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Resumen tema 1: Tecnicas para microscopía
Técnicas para MO
Objetivo: Identificar, localizar y cuantificar moléculas o estructuras en tejidos (histoquímica) o en células (citoquímica).
Conceptos a conocer: Tinción no selectiva, tinción selectiva, enzimohistoquímica, lectinohistoqímica.
Procesado de las muestras 5 pasos (toma de muestras, fijación, inclusión, corte y tinción).
Toma de muestras biológicas
Biopsia o necropsia (vivo/muerto) 1 cm^
Tiene que ser rápida y a baja temperatura
Fijación del material
Objetivo: Conservar el material biológico
En función de la aplicación: inmersión, perfusión o inyección
Fijadores se eligen por rapidez de fijación, velocidad de reacción con el material y poder de penetración. No deben modificar los componentes celulares (artefactos), impedir cambios de volumen.
Exceso de fijación quebradiza y frágil (no se puede cortar)
Fijadores físicos
- Calor (microbiología)
- Frio y congelación (paso a corte directo, proteínas nativas)
Fijadores químicos
- Aldehídos (buena penetración, fijación lenta) proteínas sin desnaturalización o Formaldehido y glutarldéhido
- Alcoholes (mala penetración, fijación rápida) desnaturalizan proteínas, disuelven lípidos y endurecen la muestra. o Metanol, etanol…
- Ácidos (buenos fijadores) precipitan las proteínas o Pícrico (cit.), acético (DNA y glucoproteínas) y ósmico (lípidos)
- Sales fijan bien las proteínas pero desnaturalizan o Dicromato/permanganato de potasio, tetraóxido de osmio y bicloruro de mercurio.
Mezclas de componentes: Bouin, Carnoy y Zenker.
Inclusión del material
Objetivo: Aportar rigidez a una muestra biológica para su posterior corte mediante la sustitución del contenido acuoso por un material duro.
Consiste en:
- Deshidratación
- Aclarado (xileno, tolueno o cloroformo)
- Impregnación (parafina, resina epoxi)
- Formación del bloque
Corte
Objetivo: obtención de secciones para su estudio o posterior tinción.
Histología vegetal—> corte a mano alzada
Órgano blando – > Micrótomo de parafina (desbastado, 3-10 μm) Criomocrótomo (5- μm).
Los cortes se pegan sobre el portaobjetos al evaporarse el agua pero si se va a lavar posteriormente es mejor adherirlos con poli-L-lisina o albúmina.
Tinción
Objetivo: reacciones química para formar compuestos insolubles que den contraste a una estructura.
Pasos:
- Desparafinado
- Rehidratación
- Tinción
Si se pretende observar directamente se puede montar con glicerina, si se pretende conservar realizar la inclusión de nuevo.
Tinción de rutina (no específicas)
En función de las moléculas con las que reaccionan
- Colorantes ácidos o basófilos – > estructuras positivas, básicas o acidófilas (citoplasma y citoesqueleto). Eosina
- Colorantes básicos o acidófilos – >estructuras negativas, ácidas o basófilas (núcleo, nucleolo y matriz extrecelular). Hematoxilina
- Colorantes neutros o mixtos – > Giemsa
Tinciones especiales
Para DNA
Aconsejable que el producto de reacción no difunda y utilizar inhibidores específicos para evitar falsos positivos (reacción específica).
Lectinohistoquímica
Pone de manifiesto glucoproteínas a través de sus enlaces glúcidos.
Preparación que no precipite las proteínas, incubación con lectinas marcadas (p.e. biotina) para posterior rebelado con ABC.
Aporta información sobre el tipo, la cantidad y la disposición de los azúcares en las glucoproteínas.
Inmunocitoquímica
Pone de manifiesto un antígeno mediante la reacción específica antígeno-anticuerpo.
Deben de mantenerse las condiciones necesarias para que el anticuerpo pueda reconocer el epítopo para el que fue diseñado.
Pruebas de especificidad antígeno anticuerpo
- Ausencia de anticuerpo
- Bloqueo del anticuerpo (saturación)
- Pre-absorción con antígeno puro.
