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“PROTEIN SECRETION MACHINES ARE THE INSTRUMENTS OF MICROBIAL
WARFARE” (Vincent T. Lee and Olaf Schneewind, 2001)
Terminología:
Traslocación: transporte de una proteína a través de una membrana. Secreción: salida de una proteína el medio externo Exporte: salida de una proteína al periplasma
En Gram -, la secreción de una proteína debería estar “gobernada” por su traslocación a través de la ME, mientras que en Gram + lo sería a través de la MI. Hasta ahora se han encontrado 5 tipos de secreción en bacterias Gram - ( Figura 1 )
SALIDA A TRAVÉS DE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA : Sistemas Sec y Tat.
Gram negativas y gram positivas
Sistema Sec: (tambien llamadoGSP: general secretory pathway). Forma más general de exportar proteínas a través de la MI tanto en procariotas como en eucariotas.
Se basa en la utilización de una traslocasa de la membrana citoplasmática compuesta por diversas proteínas, SecY (la principal), SecE, SecG, Sec61 F 0 6 1F 0 6 7F 0 6 2. Todo el complejo recibe el nombre de traslocón Sec. Mediante este mecanismo salen al medio externo la mayoría de proteínas de Gram positivas y al periplasma en Gram negativas. Para la salida al medio en Gram negativas se necesita algo más. ¿Aclarando terminos confusos?: (Desvaux, M. el al. 2004a) a la salida sec-dependiente hacia el periplasma en Gram negativas se le pasó a denominar GEP (general export pathway) y se reservó GSP a lo que ocurre en éstas cuando, además, también salen a través de la ME. Sin embargo, la salida sec- dependiente al medio en Gram positivas se siguió llamando GSP. Por tanto GSP yGEP son los nombres dados al mismo mecanismo (Sec-dependiente) mediante el que se cruza la membrana citoplasmática, en gram positivas y en gram negativas, respectivamente.
Para la salida de proteínas desde el periplasma al medio externo , el primer mecanismo que se descubrió fue denominado MTB (main terminal branch), aunque ahora se denomina secreción Tipo II (el ejemplo típico es la salida de la pululanasa de Klebsiella oxytoca ). Se creía que era la vía principal, casi podría decirse, universal, que seguían las proteínas destinadas al medio externo en Gram negativas. Y se incluyó este tipo de salida del periplasma a lo considerado como GSP en Gram negativas. (por tanto, GSP en Gram negativas: GEP + MTB).
Complicando más la terminología, unos llegaron a llamar directamente GSP a esta MTB, mientras que igualmente conservaban GSP tambien para la salida al medio de proteínas en Gram positivas y eucariotas (recordemos que en Gram negativas se denominaba GEP).
Posteriormente se descubrieron los tipos III,, IV y V, mecanismos diferentes de salida a través de la ME. Los tipos IV y V fueron incluídos en el GSP, junto al MTB, como variantes minoritarias de éste. En realidad el tipo V sería mucho más universal que el tipo II, por lo que llamar MTB al II sería claramente incorrecto, además las proteínas secretadas por el tipo II no sólo salen por el traslocón Sec sino por el TAT, mientras que las del tipo V sí salen sólo desde Sec (no TAT).
Actualmente(2005) subsisten aún las diversas acepciones para el concepto de GSP, por lo que parece necesario aclarar que sólo se debería de llamar así, por lógica, a lo que sea común, es decir, al mecanismo de salida desde el citoplasma a través de la MI, para las proteínas que utilicen el traslocón Sec (sería igual para Gram + y Gram -), siendo dirigidas a él a través de SecB o SRP ( chaperonina inicialmente no incluída en la maquinaría Sec)
Elementos de Sec :
Spasa I : peptidasa señal que elimina el PS de las proteínas secretadas al tiempo que éstas atraviesan la MI. No procesa a las lipoproteínas. SpasaII : peptidasa específica de las lipoproteínas: proteínas modificadas postraduccionalmente a las que se unió covalentemente ac. grasos.
