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9: Microscopía y sus usos en biología molecular y celular
Repaso
● Lente simple: el aparato se compone de una única lente. El microscopio de Anton van Leeuwenhoek era de este tipo, alcanzaba una magnificación de 200 veces (más poderoso que los que otros hicieron en su mismo tiempo) y resolvía los problemas de aberraciones al tener un sólo lente. ● Lente compuesta: se compone de dos lentes, el objetivo y el ocular. La primera genera una magnificación, haciendo que se produzca una imagen real del objeto. La segunda lente la transforma en una imagen virtual, que es la que ve el observador. De esta manera, la magnificación total del objeto de interés se calcula como el producto de la magnificación de ambas lentes. ● Naturaleza dual de la luz: cuando la luz se comporta como onda, se generan efectos de interferencia y difracción (importantes en los límites de resolución). Cuando la luz se comporta como partícula, nos interesa entender su interacción con los detectores y la muestra. ● Aberraciones cromáticas (luz como onda): cuando la luz cambia de medio, se refracta con distinto ángulo, por lo que, esto hace que se separen los rayos y se enfoquen en puntos distintos. Como resultado, se crean franjas de color alrededor de los bordes de los objetos. Es posible corregir la aberración cromática construyendo lentes complejos, como por ejemplo con lentes acromáticas. ● Aberraciones esféricas: ocurren cuando los rayos de luz que pasan a través de una lente no se enfocan en un único punto ya que los rayos que están más alejados del eje óptico se enfocan más cerca del lente que los que están más cerca del eje. Esto genera una imagen poco nítida o distorsionada, pero que se puede corregir mediante el uso de lentes asféricos. Los microscopios ópticos están diseñados de modo que las aberraciones cromáticas y esféricas no ocurran. ● Profundidad de campo: es, en el plano del objeto, todas aquellas cosas que están dentro del foco de nuestro lente. Es decir, es la parte de la imagen que podemos ver nítida o enfocada. Explicación más detallada en: Técnica Fotográfica: Profundidad de campo y profundidad de foco ● Profundidad de foco: es en el plano imagen, todo el espacio que hay que poner la pantalla y levantar la imagen un poco. La profundidad de foco mide la mayor o menor dificultad para realizar el enfoque. Si hay poca profundidad de foco, significa que rápidamente empezaremos a ver borroso, por tanto nos será más sencillo enfocar. Si la profundidad de foco es mayor, tardaremos más en observar el desenfoque y nos costará más enfocar. Es decir que, en este caso, cuanto peor, mejor. Por tanto la profundidad de foco hace referencia al desplazamiento del plano focal necesario para que podamos apreciar la falta de nitidez. ● Distancia focal ● Índice de refracción: la capacidad de un material para alterar la velocidad de la luz. ● Hook: construyó un microscopio óptico compuesto con una magnificación de 30x (1665). ● Leeuwenhoek: construyó un microscopio óptico de una sola lente y logró ver bacterias. También es de los primeros que explora técnicas de tinción utilizando azafrán en fibras musculares (1719).
● Microscopio: es la herramienta que permite observar y estudiar los microorganismos. Todos los microscopios utilizan lentes que amplifican la imagen, sin embargo, el factor limitante de nuestra capacidad de ver objetos pequeños no es el aumento, sino la resolución. ○ Microscopio invertido: el ocular está debajo de la muestra y la fuente de luz por encima. Se utiliza para observar cultivos, ya que son menos sensibles a las vibraciones por su bajo centro de masa. ● Resolución : la resolución es la capacidad de identificar dos objetos adyacentes como distintos e independientes. Uno puede aumentar ilimitadamente el aumento, pero con la resolución no ocurre lo mismo, ya que es función de las propiedades físicas de la luz. El límite de resolución de un microscopio óptico es de aproximadamente 240 nm, que se logra con un aumento de 1500x. Esto significa que dos objetos que están más cerca entre sí que 240 nm no se pueden resolver como distintos y separados. Es fundamental lograr una resolución adecuada en la microbiología porque permite obtener toda la información posible de los objetos de interés. ● Apertura numérica (NA): es un número adimensional que caracteriza el rango de ángulos para los cuales el sistema acepta luz, es decir, da una idea de la capacidad de captar luz que tiene una lente. Queda definido por NA = n * sin θ, donde n es el índice de refracción del medio en el que se encuentra la lente, y θ es la mitad del ángulo de aceptancia máxima que puede entrar o salir de la lente. La apertura numérica indica el poder de resolución de una lente, donde a mayor apertura numérica, mayor poder de resolución. La distancia mínima entre dos objetos que puede distinguir el microscopio es proporcional a 0,5λ/AN, donde λ es la longitud de onda de la luz empleada. La resolución máxima se alcanza cuando se utiliza luz azul para iluminar la muestra (ya que la luz azul tiene la longitud de onda más corta del espectro visible) y se utiliza un objetivo con gran apertura numérica (la cual se modifica en base a la densidad del medio). ● Objetivos: están compuestos por muchos lentes a modo de minimizar aberraciones. El cubreobjetos introduce aberraciones esféricas que son corregidas por el objetivo. Otra parte de las aberraciones se compensan en la lente de tubo o en el ocular. El objetivo de inmersión es el de 100x, ya que se requiere colocar una sustancia de mayor densidad de modo que los rayos que inciden, se refractan con un menor ángulo (ley de Snell). Dado que el aceite tiene mayor índice de refracción, permite que algunos ángulos que no alcanzaban a impactar el objetivo, sí lo hagan con la disminución del ángulo de refracción. Al refractar mayor cantidad de rayos, se aumenta la resolución.
