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Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC): Fundamentos y Aplicaciones, Esquemas y mapas conceptuales de Análisis Químico e Instrumental

Este documento resume la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), técnica clave en química analítica. Explora los componentes del sistema HPLC, los principios de separación basados en interacciones moleculares y los tipos de HPLC: fase normal, reversa, intercambio iónico, exclusión por tamaño y afinidad. Se discuten los materiales de relleno en columnas HPLC, como partículas porosas y de núcleo sólido, y la selección de la columna según la muestra y el análisis. Se destacan parámetros como tiempo de retención, factor de capacidad, selectividad, eficiencia y resolución, junto con aplicaciones en farmacéutica, análisis de alimentos, investigación biomédica y química ambiental. Concluye resaltando la alta resolución, rapidez, sensibilidad y versatilidad de la HPLC, ofreciendo una visión práctica de esta técnica esencial para estudiantes y profesionales.

Tipo: Esquemas y mapas conceptuales

2024/2025

Subido el 05/06/2025

karla-atzin-olivo-martinez
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Resumen del video
La HPLC, por sus siglas en inglés “High Performance Liquid Chromatography” o, en español,
cromatografía líquida de alta eficiencia, es un término autoexplicativo. La HPLC es un tipo de
técnica de separación que utiliza una fase móvil líquida para llevar la muestra a través de la fase
estacionaria que se encuentra en la columna. Debido a que los componentes de la muestra
interactúan con la fase estacionaria de maneras distintas, migran a diferentes velocidades y logran
una separación útil. La HPLC está destinada a ser utilizada para compuestos que no son volátiles o
demasiado volátiles y tienden a descomponerse a temperaturas extremadamente altas, a
diferencia de la cromatografía de gases.
Componentes de un sistema HPLC (Fig. 1)
Las partes de un sistema HPLC incluyen los siguientes módulos:
1. Reservorios de solvente: Contienen la fase móvil, la cual es una mezcla de solventes como
agua, metanol o acetonitrilo.
2. Bomba: Bombea con porciones de la fase móvil a través del sistema a una presión
constante y controlada.
3. Sistema de inyección: Inyecta la cantidad correcta de muestra en el flujo de la fase móvil.
4. Columna cromatográfica: Contiene la fase estacionaria, el cual es el medio a través del cual
se efectúa la separación del compuesto de muestra.
5. Detector: Identifica y cuantifica los componentes individualmente una vez que ellos han
sido separados a medida que eluyen.
6. Sistema de adquisición de datos: se encarga de tomar las señales provenientes del
detector y analizarlas, obteniendo así los cromatogramas para la posterior interpretación
de los resultados de la separación llevada a cabo.
Fig. 1. Esquema del HPLC
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Resumen del video La HPLC, por sus siglas en inglés “High Performance Liquid Chromatography” o, en español, cromatografía líquida de alta eficiencia, es un término autoexplicativo. La HPLC es un tipo de técnica de separación que utiliza una fase móvil líquida para llevar la muestra a través de la fase estacionaria que se encuentra en la columna. Debido a que los componentes de la muestra interactúan con la fase estacionaria de maneras distintas, migran a diferentes velocidades y logran una separación útil. La HPLC está destinada a ser utilizada para compuestos que no son volátiles o demasiado volátiles y tienden a descomponerse a temperaturas extremadamente altas, a diferencia de la cromatografía de gases. Componentes de un sistema HPLC (Fig. 1) Las partes de un sistema HPLC incluyen los siguientes módulos:

  1. Reservorios de solvente: Contienen la fase móvil, la cual es una mezcla de solventes como agua, metanol o acetonitrilo.
  2. Bomba: Bombea con porciones de la fase móvil a través del sistema a una presión constante y controlada.
  3. Sistema de inyección: Inyecta la cantidad correcta de muestra en el flujo de la fase móvil.
  4. Columna cromatográfica: Contiene la fase estacionaria, el cual es el medio a través del cual se efectúa la separación del compuesto de muestra.
  5. Detector: Identifica y cuantifica los componentes individualmente una vez que ellos han sido separados a medida que eluyen.
  6. Sistema de adquisición de datos: se encarga de tomar las señales provenientes del detector y analizarlas, obteniendo así los cromatogramas para la posterior interpretación de los resultados de la separación llevada a cabo. Fig. 1. Esquema del HPLC

