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REPORTE DE PRÁCTICA 6:
Determinación de la velocidad inicial de reacción de la enzima a-amilasa
(EC 3.2.1.1) y de la actividad específica
Laboratorio de Tecnología enzimática
Profesor: Dra. Yuridia Mercado Flores
ID: 147654 Grupo:BIOL 04_
Fecha: 03 de marzo del 2026 Núm. de equipo: 1
Nombre de los integrantes de equipo
1. Fierro Jímenez María Elena
2. Miranda Guerrero Alexa Daniela
3. López García Maria Fernanda
4. Ureña Rosales Dilan
Objetivo Determinar la velocidad inicial de reacción y la actividad específica de la a-amilasa, mediante la cuantificación del producto formado en función del tiempo, para caracterizar su desempeño enzimático bajo condiciones experimentales controladas.
Esquema general de trabajo- Determinación de la velocidad inicial y actividad específica de α-amilasa
Resultados
Se evaluó la actividad enzimática mediante la cuantificación de azúcares reductores
liberados durante la hidrólisis del sustrato, midiendo la absorbancia a la longitud de
onda correspondiente. Las lecturas se realizaron a 5, 7.5 y 10 minutos de reacción.
Las absorbancias obtenidas fueron transformadas a concentración utilizando la
ecuación de la curva de calibración, permitiendo determinar la cantidad de producto
formado en μmoles por mililitro y posteriormente calcular la actividad enzimática
(MU/mL) y la actividad específica (MU/mg de proteína).
Tabla 1. Actividad enzimática (mU/mL) y Actividad específica (mU/mg) en
función del tiempo.
Tiempo (min) Absorbancia μmoles/mL mU/mL Act.
específica
(mU/mg)
Actividad enzimática
Tiempo
(min)
mU/mL
La velocidad inicial (V₀), correspondiente al comportamiento lineal inicial, fue de 7.
MU/mL. Este valor representa la eficiencia catalítica bajo las condiciones
experimentales establecidas.
Respecto a la actividad específica, el valor inicial obtenido fue de 0.206 MU/mg de
proteína. Este valor indica que el extracto enzimático utilizado corresponde a un
extracto crudo, ya que la enzima de interés no se encuentra completamente
purificada y comparte el medio con otras proteínas no catalíticas.
En términos generales, los resultados muestran el comportamiento típico de una
reacción enzimática: una fase inicial de incremento rápido en la formación de
producto, seguida de una tendencia hacia la estabilización conforme avanza el
tiempo de reacción.
Discusión
La determinación de la velocidad inicial de una reacción enzimática constituye un parámetro fundamental para caracterizar la actividad catalítica de una enzima. Durante las primeras etapas de la reacción, la velocidad de formación de producto es proporcional a la concentración de enzima activa y el sustrato se encuentra en exceso, por lo que la velocidad medida refleja de manera más precisa la eficiencia catalítica del sistema enzimático (Segel, 1993). En este contexto, la α-amilasa cataliza la hidrólisis de enlaces α-1,4-glucosídicos presentes en polisacáridos como el almidón, generando azúcares reductores como maltosa y glucosa (Nelson & Cox, 2017).
En los resultados obtenidos se observó un incremento significativo en la absorbancia entre los 5 y 7.5 minutos de reacción, lo que indica una mayor liberación de azúcares reductores conforme transcurre el tiempo de incubación. Este comportamiento es consistente con el mecanismo de acción de las amilasas, enzimas hidrolíticas que actúan sobre el almidón liberando progresivamente productos de menor peso molecular detectables mediante métodos colorimétricos (Bernfeld, 1955). El aumento en la concentración de producto formado durante este intervalo refleja una fase activa de la reacción donde el sustrato aún se encuentra disponible en cantidades suficientes para mantener una elevada velocidad catalítica.
Sin embargo, hacia los 10 minutos de reacción se observó una ligera disminución en la actividad enzimática calculada, pasando de 16.01 mU/mL a 15.84 mU/mL. Este comportamiento puede explicarse por diversos factores asociados a la cinética enzimática. Conforme avanza la reacción, la concentración de sustrato disminuye y los productos generados pueden comenzar a interferir con la actividad catalítica, lo que provoca una reducción gradual en la velocidad de reacción. Además, es posible que ocurra una inactivación parcial de la enzima debido a condiciones experimentales como cambios en el pH, temperatura o acumulación de productos de reacción (Berg, Tymoczko & Gatto, 2019).
Por otra parte, el cálculo de la actividad específica permitió relacionar la actividad catalítica con la cantidad de proteína presente en la muestra. Este parámetro es ampliamente utilizado como indicador del grado de pureza de una preparación enzimática, ya que aumenta conforme se eliminan proteínas contaminantes durante los procesos de
purificación (Nelson & Cox, 2017). En este caso, el valor relativamente bajo de actividad específica obtenido sugiere que el extracto utilizado corresponde a un extracto crudo, en el cual la α-amilasa se encuentra mezclada con otras proteínas que no participan directamente en la reacción catalítica.
En conjunto, los resultados obtenidos reflejan el comportamiento típico de una reacción enzimática descrito por la cinética de las enzimas: una fase inicial en la que la velocidad aumenta rápidamente debido a la abundancia de sustrato, seguida de una etapa donde la velocidad comienza a estabilizarse conforme el sustrato disminuye o se acumulan productos de reacción. Este patrón ha sido ampliamente descrito en estudios clásicos de cinética enzimática y constituye la base para el análisis cuantitativo de la actividad de enzimas hidrolíticas como la α-amilasa (Segel, 1993; Berg et al., 2019).
Conclusión
En esta práctica se determinó la velocidad inicial de la α-amilasa al evaluar la formación de producto en función del tiempo, identificando la fase lineal de la reacción. Además, mediante el método de Lowry se cuantificó la proteína presente en la muestra, lo que permitió calcular la actividad específica de la enzima. Con ello se logró caracterizar su desempeño catalítico bajo condiciones controladas.
Referencias bibliográficas
Bernfeld, P. (1955). Amylases, α and β. Methods in Enzymology, 1, 149–158. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5�
Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Gatto, G. J. (2019). Biochemistry (9th ed.). W. H. Freeman and Company.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193(1), 265–275.
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2017). Lehninger Principles of Biochemistry (7th ed.). W. H. Freeman and Company.
Segel, I. H. (1993). Enzyme kinetics: Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. Wiley.
