¡Descarga Toxicologia y más Apuntes en PDF de Toxicología solo en Docsity!
Tema 1: Introducció
La toxicologia genètica es la part de la toxicologia/genètica que tracta de descobrir quins agents poden interaccionar amb el material hereditari, i determinar els efectes d’aquesta interacció sobre el material genètic, sobre la cèl·lula, l’individu i/o la descendència. Així com estudiar el mecanismes de producció de mutacions. Un agent genotòxic es aquell agent que actua directament o indirectament sobre el DNA i que produeix efectes detectables a concentracions subtòxiques; una concentració subtòxica es aquella en la que un no te mai efectes immediats un cop ha sigut exposat a l’agent. Un agent no genotòxic també pot produir efectes genotòxics. El període de latència d’un procés tumoral (cancerigen) es d’uns 20 anys. Tots els agents antitumorals son genotòxics. Hi ha un risc secundari de patir un altre tumor. (transparència 3) (transparència 4) Un dany es una alteració topològica de l’estructura del DNA. Si el dany es molt gros i no es pot reparar l’efecte es letal per a la cèl·lula. Si la cèl·lula està molt alterada es eliminada per apoptosi. Si la lesió es al DNA moderadament repetitiu serà neutra. Si la lesió es a les proteïnes que controlen la divisió cel·lular podrem tenir problemes en la segregació cromosòmica i pot produir un efecte genotòxic encara que la diana no sigui el DNA. (transparència 5)Els efectes d’una exposició a un agent genotòxic poden ser:
- Mort cel·lular
- Mutació
- Càncer
- Destrucció cel·lular Els efectes genotòxics pateixen un llarg procés (amb tres nivells) fins que arriben a l’efecte final. En cada nivell hi ha un filtre per reduir els possibles efectes. Els DNA està constantment exposat a alteracions i ha anat aprenent a evitar aquestes agressions al llarg de l’evolució. El DNA es pot replicar i te la capacitat de mutar. Hi ha un equilibri entre la fiabilitat de la replicació i la capacitat de mutar. Qualsevol compost extern que entra al nostre interior es un xenobiòtic. Els organismes han evolucionat de manera que tenen mecanismes de desintoxicació (els xenobiòtic s’eliminen o es transformen en altres compostos). L’organisme transforma un compost difícil d’excretar en un altre fàcil d’excretar. El compost es un principi pot no ser genotòxic i per eliminar-lo el modifiquem i el podem convertir en genotòxic (ex: hidrocarburs policíclics aromàtics) Els sistemes de reparació reconeixen la lesió al DNA i el van a eliminar, si la reparació es incorrecta la lesió es fixa i ja tenim una mutació. Si els sistemes de defensa no funcionen tindrà lloc una mutació o càncer (procés tumoral). (transparència 6) la cafeïna es molt mutagènica però s’elimina molt ràpid. Si vull saber el risc necessito saber si entra o no entra, si s’acumula, si s’excreta, si es repara o no... (transparència 7) una genotoxina es una agent extern que te un efecte genotòxic. La genotoxina pot ser natural o artificial. Si la genotoxina està en el medi pot provocar efectes en els individus que hi viuen en aquest medi. Si la genotoxina està al medi ens interessa estudiar- la per fer assaigs “in vivo” o “in vitro” i poder decidir sobre el seu risc. Els individus sentinella o marcadors son aquells animals i plantes que viuen al medi on trobem l’agent genotòxic. (transparència 8) Les societats científiques son grups de persones que investiguen una branca de la ciència en la qual està interessada la població. Al 1970 es va fundar la Societat Europea de Mutagènesi ambiental.