Tipos de microscopios
● Óptico: utiliza luz visible para iluminar las estructuras celulares, la cual se enfoca en estas gracias a un condensador. El funcionamiento del microscopio óptico se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten modificar la dirección de los rayos de luz. Los microscopios ópticos vienen con un foco de luz y un condensador, que focaliza la luz hacia la muestra. Luego, el diafragma se ocupa de regular la cantidad de luz que incide sobre la muestra. Límite de resolución: 1500x.
para tejidos gruesos y densos), genera menor fotoblanqueamiento ( photobleachin g) de los fluoróforos que el confocal o campo amplio. Esto se debe a que se excita sólo el punto de enfoque donde los fotones coinciden, el resto del haz de luz pasa por la muestra sin causar excitación. Estas características hacen que la técnica sea adecuada para trabajar in vivo , aunque se debe tener cuidado porque los haces de infrarrojo pueden ser dañinos para los tejidos si se utilizan de forma inadecuada.
- Light sheet microscopy (LaISIM): técnica de visualización vistosa diseñada para trabajar con muestras grandes y voluminosas. Consiste en enfocar el haz de excitación en un plano de la muestra, no en un punto. A diferencia de otros sistemas de microscopía donde la luz de excitación y la de emisión viajan a través del mismo objetivo, en LaISIM, la luz de excitación incide en un sentido y el objetivo que conecta la fluorescencia lo hace en un sentido perpendicular. Luego, para obtener una visión completa de la muestra, se puede la va girando mientras se obtienen imágenes, permitiendo la reconstrucción de todo el espacio. Para esto, generalmente se utilizan objetivos con baja apertura numérica (permite trabajar a grandes distancias de la muestra). Es una técnica compatible con otras y puede utilizarse, por ejemplo, en combinación con el cubics expansion (una técnica de magnificación física). Al usar LaISIM en la matriz expandida que resulta de esta técnica, es posible resolver relaciones de distancias de fluoróforos que en el tejido original habrían estado demasiado cerca para ser resueltas con un microscopio óptico. ● Electrónico: utiliza electrones en lugar de luz visible (fotones) para generar imágenes de células y estructuras celulares. Las lentes son electromagnéticas y todo el equipo trabaja en un sistema de vacío. Límite de resolución: 1.000.000x, 0,3 nm. ○ De transmisión (TEM): se constituye a partir de un cañón que emite electrones, los cuales pasan por las lentes electromagnéticas que producen un campo electrostático para condensar el haz de electrones. Luego ese haz atraviesa la muestra y pasa por otras lentes intermedias hasta ser enfocada en una pantalla fluorescente para ser registrada por una cámara (la parte clara es atravesada por el haz y en la parte oscura se impide el paso de los electrones). Tiene un gran poder de resolución y permite incluso ver estructuras a escala molecular , como los poros nucleares o la cápside de un virus. Esto es debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho más corta que la de la luz visible. Sin embargo, a diferencia de los fotones, los electrones tienen muy poco poder de penetración, incluso una sola célula es demasiado gruesa para atravesar con un haz de electrones. Por lo tanto, para observar la estructura interna de la célula hay que hacer cortes muy finos ( nm, se cortan con un microtomo), estabilizar la muestra y teñirla. Algunas tinciones comunes son las de ácido cósmico, permanganato, sales de uranio, plomo o lantano. Es decir, sustancias con gran peso atómico y que desvían los electrones, mejorando el contraste. ○ De barrido (SEM): para obtener una imagen tridimensional de la muestra. La muestra se barre con una capa fina de un metal pesado, normalmente oro. Luego, un haz de electrones barre continuamente la muestra. Los electrones son desviados por la capa de metal y recogidos y proyectados en un monitor para producir una imagen. Tiene una mayor profundidad de campo (es decir, la porción de la imagen que queda enfocada es mayor). Se puede obtener un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta 100,000, pero normalmente solo se visualiza la superficie del objeto.
