PRACTICAS BIOQUIMICA, Ejercicios de Bioquímica

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PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA I

Grado en Biología

Cuaderno de Laboratorio

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PRÁCTICA 1

OBTENCIÓN DE EXTRACTO CELULAR DE HÍGADO DE TERNERA

Introducción

La purificación de una biomolécula es un proceso mediante el cual, partiendo de un material biológico (bien sea un tejido o bien un conjunto de células aisladas) en el que existen gran cantidad de distintos tipos de moléculas, se logra obtener una biomolécula en concreto separada de todas las demás. Todo proceso de purificación de biomoléculas consta de una serie de etapas que separan los diferentes componentes celulares o subcelulares con el fin de enriquecer el extracto resultante en la biomolécula o grupo de biomoléculas que nos interesan. Estas etapas son:

1.- Homogenización Proceso que consiste en la rotura de las membranas de las células para extraer su contenido. Existen distintos métodos para conseguir este objetivo, siendo el más utilizado la denominada “Homogenización mecánica”. En este método se utiliza un aparato llamado homogenizador o Potter que consiste en un recipiente de vidrio de paredes gruesas y un émbolo de teflón que se ajusta perfectamente a ese recipiente de vidrio y que va unido a su vez a un motor que lo hace girar a gran velocidad. Las células o tejido se introducen en el homogenizador junto con el tampón de homogenización, en el que van a quedar solubilizadas las biomoléculas una vez extraídas de las células. Se introduce el émbolo de teflón conectado al motor y se hace girar; las células quedan atrapadas entre el émbolo y las paredes del homogenizador produciéndose la rotura de las membranas por rozamiento. De esta forma se obtiene una suspensión denominada Homogenado, en la que tenemos distintos tipos de biomoléculas disueltas y también partículas y moléculas no solubles que se encuentran en suspensión en el tampón de homogenización.

2. Centrifugación Mediante la centrifugación se consigue la separación del material soluble del no soluble. Para ello se emplea un aparato denominado Centrífuga, que consta de un rotor que gira a altas velocidades aumentando así la fuerza de la gravedad y provocando la

• Tijeras, pinzas, rejilla de metal, placa Petri, filtro de gasa
• Tubos de centrífuga de baja velocidad, tubos Eppendorf, gradilla
• Pipetas de vidrio, automáticas y Pasteur
• Homogenizador Potter, centrífuga de baja velocidad
• Hígado de ternera (1 gr), hielo triturado

Reactivos

• Tampón de extracción (10 mM fosfato, 0,25 M sacarosa, pH 7,6)

Protocolo

1. Cortar el tejido en pequeños fragmentos sobre una placa Petri. Suspenderlo en 6 volúmenes de tampón de extracción y homogenizar frotándolo sobre la rejilla metálica y ayudándose de las pinzas. Posteriormente, triturar en un Potter dándole cuatro ciclos. Mantener los tubos en hielo, en los intervalos en los que no se estén manipulando, de ahora en adelante.

2. Centrifugar a 1.000 x g (3.000 r.p.m.) durante 10 minutos para sedimentar los núcleos. El sobrenadante se retira con la ayuda de una pipeta Pasteur (procurando no tocar los núcleos) y se deposita en tubo cónico de vidrio, pasándolo por el filtro de gasa para eliminar lípidos.
3. El extracto crudo obtenido (alrededor de 5 mL) se distribuirá en alícuotas de 50 μL y 1 mL,

en dos tubos Eppendorf, dejando el extracto sobrante en el tubo de donde se tomaron las alícuotas.

4. Los núcleos se resuspenden en 3 mL de tampón de extracción mediante una pipeta Pasteur, procurando manejarlos con suavidad y evitando que se formen burbujas, con el fin de que no rompan. Centrifugar de nuevo durante 10 minutos a 1.000xg. Eliminar el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación.

Resultado

1. Los tres tubos de extracto crudo y el tubo con los núcleos se congelarán a -20ºC, marcados exteriormente con el contenido y su volumen para que puedan ser identificados por el grupo que los obtuvo, con el fin de utilizarlos en las siguientes prácticas.