Un agent mutagènic no es un agent que produeix mutacions i un agent carcinogènic no es un agent que produeix càncer. Un agent mutagènic/carcinogènic es un agent que incrementa la probabilitat de patir mutacions/càncer. Les mutacions i el càncer son processos que passen de forma natural. (transparència 10) el primer estudi seriós va ser el de Sir percivall que va estudiar el càncer d’escrot en netejadors de xemeneies. Als segles I i II ja descrivien la malaltia del càncer. Galeno va definir el càncer con un desequilibri entre els quatre fluids vitals corporals. El càncer es una malaltia de tot el cos més que un aspecte puntual. Relació entre càncer i depressió. Al 1900 el president Grant va morir per un càncer de llavi (fumava pipa). S. XIX-XX es va descobrir la relació entre càncer i infecció. Exemple : papiloma i càncer d’úter. A excepció d’aquest cas en mamífers no hi ha gaires casos de càncer per infecció. En pollastres hi ha una infecció que produeix sarcoma. Càncer hereditari: es aquell que te una certa distribució a la genealogia més propera (avis, oncles,...). Càncer esporàdic: es aquell que surt de manera espontània sense que hi hagin parents afectats. 1907 es va determinar el càncer com a malaltia de rics, donat que s’associava a que els rics menjaven més carn que els pobres. La carn a la brasa porta molts hidrocarburs policíclics aromàtics que son grans carcinògens. Els vegetals porten una gran quantitat d’anticarcinògens, antioxidants. El càncer es una malaltia que apareix amb els anys, com més vivim més probabilitats tenim de patir càncer. A finals de 1970 es defineix el càncer com un procés multifàsic si no fos així el càncer seria irreversible. (transparència 11). Si muta la línia germinal s’augmenta la càrrega genètica, els desequilibris genètics i es pot donar una fertilitat reduïda. La fertilitat reduïda es a causa de que s’incrementa la probabilitat de que coincideixin dos mutacions. Si les mutacions son grans tenim letals dominants que produeixen avortaments, l’individu pot morir en les fases embrionàries o desprès del naixement. (transparència 12) Si una cèl·lula somàtica muta normalment mor, si la cèl·lula no mor i depenent de quan es doni la mutació tindrà efectes diferents. Una mutació a l’etapa embrionària donarà lloc a un procés de teratogènesi (hi ha un teixit mutant), si es dóna quan l’individu es adult es produeix càncer. La diferencia entre teratogènesi i mutació està en quan es dona la mutació. Un mor abans o desprès depenent del número de mutacions somàtiques acumulades. Les malalties neurodegeneratives es donen per l’acumulació de mutacions en el SN. L’ arterioesclerosi també es dóna per acumulació de mutacions.
Tema 2: Aspectes genètics bàsics
No podem conèixer una mutació si no es per comparació. Un DNA mutat ha de tenir la mateixa estructura que el DNA intacte. Una seqüència està mutada respecte una altra quan hi ha un número diferent de parells de bases o quan la seqüència estigui canviada. S’ha de comparar amb un estàndard. Tindrem dos tipus de mutacions:
- (^) Nº diferent de parells de bases.
- Seqüència diferent.
Una altra de les classificacions també pot ser (transparència 6):
- Microlesions: s’observen a nivell de gen.
- Macrolesions: s’observen a nivell de cromosoma.
Tipus de mutacions (transparència 8):
- Somàtica vs germinal
- Dominant vs recessiva
- (^) Gènica (1 sol gen), cromosòmica (1 cromosoma), genòmica (afecta a tot el genoma, exemple poliploïdies).
- Fenotípica: produeix canvis fenotípics.
- Letal: els efectes comporten la inviabilitat de la cèl·lula.
- Espontània: quan no controla els agents que han produït la mutació.
- Induïda: son aquells casos en els que suposo quin es l’agent de mutació.
- Directa vs inversa Gen A te dos al·lels
- Al·lel A normal
- Al·lel a mutant A → a mutació directa (normal – mutant) a → A mutació inversa (mutant – normal) La mutació es un fenomen espontani, es dona normalment. La probabilitat de que A muti a a te una taxa de canvi. La mutació directa es més freqüent que la mutació inversa. La mutació directa es pot donar per molts mecanismes mentre que per a que es doni la mutació inversa ha de ser un canvi concret. (transparències 9 i 10)
Mutacions puntuals (transparència 11) Transicions: es substitueix una purina (adenina i guanina) per una purina o una pirimidina (timina, citosina i uracil) per una pirimidina. Transversions: es substitueix una purina per una pirimidina o una pirimidina per una purina. Analíticament hi ha més transicions que transversions encara que en teoria haurien d’haver més transversions que transicions.
Tautomeria (transparències 12, 13, 14) ( Principios de Genética, Tamarín pag. 474) Les bases nitrogenades tenen dobles enllaços conjugats que son molt dinàmics i poden canviar. Les formes ceto(timina i guanina) i amino (citosina i adenosina) son les més freqüents. Per tautomeria es provoquen mutacions degudes a transicions.
Les transicions per tautomeria es poden donar per: (transparència 15):
- Formes tautomèriques a la cadena motlle.
- Formes tautomèriques al pool de nucleòtids que tinc per col·locar durant la replicació del DNA. Les formes tautomèriques son més inestables i tendeixen a tornar a la forma normal. Que són més estables.
Anàlegs de bases (transparència 16)
L’uracil o el bromouracil son molècules que simulen a les originals bases nitrogenades, poden ser confoses i incorporades al DNA. El bromouracil es un anàleg de la timina i te una capacitat de tautomerització més elevada que la timina. Depenent de la forma del bromouracil s’hi podrà unir a una A o a una G. Els anàlegs de bases son les bases modificades. Les bases anormals no son detectades per les cèl·lules i per tant no entren en funcionament els mecanismes de reparació.
