguado a partir de
la fórmula que define a la absorbancia: [^ ]^ ⁄^ (ε=13,6mM-1·cm-1^ L=1cm) y como se sabía el volumen de TNB se saben sus moles a partir de la concentración hallada, que coinciden precisamente con los moles de producto, ya que por cada mol que se forma de TNB también se forma otro de producto. La actividad de la enzima en cada tubo se sabe porque sabemos que ésta tiene una actividad de 2,5U/mL.
Gráfica 4.1 : Esta gráfica representa la absorbancia frente a la actividad de la enzima, se ha realizado para saber la cantidad de enzima que necesitaremos para el siguiente experimento (30 μL) y para
TABLA 1 PRÁCTICA 1.
Nº
tubo
PROTEÍNA
Recta patrón
BSA
(μL)
Tris (μL)
NaOH 1M
React. 1 10 min
React. 2 20 min
DO 750
nm
Conc. (μL/mL)
1 BSA 1mg/mL 0 250 25μL 2 mL 225μL 0,000 0
2 BSA 1mg/mL 5 245 25μL 2 mL 225μL 0,101 20
3 BSA 1mg/mL^10 240 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,133^40
4 BSA 1mg/mL^20 230 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,179^80
5 BSA 1mg/mL^40 210 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,268^160
6 BSA 1mg/mL^60 190 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,341^240
7 BSA 1mg/mL^80 170 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,425^320
8 BSA 1mg/mL 100 150 25μL 2 mL 225μL 0,493 400
MUESTRA μL
Conc. Diluida (μg/mL)
Conc. No Diluida (μg/mL)
Media (μg/mL)
9 ST 1/150^250 -^ 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,342 249,4 37410
10 ST 1/300^250 - 25μL^2 mL^ 225μL^ 0,214 121,4 36420
11 F1 1/2^250 -^ 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,608 Este dato se sale de nuestra recta patrón
12 F1 1/4^250 - 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,289 196,4 785,
13 F2 1/30 250 - 25μL 2 mL 225μL 0,339 246,4 7392
14 F2 1/60 250 - 25μL 2 mL 225μL 0,846 Este dato se sale de nuestra recta patrón
15 F3 1/30^250 -^ 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,139 46,4 1392
16 F3 1/60^250 -^ 25μL^ 2 mL^ 225μL^ 0,322 229,4 13764
y = 0,001x + 0,
0
0,
0,
0,
0,
0,
0,
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Absorbancia
Concentración (μL/mL)
GRÁFICA 1 PRÁCTICA 1.
GRÁFICA 2 PRÁCTICA 1.
y = - 1,0217x + 2,
0
0,
1
1,
2
2,
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,
Log (Peso Molecular)
Rf
μL de NaOH Moles de OH-^ Moles de OH
- /mol de
TABLA 4.1 PRÁCTICA 3
TUBO ABS ABS corregida (ABS i-ABSB)
[TNB]=[Producto] (μM)
TNB=Producto (μmol) Enzima (μL) Enzima (U)
B 0,002 0 0 0 0 0
Absorvancia
y = 15,264x - 2, R² = 0,
y = 19,177x - 1, R² = 0,
y = 25,147x - 2, R² = 0,
y = 29,235x - 2, R² = 0,
y = 33,558x - 4, R² = 0,
y = 35,499x - 4, R² = 0,
y = 39,147x - 3, R² = 0,
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,
Sustrato Hidrolizado (nmol)
Tiempo (min)