Microscopía de fluorescencia
● Estados fundamentales y excitados: describen los niveles de energía que ocupan los electrones de una molécula, el estado fundamental es el estado de energía basal de los electrones de una molécula; mientras que el estado excitado es un estado de mayor energía al que pueden pasar ciertos electrones. Los electrones,
especialmente aquellos que se encuentran más deslocalizados, pueden ser excitados para pasar del estado fundamental a estados excitados. Para lograr la excitación, se le debe otorgar energía a la molécula, lo cual se hace generalmente a través de un fotón. Es crucial que la energía otorgada tenga la cantidad específica para que el electrón pueda realizar el pasaje. Esta energía específica está relacionada con la longitud de onda (λ) del fotón: si la energía del fotón no es la necesaria para alcanzar un nivel excitado (como λ1 o λ2), la energía no es absorbida. Una vez en estado excitado, el electrón decae espontáneamente. Este decaimiento puede ocurrir de diversas formas. El decaimiento que resulta en fluorescencia es aquel donde la molécula libera un fotón. ● Rendimiento cuántico de fluorescencia (eficiencia cuántica): es un parámetro esencial utilizado para evaluar y considerar qué tipo de fluoróforo es apropiado para una técnica específica. El rendimiento cuántico se define como la cantidad de fotones emitidos por la molécula en relación con la cantidad de fotones absorbidos, y representa la medida de cuánto de toda la energía que se entrega es devuelta mediante una emisión radiactiva. Los investigadores buscan que los fluoróforos tengan un muy buen rendimiento cuántico , ya que a mayor cantidad de electrones que, al recibir energía, devuelven un fotón, mejor será la señal que se obtendrá y se podrá registrar. El concepto de brillo de un fluoróforo se considera dependiente de esta eficiencia cuántica. Por ejemplo, la eficiencia cuántica de la proteína fluorescente verde (GFP) es muy alta, cercana a 0.8 (el máximo es 1), y la estabilidad que ofrece el barril hidrofóbico de su estructura es lo que permite esta alta eficiencia y resistencia. ● Fotoblanqueo ( photobleaching o fotólisis): es un fenómeno que ocurre en los fluoróforos cuando son sometidos a una excitación intensa o permanente, lo que provoca su destrucción o agotamiento. A veces puede ocurrir un cambio conformacional, consecuente de esta excitación intensa, que provoca que los electrones deslocalizados dejen de estarlo, y la molécula ya no tenga las condiciones necesarias para fluorescer, por lo que no fluorecerá nunca más ( se desgasta el fluoróforo ). La GFP, gracias a la estabilidad de su barril hidrofóbico, es bastante resistente al photobleaching. ● Corrimiento de Stokes: principio clave en la caracterización y evaluación de la utilidad de un fluoróforo, que está vinculado con los solventes y, fundamentalmente, con el entorno de la molécula fluorescente. El entorno es importante porque si se cambia, la fluorescencia se desplaza en función de la polaridad del solvente. Por lo que mantener el ambiente del fluoróforo estable es crucial para que la fluorescencia ocurra y sea reproducible. Este
● Estructuras moleculares para lograr fluorescencia: ○ Fluoróforo: es la molécula, o parte de una molécula, que tiene la capacidad de emitir luz por fluorescencia al ser excitada. El fluoróforo absorbe un fotón que debe tener una cantidad específica de energía (determinada por su longitud de onda). Esto eleva el electrón del estado fundamental a un estado excitado. Posteriormente, el electrón decae espontáneamente y libera la energía extra en forma de un fotón (emisión radiactiva, o fluorescencia). Para elegir un fluoróforo adecuado para una técnica, se evalúan parámetros como su espectro de absorción, espectro de emisión, tiempo de vida, y eficiencia cuántica. En la GFP, la fluorescencia no parte de un aminoácido en particular, sino de la construcción auto catalítica de un compuesto que se forma en el centro de su barril hidrofóbico. Este compuesto se forma a partir de tres aminoácidos específicos. Este proceso es una maduración post-traduccional que puede tardar aproximadamente 100 minutos. Hay dos tipos de fluoróforos: ■ Intrínsecos: aquellos que la muestra ya posee, como el aminoácido tirosina. ■ Extrínsecos: aquellos que se incorporan externamente. Ejemplos: moléculas orgánicas (como Alexa o Bodipy, que son moléculas aromáticas), proteínas fluorescentes (como la GFP), y quantum dots (estructuras sintéticas). ○ Cromóforo/fluorocromo: es la parte de la molécula que absorbe el paquete de energía. ○ Sondas: se refiere a herramientas moleculares o fluoróforos que han sido diseñados o conjugados para detectar un blanco específico, a menudo utilizando el fenómeno de quenching fuera del contexto de la microscopía. Las sondas pueden usarse en ensayos donde el fluoróforo está posicionado cerca de un quencher (molécula apagadora). Esta proximidad hace que el fluoróforo no florezca porque su energía es transferida al quencher (transferencia no radiactiva). Pero si una polimerasa interactúa con la sonda y la rompe, el fluoróforo se libera de la proximidad del quencher y, al separarse, comienza a florecer. La aparición de esta fluorescencia permite, por ejemplo, ver qué base nitrogenada está presente o cuantificar secuencias. Las sondas pueden ser fluoróforos que se utilizan para marcar moléculas de interés (ya sea directamente, o a través de anticuerpos primarios o secundarios asociados al fluoróforo).