Mutacions induïdes per addicions/ delecions de regions del DNA (transparències 26-27) Aquest tipus de mutacions es donen a la replicació del DNA. La pol patina es desenganxa i es dona una situació de desaparellament, la pol es tornarà a enganxar però pot ser que no sigui al mateix lloc on s’ha desenganxat. Si s’enganxa un parell de nucleòtids desprès a la cadena nova es dona una addició. Si s’enganxa uns nucleòtids desprès a la cadena motlle es donarà una deleció. Aquestes mutacions es solen donar en zones amb elevada redundància donat que la pol s’equivoca de base a la qual enganxar-se. Zones amb elevada redundància son els microsatèl·lits. (transparència 20) La citosina si es desamina es transforma a uracil que es un anàleg de la timina i s’unirà a l’adenina. L’adenina si es desamina es convertirà en hipoxantina que es un anàleg de la guanosina i s’unirà a la citosina.
Tema 4: Bases moleculars de la mutació cromosòmica
Totes les alteracions que es donen a nivell de base nitrogenada produeixen mutacions gèniques.
Teoria del trencament i unió(transparències 23-24) En una cromàtide per l’acció d’un agent clastogènic es produeix un trencament de doble cadena (alteració de la configuració normal de la molècula de DNA). L’alteració es reparada en condicions normals gràcies a una lligasa. Si no es repara desprès de la replicació tindrem un trencament cromosòmic i per tant una deleció.
Sempre produeixen aberracions del tipus cromatìdic.
Les aberracions cromosòmiques inestables s’observen per tinció Giemsa i per la tècnica de bandes. Les aberracions cromosòmiques estables s’observen per la tècnica FISH. Les mutacions inestables es miren donat que els mecanismes que les produeixen també produeixen aberracions estables que son més difícils de detectar. Les mutacions dinàmiques presenten anticipació genètica. (transparències 28, 29, 30, 31)
Mutacions als telòmers Els telòmers son el final dels cromosomes i es poden detectar mitjançant tècniques especials. (transparència 33) el telòmer es un hexàmer (TTAGGG) que te proteïnes associades les més conegudes son les TRF1 i la TRF2. Les proteïnes donen la configuració en llaç T que es una manera de protegir el cromosoma. Cada cop que es replica la cèl·lula els telòmers tendeixen a reduir-se, donat que no tenen capacitat de replicació. (transparència 34) Quan els telòmers son críticament curts deixen de fer la seva funció i el cromosoma queda desprotegit, llavors es podran formar aberracions i la cèl·lula entrarà en apoptosi. Síndromes d’inestabilitat genòmica: son deguts a un ràpid escurçament dels telòmers. Anèmia de Fanconi: les cèl·lules hematopoiètiques es molt ràpid i els telòmers s’escurcen molt ràpidament i augmenta el número de mutacions. Es detecta en nens al voltant dels 10 anys. Produeix la mort si no son sotmesos a transplantament de moll d’ós. Poden arribar a viure fins a 20 anys sense tractament. Si sobreviuen a aquesta edat son susceptibles a patir càncer. Està considerada una malaltia rara ja que es poc freqüent. Es difícil de detectar. Es pot detectar la mida del telòmer amb diferents tècniques, una d’elles es el Q-FISH. Si hi ha més telòmer s’enganxarà més sonda i emetrà més fluorescència. (transparència 36). En pacients amb Anèmia de Fanconi es poden detectar senyals telomèriques extracrmosòmiques que poden ser degudes a que el cromosoma s’ha separat del telòmer.
SCE (intercanvis de cromàtides germanes) Els intercanvis de cromàtides germanes (SCE) son les manifestacions a nivell citològic, de processos de recombinació que s’han donat entre els dúplexs de DNA idèntics de cromosomes mitòtics. Les cromàtides germanes provenen de la replicació de l’altre i tenen la mateixa informació. Els SCE no comporten problemes donat que la informació es la mateixa però son indicatius de que hi ha problemes. Els carcinògens coneguts normalment son sensibles als SCE. En una metafase normal hi podem trobar uns 6 SCE. Son bons indicadors dels carcinògens del tabac. 1953 McClintock va intuir els SCE quan va analitzar els cromosomes de blat en anell amb cromàtides entrellaçades que impedien la migració en anafase. 1958 Taylor. Per demostra la replicació semi-conservativa del DNA en Vicia Faba va utilitzar (^3) H-T (timidina titriada, es radioactiva i bruta ja que genera soroll de fons) i autoradiografia. Cada cromàtide es veia diferent. 1972 Zakhrov i Egoline van utilitzar BrdU i tinció amb Giemsa. Hi havia una mala definició. 1973 Latt, va utilitzar BrdU, però tenyin amb el fluorocrom Hoeschst 33285 i visualitzant amb microscopi de fluorescència. Hi havia una ràpida extinció. 1974 Perry i Wolff: fan ver una doble tinció, primer amb 33285 i desprès amb Giemsa. La tinció era permanent. Hoeschst te afinitat pel BrdU. Una cromàtide està bisubstituïda (tindrà molt BrdU) per BrdU i l’altra està monosubstituïda. Quan la llum incideix a la cromàtide bisubstituïda es degradarà.
Quan tenyeixo amb Giemsa la cromàtide clara es la bisubstituïda que està degradada i es tenyirà menys, l’altre que no estarà degradada es tenyirà intensament.