Principios de separación La separación llevada a cabo en HPLC se basa en la diferencia existente entre las interacciones que mantienen los distintos componentes de la muestra con la fase móvil y estacionaria. Las interacciones que se llevan a cabo entre la fase móvil y la fase estacionaria pueden ser las fuerzas de Van der Waals, los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y/o las fuerzas electrostáticas. A la hora de separarse, los distintos componentes de la mezcla analizada irán separándose unos de otros, a medida que vayan avanzando a lo largo de la columna. Tipos de HPLC Podemos encontrar distintos modos de HPLC, destacando entre ellos:

  • Fase normal. En este modo, la fase estacionaria es polar y la fase móvil no polar.
  • Fase reversa. En este modo la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es polar.
  • Cromatografía de intercambio iónico. En este modo se separan los compuestos basándose en su carga iónica.
  • Cromatografía de exclusión según el tamaño. En la cual se separa las moléculas según su tamaño.
  • Cromatografía de afinidad. En este modo, se lleva a cabo la separación en función de la interacción de una molécula con su respectivo ligando. Algo que es importante señalar es que, cuando se quiere llevar a cabo la separación, existen tipos de influencia que puede tener la fase móvil sobre la separación que queremos realizar y estos son:
  1. Elución con gradiente.
  2. Elución isocrática. Presentando una mayor eficiencia en la elución con gradiente como nos demuestra el gráfico, ya que se requiere de un menor tiempo de retención. (Fig. 2) Fig. 2. Influencia de la fase móvil en la separación.

Características: Partículas de sílice porosas con alta superficie de contacto que dan lugar, en caso de interacciones, a la separación. Ventajas: Buena eficiencia en las separaciones. Desventajas: La resistividad al flujo es alta y eso requiere mayor presión durante la separación (mayores diferencias de presión).

2. Partículas de núcleo sólido (Core-Shell Particles) Características: Partículas con un núcleo sólido y una capa porosa en la superficie externa. Ventajas: Mayor eficiencia de separación y menor dispersión de banda, permitiendo realizar análisis más rápidos. Desventajas: Mayor resistencia al flujo y eso puede requerir instrumentación especializada debido a la presión de funcionamiento. 3. Columnas monolíticas. Características: Estructuras continuas de sílice o polímeros que presentan una porosidad del orden del milímetro. Ventajas: Baja resistencia al flujo, siendo aptas para el tratamiento de muestras complejas sin problemas de obturación de la columna. Desventajas: Menor eficiencia con respecto a las columnas empacadas con partículas. Selección de la Columna Correcta La selección de la columna y su material de relleno dependerá de diferentes aspectos: - Naturaleza de la muestra: polaridad, peso molecular, carga, etc. - Fin a que se destina el análisis: identificación, cuantificación, purificación... - Congruencia del HPLC: máxima presión soportada, tipo de detector, etc. - Estabilidad química: resistencia a distintos pH y diferentes disolventes. Parámetros en HPLC Para la optimización de la separación y la obtenida de resultados reproductibles, es conveniente controlar varios parámetros:

  • Tiempo de retención (tR): Tiempo que emplea un analito en eluir de la columna. - Factor de capacidad (k'): Relación entre el tiempo de retención del analito y el tiempo muerto.
  • Selectividad (α): Relación entre los factores de capacidad de dos analitos.
  • Eficiencia de la columna (N): número de platos teóricos, expresa la capacidad de una columna para separar.
  • Resolución (Rs): Parámetro que expresa la separación entre dos picos en el cromatograma.

Aplicaciones de la HPLC La HPLC es ampliamente utilizada en:

  • Industria farmacéutica: Control de calidad y determinaciones de pureza de medicamentos. - Análisis de alimentos: Detección de aditivos, conservantes y contaminantes.
  • Investigación biomédica: Estudio de metabolitos, biomoléculas.
  • Química ambiental: Monitoreo de contaminantes en agua y suelo. Beneficios de la HPLC Algunas de sus principales ventajas son:
  • Alta resolución: Puede separar compuestos de estructuras muy similares
  • Rapidez: Los análisis pueden hacerse en tiempos relativamente breves.
  • Sensibilidad: Es capaz de detectar y cuantificar compuestos a niveles de concentración muy pequeños.
  • Versatilidad: Apta para una buena diversidad de compuestos, tanto orgánicos como inorgánicos.