PRÁCTICA 2.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO

DE LOWRY

Introducción

Reactivos

- Reactivo A de Lowry: las disoluciones siguientes ya están previamente preparadas: - disolución a : carbonato sódico al 3% (P/V) en NaOH 0,1 N. - disolución b : sulfato de cobre pentahidratado al 2 % (P/V). - disolución c : tartrato sódico al 4 % (P/V). ● Justo antes de su uso se mezclan las disolución.es anteriores en las proporciones siguientes: 98 mL de a + 1 mL de b + 1 mL de c. La mezcla se hace en el matraz aforado (o en la probeta) enrasando con la disolución a después de haber añadido las otras dos disoluciones.

• Reactivo B de Lowry: se prepara justo antes de su uso por dilución al 50 % en agua del reactivo de Folin-Ciocalteau.
• Disolución patrón: disolución en agua de la proteína seroalbúmina bovina (BSA) a una concentración de 1 mg/mL.
• Disolución proteína problema (M): la alícuota de 50 μL de extracto de hígado se diluye 1:20 en agua.

Protocolo

1. Preparar los tubos añadiendo primero la BSA patrón (tubos 1 a 4) y la disolución de proteína problema (tubos M1 y M2), a los tubos correspondientes, en las cantidades que se indican en la tabla. A continuación se añade el agua a cada tubo, para equilibrar todos los tubos a un volumen final de 1 mL.

Tubo Muestra (mL) (^) μg de proteína H 2 0 (mL) Absorbancia B ------------------ 0 1, 1 0,1 100 0, 2 0,2 200 0, 3 0,3 300 0, 4 0,4 400 0, M1 0,1 -------------------- 0, M2 0,2 -------------------- 0,

2. Añadir 5 del Reactivo A de Lowry (solución alcalina de cobre) preparado justo antes.
3. Agitar y dejar incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Añadir a cada tubo 0,5 mL del Reactivo B de Lowry (reactivo de Folin diluido ½) y agitar vigorosamente.
5. Incubar al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
6. Leer la absorbancia a 620 nm, ajustando el espectrofotómetro a 0 con el blanco (tubo B).

Resultados

1. Representar gráficamente (en papel milimetrado), realizando una recta de calibrado, los resultados correspondientes a los tubos 1, 2, 3 y 4. En el eje X se representan los mg de proteína que hay en cada tubo (0,1 a 0,4 mg), y en el eje Y los valores de absorbancia obtenidos para cada uno.
2. Para calcular la cantidad de proteína presente en los tubos problema se hallará primero la media aritmética de las absorbancias obtenidas con los tubos M1 y M2, teniendo en cuenta las diferencias de volumen de muestra en ambos tubos, es decir: Abs M1 + Abs M 2

“absorbancia M media” =

En esta práctica se pretende la extracción y purificación rápida del DNA genómico, de una muestra de núcleos de hepatocitos de cerdo, mediante separación simple con disolventes orgánicos. El DNA se visualizará mediante electroforesis en geles de agarosa, con el fin de observar el tamaño de las moléculas teñidas con el agente intercalante bromuro de etidio. Por último, se realizará una prueba de determinación del efecto hipercrómico, que permita determinar cuándo las moléculas de ácidos nucleicos están desnaturalizadas y cuándo no.

Materiales

• Núcleos de hígado de ternera congelados.

-Tubos Eppendorf, pipetas de vidrio aforadas, Pasteur y automáticas, guantes de látex.

• Microfuga, vórtex, baño termostatizado, estufa, microondas, carcasa de electroforesis, fuente de alimentación.
• Fuente de luz UV, espectrofotómetro y cubetas de medida de plástico y de cuarzo.

Reactivos

- Tampón de lisis nuclear (10 mM Tris pH 8, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 2 % SDS).

• Fenol:cloroformo (1:1)
• Etanol 96 %.
• Tampón TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8).
• Tampón TAE (0.04 M Tris-acetato pH 8, 1 mM EDTA pH 8).
• Tampón de carga de electroforesis 6 X (0.2 5% azul de bromofenol, 0.25 % xileno cianol, 30 % glicerol)
• Agarosa
• Bromuro de etidio (10 mg/mL).