GRÁFICA 4.2 PRÁCTICA 3
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Lineal (Tubo 1) Lineal (Tubo 2) Lineal (Tubo 3) Lineal (Tubo 4) Lineal (Tubo 5) Lineal (Tubo 6) Lineal (Tubo 7)
Tubo V 0 (nmol/min) [S] (mM) 1/v 0 (min/nmol) 1/[S] (mM-^1 )
1/Vo (min/nmol)
- TABLA 3 PRÁCTICA - 0 0 0 1, aminoácido pH de aminoácido - 100 0,00005 0,1 1,
- 200 0,0001 0,2 1,
- 300 0,00015 0,3 1,
- 400 0,0002 0,4 1,
- 500 0,00025 0,5 1,
- 600 0,0003 0,6 1,
- 700 0,00035 0,7 1,
- 800 0,0004 0,8 1,
- 900 0,00045 0,9 1,
- 1000 0,0005 1 1,
- 1100 0,00055 1,1 2,
- 1200 0,0006 1,2 2,
- 1300 0,00065 1,3 2,
- 1400 0,0007 1,4 2,
- 1500 0,00075 1,5 3,
- 1600 0,0008 1,6 3,
- 1700 0,00085 1,7 3,
- 1800 0,0009 1,8 3,
- 1900 0,00095 1,9 3,
- 2000 0,001 2 4,
- 2100 0,00105 2,1 4,
- 2200 0,0011 2,2 4,
- 2300 0,00115 2,3 5,
- 2400 0,0012 2,4 6,
- 2500 0,00125 2,5 8,
- 2600 0,0013 2,6 8,
- 2700 0,00135 2,7 9,
- 2800 0,0014 2,8 9,
- 2900 0,00145 2,9 9,
- 3000 0,0015 3 9,
- 3100 0,00155 3,1 9,
- 3200 0,0016 3,2 10,
- 3300 0,00165 3,3 10,
- 3400 0,0017 3,4 10,
- 3500 0,00175 3,5 11,
- 3600 0,0018 3,6 11,
- 3700 0,00185 3,7 11,
- 3800 0,0019 3,8 11,
- 3900 0,00195 3,9 12,
- 4000 0,002 4 12,
- 4100 0,00205 4,1 12, - GRÁFICA 4.1 PRÁCTICA - y = 2,7371x + 0, - R² = 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0, - TABLA 4.2 PRÁCTICA
- 1 0,125 0,045 0,097 0,148 0, Tubo [S] (mM) 1 min 2 min Abs 3min 4 min
- 2 0,250 0,062 0,127 0,191 0,
- 3 0,50 0,078 0,159 0,249 0,
- 4 1,00 0,094 0,187 0,284 0,
- 5 2,00 0,100 0,209 0,327 0,
- 6 4,00 0,109 0,223 0,344 0,
- 7 8,00 0,127 0,249 0,386 0, - Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo Tiempo (min) [TNB]=[Producto] (μM)
- 1 3,309 4,559 5,735 6,912 7,353 8,015 9,
- 2 7,132 9,338 11,691 13,75 15,368 16,397 18,
- 3 10,882 14,044 18,309 20,882 24,044 25,294 28,
- 4 14,779 18,971 24,485 28,897 32,426 34,632 38,
- 1 13,236 18,236 22,94 27,648 29,412 32,06 37, Tiempo (min) TNB=Producto (nmol)
- 2 28,528 37,352 46,764 55 61,472 65,588 73,
- 3 43,528 56,176 73,236 83,528 96,176 101,176 113,
- 4 59,116 75,884 97,94 115,588 129,704 138,528 154,
- TABLA 4.3 PRÁCTICA
- 15, - 0,125 0,065513627 8,
- 2 19,177 0,250 0,0521458 4,
- 3 25,147 0,50 0,039766175 2,
- 4 29,235 1,00 0,034205576 1,
- 5 33,558 2,00 0,029799154 0,
- 35, - 4,00 0,028169808 0,
- 7 39,147 8,00 0,025544742 0,
- GRÁFICA 4.4 PRÁCTICA - y = 0,005x + 0, - R² = 0,
- -0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- 0,
- -0,
- GRÁFICA 4.4 PRÁCTICA - y = 0,005x + 0, - R² = 0,
- -8 -6 -4 -2
TABLA 5 PRÁCTICA 6
Marcador PCR Peso molecular (pb)
Log (peso molecular)
Distancia recorrida (cm)
Distancia total (cm) Rf
Distancia recorrida (cm)
Distancia total (cm)
Rf
Log (peso molecular)
Peso molecular (pb) 1331 3,124 2,45 5,0 0,