Models
Model de Painter (1980). Unió de clusters de replicació.
Interferència en la forca de replicació, els trencaments poden produir lesions anormals
Model de Pomnir (1985) Intercanvis en la subunitat de la topoisomerasa
Aspectes a tenir en compte dels SCE
- La concentració de BrdU: donat que es un agent mutagènic i indueix per tant SCE. Existeix un número basal de SCE.
- Tipus cel·lular: en cultiu de limfòcits trobem diferències entre sang completa i limfòcits aïllats.
- pH del medi: pH baixos suposen increments en la freqüència de SCE.
- Estadística HFC (cèl·lula amb elevada freqüència de SCE): indica subpoblacions cel·lulars molt sensibles. S’utilitzen als estudis de carcinògens ja que són bons indicadors.
Tema 5: Mecanismes de reparació
(transparències 37, 38, 39) Fotoreactivació Kelner es va deixar els cultius fora a prop de la llum ultraviolada, aquesta havia produït menys toxicitat de l’esperada. L’enzim respon a l’activitat de l’exposició a la UV. L’enzim reconeix la mutació i s’uneix al DNA, la unió es fa a les fosques. El complex enzim- DNA quan es exposat a la llum es separa del DNA reparant la mutació (transparència 40). L’anell de cicle butà uneix els dímers de timina (transparència 41). L’enzim te dos subunitats:
- MTHF: te afinitat per captar energia però te mala capacitat per transportar-la.
- FADH: te afinitat per transmetre energia però te mala afinitat per captar-la. L’energia activa la MTHF que la capta i l’envia al FADH que transporta l’energia trencant el cicle de butà (es trenquen 2 enllaços covalents i es transformen en dobles enllaços) i torno a la situació inicial.
Reparació de O 6 -alquilguanina, O^4 -alquiltimina i alquilofosfotriesters Els radicals alquil son altament radioactius i poden interaccionar amb macromolècules incloent el DNA. Hi ha un blanc o diana de les alquilacions que es el grup fosfòric del DNA (transparència 44).
Una mateixa lesió pot ser reparada per diferents mecanismes. La UvrB enmarca la lesió i junt amb altres proteïnes obre la cadena lesionada. Llavors s’uneix la UvrC. UvrB produeix un trencament per un cantó i per l’altre cantó el trencament el produeix la UvrC. Desprès el gap serà reparat. Fases:
- (^) Reconeixement de la lesió
- Marcat de la lesió.
- Processat de la lesió
Model en mamífers XPA, XPE busquen i reconeixen lesions junt amb altres factors de transcripció. XP es el causant del Xeroderma pigmentosum , els individus afectats per Xeroderma tenen una elvada incidència de càncer de pell sobretot als llocs on hi toca el sol. Moren fàcilment. Un cop s’ha detectat la lesió s’envien senyals per a que es reclutin altres proteïnes. Es forma un gran complex proteic que marcarà exactament la lesió i separarà les 2 cadenes de DNA. Es continuen reclutant proteïnes que tallaran la zona lesionada. La cadena simple es protegeix per a que es degradi. La DNA pol δ i la ε i altres factors ompliran el forat que ha quedat. Es un procés molt complex i es relativament fàcil que alguna cosa falli. Pot ser que algun enzim no funcioni i els passos no es donin o que l’enzim funcioni parcialment. (transparència 53) Síndrome de Cockayne: son sensibles a UV però no tenen una incidència tan elevada de càncer. Tenen un mecanisme de reparació diferent. En humans hi ha dos mecamismes NER. Al Síndrome de Cockayne es reconeixen lesions al DNA actiu transcripcionalment, A Xeroderma (hi intervé el gen XPC) reconeixen lesions en qualsevol punt del DNA ja sigui actiu o inactiu. Al Síndrome de Cockayne hi intervé el gen CSB. (transparència 54)
Reparació de falsos aparellaments (transparència 56)
En funció dels tipus de falsos aparellaments funciona un o altre mecanisme
MMR en bacteris (transparència 57) Intervé: MutS, MutL, MutH Quan hi ha un fals aparellament quina base es la incorrecta? La base incorrecta es aquella que estarà a la cadena de no nova síntesi, ja que son errors de replicació. CTAG es una regió metilada que es troba cada 200 pb per tal d’identificar-lo com a propi. La metilació es un procés post-replicatiu. Quan hi ha un error el nucleòtid incorrecte es aquell que es troba a la cadena que no està metilada. MutS reconeix l’aparellament s’uneix i es recluten MutL. Intervé MutH que enmarca la zona i busca la seqüència CTAG sense metilar per tal de saber quina zona s’ha de metilar. Una exonucleasa degradarà la cadena errònia i la DNA pol III omplirà el forat.
MMR en mamífers (transparència 58) Els mamífers no metilen el DNA i no se sap quin enzim es l’encarregat de reconèixer quina cadena es l’errònia. Hi ha més proteïnes però el mecanisme es el mateix que als bacteris.