La proteína sin procesar se denomina preproteína y consta de péptido señal y parte madura. La proteína funcional, tras la traslocación, sólo posee la parte madura. El péptidoseñal, tras ser separado de la preproteína es degradado en la misma MC.
SecA : una ATPasa. Dímero de 102 kDa cada uno. Absolutamente esencial para la traslocación Sec dependiente. SecA, está en el citoplasma pero se asocia y separa de la MC a medida que provoca la salida del polipéptido aportando la energía para el proceso. Así, se inserta en la MC para arrastrar al fragmento traslocado de la proteína que está en SecYEG. Se alarga hasta llegar al lado periplásmico y al hidrolizar ATP en el lado citoplasmático, vuelve entera a él (cómo si se alargara y encogiera sucesivamente acompañando al polipéptido que es traslocado). Tiene al menos un dominio para la hidrólisis del ATP, y otro para unirse a las proteinas traslocadas. Tambien se sabe que SecA interviene para ayudar a cruzar la MC los fragmentos hidrofílicos cuando éstos son grandes, mayores de 60 AAs.
SecY,E,G : Trímero que forma el traslocón, lugar por el que salen las proteínas traslocadas. situadas en la MC, crean el poro por el que las proteínas salen desde el citoplasma
Sec F, Sec D , YajC : forman otro trímero que interactúa con el traslocón. Están juntos en el mismo sec DFYajC.. SecD y SecF son esenciales para la traslocación especialmente a bajas temperaturas. YajD no es esencial para el transporte, aunque estimula la inserción de proteínas de la MC tanto Sec dependientes como independientes. Este trímero regularía de algún modo el ciclo de SecA (Lee, 2001)
YidC : proteína de la MC. No esta claro si debe ser incluída en la maquinaria Sec, pero es necesaria para la inserción de proteínas de la MC (Lee, 2001).
SecB : una chaperonina citoplasmática que se une a la parte de la proteina que no es el PS, a la denominada parte madura de la preproteína Evita el plegamiento de la proteína a traslocar antes de que esta interactúe con los traslocadores. SecB y SRP son los discriminadors iniciales, los que reconocen a las proteínas a secretar y las dirigen hacia los traslocadores de membrana.
SRP : (signal recognition particle). Homóloga del SRP eucariota aunque más sencilla que ésta (Dalbey, R.E. and Chen, M. 2004), consistiendo en 1 proteína de 54 kDa llamada Ffh (en mamíferos son
- y un RNA 4.5 S. Existe un receptor en la MC para SRP llamado FtsY. El proceso sería así: el polipéptido naciente es reconocido por SRP al que se une justo al iniciarse la traducción (será una traslocación co-traduccional), e interactúa con su receptor de MC, FtsY.(FtsY se une entonces a un complejo proteína-ribosoma-RNAm). Ya en contacto con la MC es reconocido por SecYEG. La proteína es insertada lateralmente en su primer dominio hidrofóbico. Ya el proceso continua sólo, habiéndose separado SRP y su receptor. Se desconoce cómo la proteína a ser traslocada pasa desde SRP/FstY a SecYEG (no se descarta que participe alguna otra proteína). Tampoco esta claro que el proceso sea estrictamente co-traduccional. Además también se ha visto que SRP dirige hacia la MC tb. proteínas Sec independientes, como se ha visto con ProW.
SistemaTAT (twin arginine traslocation): (Pugsley et al. 2004) (Palmer, T. and Berk. B.C., 2003)
Es la alternativa principal a la vía Sec. La utilizan metaloproteínas que han adquirido el grupo prostético en el citoplasma y que salen ya plegadas. Generalmente son proteínas con cofactores red-ox). (también es necesario para la biogénesis de proteínas de la MC, no sólo para liberar proteínas al otro lado de la MC). Estaríamos hablando de proteínas componentes de las cadenas rspiratorias y de aparaos fotosintéticos (Palmer, T. and Berk. B.C., 2003).