Protocolo 1

a) Preparación de geles de agarosa al 0,8%

1. Se pesan 0.8 g de agarosa y se añaden a 100 mL de TAE 1 X; calentar en microondas para disolver (fundir) la agarosa.
2. Una vez fundida, añadir bromuro de etidio a una concentración final de 0.5 μg/mL ( Nota:

el bromuro de etidio es una sustancia altamente tóxica por sus características mutagénicas, de modo que debe manejarse siempre con guantes, con suma precaución y controlando siempre qué material ha estado en contacto con esta sustancia ), y agitar suavemente. Dejar enfriar un poco y verter la mezcla sobre el soporte del gel, poniendo a continuación el peine. Dejar solidificar con cuidado de no moverlo.

b) Extracción de DNA de hígado de ternera

1. Descongelar los núcleos sobre hielo (volumen aproximado = 500 μL), y añadir 10

volúmenes de tampón de lisis nuclear. Agitar vigorosamente en el vórtex durante 3 minutos e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

2. Recoger una alícuota de 150 μL del homogenado por alumno y pasarlo a un tubo Eppendorf.
3. Añadir un volumen de fenol:cloroformo (1:1) ( Nota: el fenol es irritante, usar guantes hasta el paso 6 ), y agitar durante 1 minuto.
4. Microfugar 10 minutos para separar la fase fenólica inferior de la fase acuosa superior que contiene el DNA.
5. Recoger la fase acuosa, con mucho cuidado de no tocar la interfase blanca, y pasarla a otro tubo Eppendorf limpio.

Resultado 2

MUESTRA M1 M2 M

ABSORBANCIA a

260 nm

PRÁCTICAS DE ENZIMOLOGÍA

Introducción

Salvo la excepción de un pequeño número de moléculas de RNA con actividad catalítica ( ribozimas ), información importante desde el punto de vista evolutivo, casi todas las enzimas son proteínas. Su actividad catalítica, superior a la de los catalizadores inorgánicos, depende de la integridad de su conformación proteica, por lo que funcionan generalmente en soluciones acuosas y en condiciones suaves de temperatura y pH. En la naturaleza, es clave también la posibilidad de que esta actividad sea regulada en el metabolismo. Es muy importante considerar el aspecto biomédico ya que la mayor parte de fármacos, por el momento, son inhibidores de enzimas. Las enzimas se clasifican según las reacciones que catalizan distribuyéndose en seis clases, cada una de ellas con diferentes subclases: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Las enzimas aumentan la velocidad de la reacción disminuyendo la energía de activación, pero no modifican los equilibrios de la reacción. Los incrementos selectivos de la velocidad de reacción se explican por la reordenación de los enlaces, covalentes y no covalentes, que acontecen durante la reacción cuando ocurren las interacciones, generalmente débiles, entre el enzima y el sustrato. Las interacciones débiles en el complejo enzima-sustrato, son también las que confieren especificidad a cada enzima por su sustrato. Necesitamos conocer la cinética de las reacciones enzimáticas por dos motivos: En la naturaleza, nos ayuda a comprender los fenómenos biológicos, cuál es el mecanismo de acción de los enzimas. Desde el punto de vista práctico, nos ayuda a precisar las condiciones adecuadas para definir las unidades de actividad enzimática y poder establecer comparaciones entre los enzimas y/o sustratos y moléculas efectoras/reguladoras.

La fosfatasa ácida

Las fosfatasas son enzimas bastante inespecíficas que catalizan la reacción de hidrólisis de un enlace fosfoéster presente en cualquier molécula (reacción contraria a la de las quinasas), dando como productos un alcohol y el grupo fosfato (inorgánico) libre. fosfatasa X- O-P + H 2 O X- OH + Pi

Enlace fosfoéster

Son por tanto hidrolasas, y constituyen la primera subclase de la tercera familia de enzimas (EC 3.1). Al igual que sucede con todas las enzimas, la actividad de las fosfatasas se encuentra modulada por el pH, distinguiéndose por esta causa dos grandes grupos:

• Fosfatasas ácidas (FAC): presentan una actividad máxima a pH ácido, y se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente altas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas.
• Fosfatasas alcalinas: presentan una actividad máxima a pH básico y están presentes sobre todo en vesícula biliar e hígado.