Generalmente se utiliza un anticuerpo primario para detectar el epítopo y un anticuerpo secundario que detecta la inmunoglobulina del primario y es el que va marcado (enzimas, fluorocromos, biotina, digoxigenina, oro, bolas magnéticas).
Si el anticuerpo primario es el marcadoinmunocitoquímica directa, si el anticuerpo secundario o terciario es el marcado inmunocitoquímica indirecta (permite amplificación de la señal).
Tipos de revelado del anticuerpo marcado:
- Revelado por sustrato enzimático (enzima como marcaje) o Peroxidasa o SAP (permite gran amplificación para poco antígeno)
- Sistemas de amplificación o Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) o Avidina-biotina-peroxidasa (ABC) o Streptavidina-peroxidasa o Digoxigenina-antidigoxigenina
- Fluorescencia (inmunofluorescencia) MF, MBC, citometría
- Oro coloidal
Podemos realizar marcajes simples, dobles o triples siempre y cuando los anticuerpos sean de especies diferentes y el revelado de unos no interfiera con el de otros.
Hibridación in situ y PCR in situ
Identificación de la presencia o expresión de un gen mediante la visualización del DNA o RNA específico.
Se utilizan sondas marcadas (biotina o digoxigenina) sintetizadas con
- PCR con cebadores conocidos
- PCR de la secuencia clonada en vector.
Se utilizan los primers por separados para generar ssDNA que sirve de control positivo y negativo.
Utilidad de hibridación in situ:
- Detección de presencia de secuencias concretas (virus lisogénico)
- Detección de órganos afectados.
- Detección de mutaciones conocidas.
- Estudio de células recombinante y transgénicos.
No es útil para detectar un gen concreto porque se teñirían todos los núcleos. Para detección de la expresión dos precauciones
- Sonda con más de un exón (+ especificidad)
- Degradación de DNA genómico con DNasa
PCR in situ también sirve para detectar un gen o su expresión.
- Para gen utilizar condiciones de buffering adecuadas
- Para mRNA añadir retrotranscripción.
Esta técnica soluciona el problema de la baja sensibilidad (ahora hay miles de copias del fragmento que puede ser reconocido por la sonda) pero hay que asegurase de que no difunden (carga en agarosa y 2ª PCR de medio de buffering).
Autorradiografía
Exposición a isótopo radiactivo que es incorporado durante el metabolismo a diferentes componentes y que puede ser localizado posteriormente al cubrir la preparación con un film fotográfico. Al introducir la muestra en una emulsión de plata, esta se deposita en los puntos en los que la radiactividad ha revelado el film fotográfico.
Técnicas para MF y MBC
Basadas en la fluorescencia.
Podemos estudiar la presencia, cantidad, distribución y cinética de compuestos mediante fluorocromos y trazadores iónicos.
o Ultrafinos 25-100 nm mediante ultramicrotomo con cuchillas de vidrio o diamante.
- Preparación. Recogida de los cortes en rejillas de cobre o niquel.
- Contraste mediante citrato de plomo y acetato de uranilo.
Aplicaciones del MET
Se pueden realizar todas las aplicaciones ya estudiadas pero considerando que el revelado tendrá que ser de una sustancia electronodensa. (enzimohistoquímica, inmunocitoquímica con oro coloidal).
El contraste debe de ser el suficiente para saber dónde está el marcaje, pero no tanto como para enmascarar nuestro resultado.
Tinción negativa para materiales en suspensión pequeños (virus, complejos macromoleculares, proteínas que interaccionan). Se deposita la suspensión sobre una película de carbono y se añade ácido fosfotúngstico que genera un precipitado electronodenso solo donde no hay material.
Criofractura mediante fijación por congelación y ruptura por el punto más débil. Podemos contrastar con sombreado metálico
Sombreado metálico.
Técnicas MEB
El procesado varía considerablemente según la muestra.
Se fija con glutaraldehído en tampón y se deshidrata mediante proceso de punto crítico. A continuación se metaliza con oro o platino.