Aunque algunas proteínas de las que presentan grupo prostético metálico salen al periplasma sin plegarse a través de Sec y adquieren allí el grupo (por ejemplo los citocromos tipo c), la mayoría de las proteínas reductasas de la MC, salen ya plegadas incluyendo los iones metálicos (o complejos metálicos complejos, como pej. complejos Fe-S, ó Ni-Fe de hidrogenasas). De hecho la inserción de un cofactor, suele requerir del previo plegamiento de la proteína en cuestión.
Estas proteínas salen del citoplasma a través de otra vía: el sistema de la traslocasa Tat. El mecanismo equivalente en eucariotas se ha encontrado en las membranas de los tilacoides de los cloroplastos de plantas superiores. Se sabe que:
-el sistema selecciona que las proteínas traslocadas estén ya previamente plegadas.
Fusionando el PS propio de Tat a proteínas heterólogas generalmente se promueve la secreción de las mismas por parte de Tat. De cualquier forma esto depende de cual es la proteína a la que se fusiona, y así, por ejemplo, con la F 0 6 2-galactosidasa no funciona, (como le ocurre a este mismo enzima al intentar su salida por Sec, tras fusionarle un PS típico de Sec). Funciona en muchos casos de proteínas Sec dependientes a las que convierte en Tat dependientes (interés en secreción de proteínas heterólogas , en los casos en los que Sec no sea eficaz).
¿Quién corta el PS?
Es la misma peptidasa señal I del sistema Sec la que corta los PS dependientes de Sec.
Maquinaria Tat:
Un operón con 4 genes tatABCD min.84 de E.coli y otro , min. 14, tatE. TatA, B y E son muy parecidos en secuencia y en estructura. A, B , C son de membrana. D es una proteína citoplasmática con actividad nucleasa. Esta, no parece nada necesaria para la función de Tat. De hecho se expresa casi nada. La expresión de A, B y C es: 25:1: 0.5 (se estima que la expresión de TatA y B es 20:1). TatA se cree que es el principal responsable del canal de paso de las proteínas traslocadas. TatB y TatC, actúan en el reconocimiento del PS, seguramente.
Se desconoce:
Realmente se está muy al principio del conocimiento del sistema Tat. Tanto al nivel de cómo y con qué elementos Tat interactúan las proteínas a ser traslocadas, así como el mecanismo por el que se aporta la energía necesaria para la traslocación, que, según se sabe, no es aportada por la hidrólisis de ATP sino por fuerza protomotriz.
Tambien falta casi todo por conocer respecto la función de Tat en la inserción de proteínas de la MC que no poseen cofactores y que tambien dependen de Tat para su inserción.
El sistema Tat está sobreexpresado en biofilms formados por algunas bacterias patógenas, como Pseudomonas aeruginosa , lo que añade aún más interés por conocer más acerca del mismo.
Proteínas de le Membrana Citoplasmática: (van Bloois, et al. 2005)
En Escherichia coli se conocen más de 800 proteínas de MC (el 20% del total de las proteínas de esta bacteria). Cada proteína posee varios dominios transmembranosos formados por unos 20 a 27 AAs hidrofóbicos que forman una hélice α.
Por un lado hay que recordar (ver sistema Tat) que hay un tipo de proteínas de la MC que su inserción en la membrana está mediada por la maquinaria Tat. Son proteínas que incorporan cofactores en su estrucura funcional, como es el caso de las proteínas implicadas en el transporte de electrones (respiración y fotosíntesis). Hay que decir, sin embargo, que al menos en el caso del citocromo c, esto no es así, ya que cofactor (grupo hemo) y proteína cruzan la MC separados , juntándose después, el el lado periplásmico de la MC. El cit c sale por la maquinaria Sec y no por la Tat. (Figura1) ojo, pues en el dibujo parece que la proteína quede libre en el medio, aunque el esquema tambien es válido para proteínas como el citocromo c, que queda insertado en la MC.