Els mecanismes no tendents a l’error solen ser pre-replicatius. Els mecanismes tendents a l’error son post-replicatius. Mecanismes de translesió: es aquell que quan hi ha una lesió i no es pot arreglar es segueix endavant. La DNA pol s’allibera i el seu lloc es ocupat per altres polimerases. Son polimerases amb una fidelitat petita (es a dir poden col·locar qualsevol nucleòtid a l’atzar) llavors s’allibera i es torna a unir. La vertadera lesió no està reparada però dona temps a que en un altre cicle altre mecanismes pre-replicatius el puguin arreglar. Si la cèl·lula està molt lesionada s’aliminarà si no s’intenta de que sobrevisqui. Els mecanismes pre-replicatius no generen mutagènesi. Els mecanismes de reparació per recombinació poden servir per arreglar lesions al DNA.
El GAP que s’ha creat degut a que la polimerasa s’ha desenganxat a causa d’una mutació, s’arregla per replicació. Però la lesió no s’ha arreglat.
La resposta adaptativa es va descobrir al 1977: l’acció d’un agent alquilant produïa l’alquiltransferasa que eliminava les bases alquilades millorant la resposta a agents mutagènics. (transparències 61, 62, 65, 66, 67, 68) La lesió responsable de la resposta adaptativa hauria de ser un trencament.
Tema 6: Mutàgens químics i físics
(transparència 71, 72) Radiació ionitzant : activa els àtoms fent-los saltar d’una òrbita a una altra. Las radiacions ionitzants més devastadores son les particulades però les no particulades penetren més. Unitats físiques:
- Becquerel: unitats de descomposició per segon
Unitats biològiques:
- Rad: es aquella energia dipositada al teixit.
- Sievert i Rem: son les unitats d’exposició global.
Fonts de radiació ionitzant (transparència 73)
- Radiació interna: es aquella que es va acumulant degut a la incorporació d’àtoms o partícules radioactives. El cos no discrimina entre ions radioactius i els normals.
- Radiació terrestre: urani. Te una distribució discontinua en la terra.
- Radiació còsmica: rebem radiació ionitzant del sol. Depèn d’allà on visquis.
- Radò: gas radioactiu natural ubic molt pesat que s’acumula en subterranis. Pot ser que un element sigui molt ionitzant però que estigui en poca quantitat. (transparència 74) La radiació ionitzant elimina àtoms de la molècula de DNA, això produirà energia que podrà trencar els enllaços fosfodiester del DNA. El banc fonamental de la ionització es l’aigua que produirà molècules ionitzants que podran alterar el DNA. Als accidents nuclears s’allibera iode131 (la seva vida mitja es de 131 dies) que es radioactiu, tot i això s’utilitza per al tractament del hipertiroïdisme; el iode131 s’integra a les cèl·lules del
Mutàgens activats per a llum: un exemple son les furocumanines (s’utilitzen com a tractament de les malalties de la pell). Els mutàgens activats s’uneixen al DNA però tenen habilitat per captar energia lluminosa i emetre energia que trencarà el DNA i la cèl·lula morirà.
Mutàgens que produeixen dany indirectament: el seu blanc no es el DNA. Els agents oxidants oxiden aigua i son els radicals hidroxils que interaccionen amb el DNA. La vinblastina interacciona amb proteïnes del fus evitant que es formi.
Agents intercalants: son tints. Als anys 70 els tints del cabell eren d’aquest tipus. Son molècules cícliques planars que modifiquen la llum que hi incideix en ell. Creen superenrollaments al DNA que crearà una torsió suficient per a que es trenqui la molècula de DNA. Solen produir adicions i delecions. Exemple: bromur d’etidi.
Els anàlegs de bases s’incorporen al DNA. (transparència 82) L’espectre mutacional d’un pacient amb càncer de pulmó fumador i un altre que no ho sigui es diferent.
Tema 7: Carcinogènesi
Els estudis d’agents carcinogènics es fan en rates durant uns 2 anys (son llargs). Això suposa un elevat cost i que siguin molt elaborats donat que s’han d’analitzar tots els òrgans per detectar la presència de tumors. (transparències 85, 86) El 90% dels tumors tenen el seu origen al teixit epitelial, ja que estan a la frontera amb l’ambient i son altament proliferatius. (transparències 87, 88, 89) L’arsènic provoca càncer de pell. Apareix en zones complementàries al càncer de pell produït per la llum, es a dir a llocs no exposats al sol. (transparències 91, 92) La benzidina es un tint d’ús industrial. Causa càncer de bufeta. IARC: Agència Internacional de Recerca del Càncer. Fan estudis sobre agents carcinogènics, desprès donen una classificació del risc del compost. Tenen 4 categories:
- Possible/Probable carcinògen.
- Carcinògen humà.