● Inmunofluorescencia: es una técnica que utiliza la fluorescencia para visualizar o cuantificar una molécula biológica (generalmente una proteína o antígeno) dentro de una célula o tejido, basándose en la alta especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo. Hay dos formas de utilizarlos, pero independientemente de la estrategia, las moléculas de interés deben ser marcadas con un fluoróforo extrínseco. Hay dos formas de hacer esto: ○ Marcado indirecto: es una estrategia donde se utilizan anticuerpos secundarios y es más común y flexible, análoga a la marcación indirecta en Western Blot, pero adaptada para la visualización por microscopía. Esta estrategia amplifica la señal, ya que múltiples anticuerpos secundarios fluorescentes pueden unirse a un solo anticuerpo primario. Los pasos son:
- Se marca la molécula de interés utilizando un anticuerpo primario específico.
- Se añade un anticuerpo secundario que está marcado fluorescentemente, es decir, conjugado a un fluoróforo. Este anticuerpo secundario se asocia con el anticuerpo primario. ○ Marcaje directo: el anticuerpo primario se une directamente al fluoróforo, simplificando el proceso. ● Estudios de interacción: los estudios de interacción que utilizan técnicas de fluorescencia aprovechan las propiedades físicas de los fluoróforos (como la emisión de luz, la transferencia de energía o el movimiento) para determinar si dos moléculas están asociadas, cercanas o si su dinámica cambia en respuesta a un factor externo. ○ Estudios de proximidad basados en transferencia de energía: se centran en la distancia física entre dos moléculas, aprovechando el fenómeno de la transferencia de energía no radiactiva:
- FRET (Transferencia de energía por resonancia de Förster): permite evaluar si un fluoróforo (el dador) y su quencher (el aceptor) están lo suficientemente cerca. Para que FRET ocurra, el perfil de emisión del dador debe superponerse con el perfil de absorción del aceptor. Si se cumplen las condiciones y la distancia es suficientemente corta, el fluoróforo excitado transfiere energía al aceptor por resonancia. Este ensayo se puede utilizar para evaluar la asociación entre moléculas (como una enzima y su sustrato) debido a la cercanía. También permite observar cambios conformacionales , como el acercamiento de dos fluoróforos vinculados que se produce al agregar calcio, lo que activa la transferencia de energía y la emisión del aceptor. Además, puede ayudar a diferenciar la cercanía en la asociación entre pequeños fragmentos de ADN/ARN y una molécula de ARN mensajero.
enfoque. Esta acción provoca el fotoblanqueo de todos los fluoróforos ubicados dentro de esa zona plasmática específica. Después de la pérdida de fluorescencia en la región fotoblanqueada, se observa una “recuperación” de la fluorescencia (vuelve a fluorescer esa zona). Esto se explica no porque las proteínas agotadas se recuperaron (estas se consideran muertas o “quemadas”), sino porque ocurrió la migración de nuevas proteínas desde el citoplasma hasta la región afectada. ● GFP: se forma espontáneamente por autocatálisis a partir de tres aminoácidos (Ser65, Tyr66 y Gly67) en un proceso de maduración post-traduccional. Luego de que ocurre esto, puede fluorescer. La ventaja de usar esta sonda es que no requiere de cofactores ni sustrato para poder fluorescer. Sin embargo, la desventaja es que el proceso de maduración puede ser lento.