FIGURA.
Para su salida desde el citoplasma, necesitan la participación de SRP Las proteínas de la MC se insertan dependiendo para ello de la proteína YidC , que tambien es una proteína de dicha membrana. Esta interviene en la inserción (por difusión lateral desde el SecYEG) de los segmentos hidrofóbicos de las proteínas dentro de la MC. Es un contacto transitorio, asociándose al traslocón SecYEG. Tambien se cree que la funión de YidC, no sería estrictamente esencial , aunque si que parece incrementar la eficacia de la integración en la membrana. Tambien se cree que podría ser una chaperonina que ayudara al correcto plegamiento de la proteína en el interior de la membrana.
La mayoría de proteínas de la MC dependen, además de Sec (vía Sec- YidC). Tienen péptido señal que se corta, o que no, siendo la SpasaI la encargada del procesamiento. Las primeras tienen además al menos una región que detiene la salida desde la membrana, que la “anclan” a la membrana. Es la señal de Stop de traslocación.
Algunas, parece que siguen una vía Sec independiente (la vía “only YidC”). De esta segunda forma salen, por ejemplo, las proteínas de la cápsida de fagos filamentosos como M13 o alguna subunidad de la ATPasa F 1 F 0.
Proteínas integrales de la Membrana Externa: (Voulhoux et al 2003)
Las proteínas de la MI tienen estructura de alfa-hélice, mientras que las de ME tienen barril- beta. Estas últimas tienen péptido señal, necesario para cruzar la membrana interna a través del sistema Sec. Así ocurre, por ejemplo con las porinas, o con TolC. El péptido señal es eliminado y la proteína madura queda en el citoplasma. ¿Qué pasa después?
Lo que se sabe: las proteínas se pliegan en el periplasma, parece ser que ayudadas por chaperoninas ( SurA , y quizás también Skp ). También se sabe que el LPS estimula el plegamiento in vitro. Como candidato a intervenir en proceso se piensa en Omp85 , descrita en Neisseria meningitidis. Se han descubierto genes que podrían codificar genes homólogos a esta en todas las gram negativas analizadas. En Neisseria esta proteína es esencial y que las porinas no se integran bien el la ME.
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FIGURA.
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Secreción tipo II: También llamada MTB (main terminal branch) del GSP. (ver terminología al principio de este resumen). Ejemplos, la pululanasa de Klebsiella oxytoca , la toxina colérica de Vibrio cholerae y la exotoxina Ade Pseudomonas aeruginosa. Tambien se cree que un tipo de génesis fimbrial (la denominada de tipo IV) puede realizarse mediante este tipo de secreción.
Las proteínas salen del citoplasma en dos pasos, a través de la maquinaria Sec (tienen un PS estándar, procesable). Una vez en el periplasma, ciertas chaperoninas, como DsbA facilitan que la proteína se pliegue de forma casi nativa ya. Así es requerida para la salida a través de la ME. La salida a través de la ME requiere de la participación de otras 12- 16 proteínas más. A estas se les llama “ el secreton ”. La mayoría de los genes están juntos en un mismo operón. Algunas de estas proteína se llaman secretinas., que podrían formar un poro como TolC ( parece que eso lo haría la proteína denominada D, pej. PulD). La salida tambien requiere gasto de energía en forma de ATP (gastado en el citoplasma claro) a través de una ATPasa citoplasmática, la proteína E (PulE , para la pululanasa). En resumen, parece que todos o la mayoría de estos 12-16 elementos se agruparían en una única estructura que “tocaría” a las dos membranas. De todos modos no hay que pensar que las proteínas están formando un traslocón por el que salen las proteínas desde el citoplasma. No, éstas salen del citoplasma a través de Sec, sólo que el suministro de energía para sacarlas a través de la ME necesita de una ATPasa (la proteína E, pej. PulE en el caso de la pululanasa) en el citoplasma y es por ello que el aparato de Tipo II tiene elementos estructurales en la MC, unidos a otros periplásmicos y al traslocón de la ME. Toda esta estructura no debe ser confundida con las que aparecen en los esquemas que representan los mecanismos de secreción Tipos I, III y IV. (la pululanasa, enzima que hidroliza almidón es una lipoproteína, así que será procesada por la Spasa II , en su salida Sec-dependiente desde el citoplasma).