- No hi ha suficients dades
- No es un carcinògen humà. (transparència 93) La incidència d’un determinat càncer varia segons la zona. Tot agent que es mutagènic es carcinògen, però no tot agent carcinògen es mutagènic (transparències 95, 96) Gens responsables en processos tumorals:
- Oncogens i gens supressors de tumors: controlen la capacitat cel·lular en quant a la seva divisió. Els oncogens son acceleradors dels processos tumorals i els gens supressors son aturadors dels processos tumorals. El paper dels oncogens es molt complicat.
- Els gens mutadors controlen la capacitat de mutació dels gens. Estan involucrats en els mecanismes de reparació i de reconeixement de mutacions. (transparència 97)
Rb: càncer de retina. APC: càncer de colon BRCA: càncer de mama. MEN: està lligat a tumors endocrins. P53: en la majoria dels càncers està mutat. 1 sola mutació en un protooncogen (les mutacions son dominants) es suficients per desencadenar un càncer. Als agents supressors de tumors hi calen 2 mutacions. (transparències 98, 99, 100, 101) Adenoma: tumor benigne. La malignització del teixit requereix varies mutacions, una a sobre de l’altra. Un agent promotor es carcinògen però no es mutàgen. (transparència 102) A la iniciació està involucrada la mutació, la cèl·lula passa de ser normal a estar mutada. (transparències 103, 104) Els carcinògens genotòxics estan implicats en la iniciació. I els carcinògens no genotòxics actuen en la promoció i progressió. Els promotors tenen acció sinèrgica es a dir quant s’exposen junt amb el carcinògen, l’índex de tumors augmenta. Mitògens: son agents que estimulen la capacitat de divisió i augmenten el número de mitosis. Quan s’incrementa la proliferació cel·lular s’incrementa la probabilitat de que es fixin les mutacions. L’amiant no produeix mutacions però les fibres d’amiant quan es respiren es dipositen a les cèl·lules provocant inflamació.
Tema 8: Farmacogenètica
(transparència 105) La població es pot subdividir en:
- Sensibles
- No-sensibles Aproximadament el 80% dels càncers tenen un origen ambiental i per tant es prevenible. Si s’està en un ambient on hi ha una exposició es produiran uns efectes inicials que es poden detectar mitjançant biomarcadors; al final una de les possibles malalties que provocarà aquesta exposició serà càncer. Aquesta exposició estarà modulada per la susceptibilitat de cada individu. (transparències 106,107) Des de l’exposició fins a l’efecte hi han diferents barreres:
- Metabolització
- Reparació
- Eliminació cèl·lules afectades (transparència 108) El metabolisme te una única finalitat i es la d’eliminar els compostos xenobiòtics fent-los més hidrosolubes. Els mecanismes del metabolisme actuen en 2 fases. Els compostos passaran per les dues fases o només per la fase I o només per la fase II:
- Fase I: es produeixen alteracions en la molècula produint metabòlits. Es una reacció de funcionalització ja que canviem la funció del compost xenobiòtic.
- Fase II: les molècules es conjuguen al metabòlit fent-lo més hidrosoluble.
Enzims implicats en el metabolisme (transparència 109)
- P450: citocrom. Es el més general. Es una família d’enzims molt complexa.
- Enzims de Fase II: son enzims que transfereixen grups com el glutatió, N-acetil, N-acil...
Els perfils metabòlics dels individus es realitzen administrant un compost. S’anirà analitzant la orina i s’intentarà detectar el metabòlit i el compost, si hi ha molt compost i poc metabòlit vol dir que es un mal metabolitzador. Si hi ha molt metabòlit i poc compost vol dir que es un
El càncer de tiroides es de bon pronòstic ja que es de creixement lent i es un càncer encapsulat. Hi ha 3 tipus de càncer de tiroides:
- Fol·licular
- Papil·lar
- Medul·lar: afecta a cèl·lules parafol·liculars. Es un càncer de tipus familiar. Genotipat: material i mètodes
9ml sang EDTA F 0A E extracció estàndard F 0A E DNA en TE 1 F 06 Dg/ F 06 Dl F 0A E Genotipat PRC+RFLP F 0A E 116 controls/134 càncer de tiroides
Tema 9: Susceptibilitat hereditària a la mutació
Dany al DNA Si fallen els mecanismes de reparació tindrem un síndrome d’inestabilitat genòmica, aquests individus acabaran tenint càncer. (transparència 119) Malalties hereditàries caracteritzades per deficiències en la reparació del DNA. En 1968 James Cleaver, va observar que en cultius de fibroblasts d’una persona que patia Xeroderma pigmentosum no es donava la reparació NER, desprès de l’exposició a UV. A l’any següent, el grup de Setlow va confirmar aquesta primera observació puntual. A partir dels anys 70, l’estudi de la reparació comença a estendre’s en les malalties associades amb anomalies cromosòmiques i amb una elevada incidència de neoplàsies. Les malalties més estudiades a aquest nivell son: XP, TTD (tricotiodistrofia),CS (Síndrome de Cockayne), FA (anèmia de Fanconi), AT (Síndrome de Louis-Bar o atàxia telangiectàsica), BS (Síndrome de Bloom). Altres: Rothmund-Thomson, Lupus erythematosus, psoriasis, melanoma maligne. De tots els símptomes de les malalties no tots els malalts els pateixen tots.