La importancia clínica de estas enzimas se debe a que niveles elevados de fosfatasas ácidas en el plasma o suero se encuentran en alteraciones prostáticas como hipertrofia, prostatitis o carcinoma, en enfermedades hematológicas, óseas (enfermedad de Paget) o hepáticas, y por ejemplo el carcinoma prostático con metástasis, metástasis óseas osteolíticas o leucemias linfoblásticas se diagnostican con esta medida, mientras que niveles altos de fosfatasa alcalina diagnostican ictericia obstructiva, oclusión del ducto común de la bilis y el hígado, y cirrosis.

Los estudios de esta práctica utilizan fosfatasa ácida procedente de un extracto hepático, así como el sustrato sintético, no biológico, p-nitrofenilfosfato. Todos los datos que obtengamos en las prácticas serán para este sustrato, y habría que calcular los mismos datos para cada uno de los sustratos. Pero los datos obtenidos ya sirven para poder comparar las propiedades de los diferentes sustratos y efectores. El p-nitrofenilfosfato (pNFP) es una molécula que presenta un enlace fosfoéster que puede ser hidrolizado por el enzima para dar p-nitrofenol (el pNF) y fosfato libre, como se aprecia en la figura.

• Km para el sustrato (para saber aproximadamente la cantidad de S, en saturación, que debemos usar en la reacción
• pH y temperatura óptimos para la reacción
• Método analítico que nos permita cuantificar la aparición de P o la desaparición de S en un tiempo t , es decir la velocidad de reacción. La técnica analítica más frecuente es la espectrofotométrica, que nos permite determinar la absorbancia de una muestra (en disolución) y, según la ley de Beer-Bougher-Lambert, relacionarla con la concentración de una sustancia en la disolución.

Objetivo

En nuestra práctica, para poder relacionar la intensidad del color amarillo con la cantidad de p-nitrofenol formado, es necesario realizar previamente una recta de calibrado o recta patrón con cantidades conocidas y crecientes de p-nitrofenol (de forma similar a lo ya realizado en otras prácticas).

• Respecto al t , se debe considerar un tiempo inicial (para obtener una v 0 , velocidad inicial ), donde no haya interferencias en la medida debido a consumo de S, cambios de pH que afecten a la E, aparición de inhibidores, u otros factores. Hay dos métodos:

• Método sencillo, medida a punto final : Se deja transcurrir la reacción durante un tiempo determinado (corto), al cabo del cual se valora la cantidad de S consumido o P generado y se divide entre el tiempo transcurrido.
• Método contínuo, medida cinética : La desaparición de sustrato o la aparición de producto se valora de forma continuada en el tiempo, y la pendiente de la curva obtenida en la representación de los datos se corresponde con la velocidad de la reacción.

Con el dato de actividad enzimática se determina también la actividad específica de una enzima, U/mg , el número de unidades de actividad enzimática por mg de E, o, según el SI, Kcat/Kg , el número de kilocatales por kilo de E.

Objetivo

En nuestra práctica vamos a cuantificar la actividad de una fosfatasa ácida (FAC) de un extracto hepático, por tanto la actividad enzimática y la actividad específica se referirán a mg de proteína del extracto, medida en la práctica anterior.

Protocolo 1. Construcción de la recta de calibrado

1.1.-Preparar una batería de 8 tubos, y añadir los reactivos en el orden y volumen que sigue:

Tubos Blanco^1 2 3 4 5 6 pNF 0,5 mM (mL) ---- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0. Tampón (mL) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0. NaOH (mL) 5 5 5 5 5 5 5 5

1.2.-Mezclar bien los tubos.

1.3.-Leer las absorbancias a 420 nm en el espectrofotómetro, ajustando la absorbancia a 0 con el blanco (tubo B) en la siguiente tabla, para su posterior representación gráfica.

Tubos Blanco^1 2 3 4 5 6 Absorbancia 420 nm

Protocolo 2. Cuantificación de la actividad fosfatasa ácida en un