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FIGURA.
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Secreción tipoIII (T3S, TTSS):
Descubierto inicialmente para las proteínas Yop de Yersinia spp. Tambien salen de esta forma, proteínas de patógenos como: Salmonella enterica, Shigella flexnerii, E. coli, Pseudomonas syringae y Chlamydia trachomatis, entre otras. Es fundamental para la virulencia de todas ellas. Es claramente el sistema de secreción más típicamente Sec-independiente (al menos no se han encontrado excepciones como si ha ocurrido con el Tipo I). Se forma un inyectisoma , estructura homóloga a la del cuerpo basal del flagelo de gram negativas. Algunos autores afirman que la génesis del propio flagelo es, de hecho, un mecanismo de secreción Tipo III (Aizawa, S.I. 2004).
Los genes que codifican las proteínas componentes de esta maquinaria están juntos en un mismo locus, ya sea en un plásmido o en el cromosoma. Son genes muy conservados entre especies.
Las proteínas secretadas a través de este mecanismo, salen directamente al exterior desde el citoplasma, sin intermediario periplásmico y con independencia de las maquinarias Sec o Tat.
¿Cómo son reconocidas las proteínas a secretar? Hay controversia. Unos creen que el RNAm , en su extremo 5’, presenta una señal que dirige los polisomas que están sintetizando los polipéptidos a secretar hacia el traslocón. Habría así un acoplamiento entre síntesis y secreción. Otra teoría dice que los 20 AAs del extremo aminoterminal de los péptidos a secretar son un lugar de unión a chaperoninas citoplasmáticas que interactúa con el traslocón. La coincidencia entre ambas propuestas se debe a que realmente, los 20 AAs amino-terminales , o al menos el RNAm correspondiente, son imprescindibles para ser reconocidas como proteínas secretables. La salida se produce a través de una estructura “needle-like” formada por al menos 20 proteínas diferentes. Forman una estructura anular, con hueco en el centro, a través del cual salen directamente cruzando las dos membranas.
Quizás lo más sorprendente de este sistema sea que permite inyectar las proteínas secretadas directamente al interior de células eucariotas. Esta secreción es “contacto dependiente”. Aunque no en todos los casos conocidos de secreción TTSS ocurre así, ya que hay sistemas tipo III que liberan proteínas al medio. Se necesita energía externa para la secreción (el único sistema que, al parecer, no requiere dicho aporte externo sería el sistema tipo V en sus tres variantes (Figura 1). La suministra el gasto de ATP en ATPasas asociadas en la parte citoplasmática, en la base, del inyectosoma.
En cuanto al flagelo, hay que decir que presenta una gran homología con la estructura del inyectosoma: las proteínas que forman la base del flagelo y el inyectosoma, aunque no presentan una homología espectacular en su secuencia de AAs (máximo de un 40 % en las proteínas más parecidas), presentan propiedades similares de tipo físico-químico (tamaño, punto isoeléctrico, perfil de hidrofobicidad, etc) (Aizawa, S.I., 2001). La estructura final es similar y se propone que el inyectosoma haya podido evolucionar a partir de la estructura del flagelo (Saier, 2004).
F 0 E 0Este es el único de los cinco tipos que, mientras no se encuentren excepciones, puede decirse que es Sec-independiente.
Secreción tipo IV (TFSS):
Es el peor conocido de los 5 sistemas.