Xeroderma pigmentosum Els afectats tenen una severa sensibilitat a totes les fonts de UV, especialment a la llum solar. El dany al DNA es acumulatiu i irreversible. Símptomes: ceguera, sordesa, ampolles i pigues, insuficiències del desenvolupament, nanisme, hipergonadisme, atròfia i pèrdua de les pestanyes de les parpelles inferiors. Una persona normal pot patir un càncer de pell però ho farà a una edat més tardana que un malalt de XP. Les anomalies oculars no es detecten fins els 4 anys. Les anomalies neurològiques es detecten a una edat temprana. Les anomalies cutànies no es detecten fins als 1,5 anys Es una malaltia molt rar y a vegades no es sap detectar. La mateixa malaltia pot ser deguda a diferents mutacions. I les diferents mutacions tenen gravetats diferents. Com a mínim hi ha 7 gens o glups de complementació implicats en la malaltia. UDS: síntesis de DNA no programat (unscheduled DNA sinthesis). Es aquell que es sintetitza per reparar.
Tricotiodistrofia (TTD)
Símptomes: fragilitat del pel deguda a una deficiència en sofre,ulls sobresortint, falta de celles i pestanyes, ictiosis (pell escuamosa), retràs físic i mental. L’heterocigot es considera normal ja que es una malaltia recessiva. Tenen problemes en la reparació del DNA. Hi ha malalts que sembla que combinen XP i TTP degut a que una proteïna anòmala la XPD que afecta a la funcionalitat de dos vies, la de la reparació del DNA i la de la síntesis de pel. Canvis poc importants moleculars poden produir canvis importants a nivell fenotípic.
Síndrome de Cockayne (CS) Símptomes: nanisme, microcefalia, retràs mental, faccions típiques a la cara, desenvolupament neural endarrerit, pas poc ferm, propensió a cremades solars, retinopaties, cataractes, càries, pèrdua de grassa. Hi ha tres tipus:
- CS tipus I, clàssic
- CS de tipus II
- (^) Una altra forma més moderada. Atàxia telangiectàsica (AT) Es una atàxia associada als gens AT que estan encarregats específicament de reparar DSB. Els afectats per AT son molt sensibles a la llum UV. Moren a dosis de radioteràpia que altres individus toleren be. Estan relacionats en mutacions en p53 que va molt lligat a AT. Les aberracions cromosòmiques que tenen son cromosomes dicèntrics.
Síndrome de Bloom Es caracteritza per què tenen una deficiència en una lligasa. Recombinen malament i tenen una elevada freqüència de SCE. El nivell basal normal es de 6 SCE per cèl·lula. Les aberracions cromosòmiques son cromosomes triradials i tetraradials. Tenen problemes en el mecanisme de reparació per recombinació.
Les rutes de reparació de cadascun dels síndromes tenen gens que interactuen entre si. L’Anèmia de Fanconi interacciona amb tots els altres síndromes.
Anèmia de Fanconi Va ser descrita per primera vegada pel pediatra suís Guido Fanconi a l’any 1924. L’anèmia de Fanconi es una malaltia autosòmica recessiva. La freqüència en la població es de 1/400000, es molt rara. Es caracteritza per una elevada heterogeneïtat clínica i genètica. La incidència a Espanya es superior en el col·lectiu gitano ja que son molt consanguinis. La mutació que presenten es única. Degut a això es suposa que la mutació es va donar a Espanya desprès de colonitzar-la. Es sol manifestar en forma de pancitopènia als 5-10 anys d’edat i l’esperança de vida mitja gira en torn els 16 anys. Un 50% dels malalts no arriba als 40 anys d¡edat. La severitat dels símptomes es molt variable. Tenen 1000 vegades més probabilitats de patir leucèmia amb l’edat i càncer de coll, fetge... La causa de mort sol estar deguda a complicacions derivades de la disfunció medul·lar i del SN. Espectre de trets fenotípics es molt heterogeni i no sempre es presenten, això dificulta el diagnòstic de la malaltia. Símptomes: anomalies en dits, braços, en l’esquelet, genolls i malucs, hiperpigmentació, taques cafè amb llet, problemes renals, hipogonadisme sobretot en mascles, microcefalia i microftalmia. Les cèl·lules FA mostren una elevada sensibilitat e inestabilitat cromosòmica davant d’agents inductors d’enllaços creuats (MMC, DEB...)
Tema 11: Assaigs de mutagènesi
(transparència 143) Assaig: sistema de detecció de la inducció d’efectes genotòxics. Estudi: pot ser in vitro, in vivo o ex vivo. A l’estudi ex vivo l’exposició es in vivo i l’estudi es després de la mort. Finalitat: protecció i legislatura. Altres objectius de la toxicologia genètica: dissenyar i/o modificar assaigs que permetin una major capacitat de detecció d’activitat genotòxica.