Está evolutivamente relacionado con la maquinaria del proceso de la conjugación (en concreto la maquinaria Tra), aunque sin que pueda decirse quién precedería a quién en el tiempo. Ambos son sistemas para secretar proteínas hacia el interior de células: a otra bacteria (referido al proceso de la conjugación) o a una célula eucariota (propiamente hablando del TFSS). La salida a través de la MC se realiza según la proteína: unas dependen de Sec para salir del citoplasma (pej. La toxina de Bordetella pertussis ), otras salen directamente (p.ej: El complejo nucleoprotéico de Agrobacterium , sale ADN y proteínas) de modo Sec independiente
dependiendo de SRP (no de SecB). Sería el primer ejemplo de proteínas dirigidas el medio a través de SRP, que hasta ahora sólo se había visto su participación en la inserción de proteínas de la MC.
Ahora se sabe que muchas gram negativas secretan enzimas y adhesinas superficiales y extracelulares, por esta vía. El dominio a traslocar a través de la ME se mantendría sin plegar, gracias a chaperoninas periplásmicas. Se cree que la traslocación a través de la ME sería un proceso favorable energéticamente causado por el hecho mismo del plegamiento del dominio translocado al salir del barril (¿) aunque esto no está claro pues tambien se ha visto que trasloca proteínas plegadas si no son muy grandes una vez plegadas ( pej. 2 nm) para el barril.
Se cree que, una vez en el periplasma, el autotransportador se inserta espontáneamente en la ME. Parece que para que esto ocurra de manera eficiente se necesita de la participación del LPS y de una chapeonina periplásmica, Skp. La función de “co-chaperonina” de ambas estructuras parece importante para la correcta inserción de muchas proteínas de la ME.
Hay tres tipos-variantes del modelo, denominados Va, Vb, Vc. En ninguno de los casos se necesita, aparentemente al menos, ningún aporte de energía.
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FIGURA.
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-El tipo Va : la variante más extendida. De hecho, parece ser que la mayoría de proteínas secretadas en gram negativas serían de este tipo. Son las proteínas denominadas autotransportadores. A esta variante, a veces, se les hace sinónimo de tipo V de secreción.
Hay indicios (Desvaux et al, 2004b) de que la salida de los autotransportadores podría requerir la “maquinaria” Omp85 (Voulhoux, et al, 2003, necesaria para la inserción de proteínas de la ME), lo que haría algo inexacta la denominación de autotransportador.
Una vez cruzada la ME, el fragmento funcional puede ser liberado por proteólisis o no. En el primer caso, una vez cortado, puede quedar unido por enlaces no covalentes al poro-barril, o realmente libre en el medio. No se sabe quien corta el péptido, si él mismo (autoproteólisis) o una proteasa de la .ME. Al menos en algún caso se ha visto que el dominio funcional (el secretado al medio) tiene actividad autoproteásica (Henderson et al , 2004). Son secretadas proteínas muy grandes >100 kDa. De esta forma es secretada, por ejemplo, la proteasa IgA1 deL gonococo. La región carboxi-terminal, que forma el poro, atraviesa 14 veces la ME.
-El tipo Vb : llamado two-partner-system (TPS). El dominio transportador (barril β) y el fragmento funcional a ser transportado son dos polipéptidos diferentes (las familias TspB y TspA de proteínas, respectivmente). Están juntos en el mismo operón, eso sí. Los dos polipéptidos presentan péptido señal. Tambien así se secretan proteínas muy grandes >100 kDa. Ejemplo, la hemoaglutinina filamentosa (FHA) de Bordetella pertusis. Suelen ser liberados de la ME por proteólisis. (proteasas de la ME?).. La región carboxi-terminal, que forma el poro, atraviesa 19 veces la ME.
-El tipo Vc : tambén denominado AT-2 las proteínas secretadas se denominan familia Oca (oligomeric coiled adhesins). No son “liberados” de la ME. (ejemplo, YadA de Yersinia pestis ). La región carboxi-terminal ólo tiene 4 segmentos hidrofóbicos que cruzan la membrana, pero el transportador funcional es un trímero: el poro tiene 12 fragmentos en total.