(transparències 243, 246, 247)
Assaigs amb bacteris Els bacteris son fàcils de cultivar i son molt sensibles, però no tenim interès en ells. Només volem saber si el dany que es produeix en el material genètic d’un bacteri es pot produir també en el material genètic dels humans. (transparència 145)
Test d’Ames s’utilitza molt en Europa i EUA. El test d’Ames i el de mutació en E. coli estudien mutacions inverses (es passa d’un individu mutant a un individu normal). His-^ → His+ El test de resistència a arabinosa estudia un altre gen el de l’arabinosa. ara +^ → ara -
En mutacions inverses sabem quina mutació es te per aixó podem saber quin mecanisme es el que produeix la mutació. (transparència 146) Cada soca te una mutació concreta i per tant podrem saber quin es el mecanisme de mutació utilitzant cada soca.
Assaig d’incorporació en placa (transparència 147) Es te el control negatiu, el control positiu i el resultat amb les diferents concentracions. Els controls serveixen per comprovar que el protocol funciona. Les cèl·lules normalment estan congelades Aquestes cèl·lules es descongelen i es fa un cultiu de nit a uns 37ºC per a que es comencin a dividir. El control negatiu es el dissolvent que s’utilitza per dissoldre el compost. També es necessita una fracció de S9 (fracció microsomal del fetge de rata), ja que els bacteris no metabolitzen els compostos. Es fan dos experiments, un amb S9 i l’altre sense S9.
Amb S9 Sense S Resultat - + Mutàgen directe
La mutació sempre te lloc quan les cèl·lules es repliquen. Es posa la quantitat suficient d’histidina per a que les cèl·lules facin 1 o 2 rondes de replicació, esgotin la histidina i deixin de créixer a no ser que el producte produeixi una mutació (his -^ →his +) i el bacteri sigui capaç de créixer en un medi sense histidina. Si el número de colònies que s’obté a l’experiment es el doble de les que s’obté al control vol dir que l’agent es genotòxic. Cal tenir en compte que poden haver errors quan el compost es molt tòxic, ja que poden haver falsos positius. No s’han de confondre les colònies petites possibles mutants resultants d’un excés de toxicitat de les colònies grans que haurien de créixer. La sensibilitat d’un assaig no es mai del 100% ja que no es factible detectar el 100% dels carcinògens ja que hi ha carcinògens que no son mutagènics/genotòxics i el que es detecta als assaigs son les mutacions que provoquen els agents genotòxics. Els assaigs amb bacteris es consideren in vitro ja que no tenen una mínima estructuració, els assaigs amb Drosophila es consideren un vivo, ja que tenen 2 línies cel·lulars (somática i germinal) i tenen sistemes (digestiu, excretor...)
Assaigs de mutacions germinals en Drosophila : l’assaig de detecció de mutacions letals recessives lligades al sexe (SLRLT) (transparències 151, 152, 153) calen dos generacions per detectar els efectes. El mascle tractat (te els ulls grans rodons i vermells, no te la mutació letal recessiva) es creua amb una femella amb ulls en barra de color groc. Aquesta femella te 2 inversions SC que cobreixen tot el cromosoma, aquestes inversions impedeixen la recombinació. Els testicles actuen com una caixa de cèl·lules en diferents estadis de maduració. El mascle tractat passa a la femella esperma madur tractar com a esperma madur, al cap de pocs dies passarà esperma que va ser tractat en estadi postmeiòtic, d’aquesta manera es pot saber si el tractament actua en una etapa o en una altra o si no es específic de fase, es a dir la sensibilitat es la mateix independentment de l’estadi germinal. Caixa testicle
El cromosoma tractat que hereta la femella (es a dir el cromosoma X patern) pot estar mutat o intacte. El cromosoma X conté el 205 del genoma que son suficientment importants per a que si tenen una mutació l’individu mori. Si les femelles filla es creuen amb els seus germans donaran una descendència que podrà portar el cromosoma patern que va ser tractat al principi (cromosoma de l’avi). Els descendents que tinguin la mutació no naixeran. La freqüència espontània de mutació es d’un 5% es a dir un 5% dels espermatozoides de manera espontània son capaços de portar una mutació. Per tal que l’estudi sigui significatiu a la F 2 s’haurien d’estudiar com a mínim 1000 cromosomes. (transparència 154) S’han fet assaigs per determinar si hi ha mutàgens específics de la línia germinal i s’ha vist que tot mutàgen que produeix mutacions en la línia germinal també la produeix a la línia somàtica.
Assaigs de mutació somàtica en Drosophila : l’assaig de detecció de mutació i recombinació somàtica (SMART) Detectem si augmenta la freqüència de recombinació. Es l’únic sistema per detectar i quantificar l’augment de la freqüència de recombinació. Marcadors:
