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Tecniche di determinazione delle strutture proteiche per usare PDB Nello studio della struttura proteica si parla di NANOMONDO. Il nanomondo riguarda oggetti che hanno dimensioni dei nanometri. Tecniche e metodiche permettono di studiare oggetti del nanomondo. Per studiare piccole molecole è necessario considerare una scala logaritmica, dove ogni scalino varia di un fattore 10. Parecchio utile quando si vuole confrontare dati con valori parecchio differenti. Il nanomondo è la dimensione delle molecole e non è possibile vederla con un normale microscopio ottico, che invece ci permette di vedere le cellule o comunque le dimensioni cellulari. La lunghezza d’onda è troppo grande per poter vedere oggetti così piccoli. La lunghezza d’onda deve essere comparabile agli oggetti che si vuole studiare Con un microscopio che invece di utilizzare un fascio di luce utilizza un fascio di elettroni è possibile studiare il nanomondo. Per oggetti molto piccoli la lunghezza d’onda delle radiazioni deve essere più piccola, come per i RAGGI X, oppure la NMR. E si valuta l’INTERFERENZA DELLA RADIAZIONE UNA VOLTA CHE HA ATTRAVERSATO GLI OGGETTI. Nel caso della NMR, lo sile è diverso rispetto ai RAGGI X. PER STUDIARE UNA PROTEINA DOBBIAMO PRODURLA ED OTTENERLA IN QUANTITA’ SUFFICIENTI PER POTERLA STUDIARE, ANALIZZARE. Ma l’aggregazione proteica è un fenomeno che ci da poche proteine che possiamo studiare per analizzarle. Le proteine vengono espresse come proteine di membrana, o come molecole solubili nel citoplasma, o come aggregati di proteine per svolgere le loro differenti funzioni. Le tecniche che permettono di studiare la struttura e di determinarla sono: -cristallografia a raggi X. -NMR, ovvero la risonanza magnetica nucleare. Cryo-EM, ovvero la microscopia elettronica mediante tecnica criogenica. Strutture mediante cristallografia a raggi X. Cristallizza le proteine ● Raccogli i modelli di diffrazione
● Migliora in modo iterativo:
- Calcola la mappa di densità elettronica ● Problema di fase
- Misura la traccia di amminoacidi attraverso la mappa Vedi inserto Diffrazione da qualsiasi oggetto ● I raggi X si diffonderanno su ciascun atomo dell'oggetto:
- Dispersione prevalentemente su gusci di elettroni, non su nuclei
- elastico (= stessa energia)
- in tutte le direzioni ● L'intensità della radiazione diffusa in una particolare direzione dipenderà dall’ interferenza (= somma) di onde sparse da ogni atomo dell'oggetto (scattering dipende solo dal fattore di forma, P (Q)) Diffrazione su una singola molecola SASSI: diffrazione diffusa, senza riflessi ... Ma praticamente:
- Intensità di radiazione diffusa molto bassa
- L'orientamento di una singola molecola dovrebbe essere fissato in qualche modo
viene deviato lungo varie direzioni che avranno due parametri da considerare: l’angolo di diffrazione e il raggio di diffrazione. SCHEMA DEL MICROSCOPIO OTTICO Il microscopio ottico utilizza la luce bianca del sole per osservare i campioni. La luce bianca in realtà è l’insieme di tante lunghezze d’onda. La scomposizione della luce bianca nel prisma La luce bianca è composta da tutti i colori dello spettro. La natura composta della luce venne dimostrata per la prima volta nel 1666 dal fisico inglese Isaac Newton. L'esperimento del prisma di Newton Newton fu il primo a capire la composizione della luce. Per scomporre la luce, Newton fece passare un raggio di luce bianca in un prisma di vetro. La luce bianca entra nel prisma e lo attraversa. Quando la luce fuoriesce dal prisma, viene scomposta nei sette colori fondamentali. Quali sono i sette colori fondamentali? I colori fondamentali in natura sono i seguenti: rosso arancione giallo verde blu indaco viola Nota. Sono i colori tipici dell'arcobaleno nel cielo. Un arcobaleno si forma perché la luce bianca proveniente dal Sole viene scomposta nei colori fondamentali dalle gocce d'acqua presenti nell'atmosfera. La spiegazione della scomposizione della luce La dispersione della luce non è sempre uguale. Occorre considerare due aspetti: La velocità della luce varia a seconda della lunghezza d'onda. Quando la luce attraversa un mezzo denso, come il prisma di vetro, la velocità della luce è leggermente diversa a seconda della lunghezza d'onda ( o frequenza ) delle radiazioni. L'angolo di rifrazione varia a seconda della velocità della luce. La luce ha un angolo di rifrazione differente a seconda della velocità del raggio di luce. Pertanto, l'angolo di rifrazione della luce varia a seconda della lunghezza d'onda. L'angolo di rifrazione è più alto nelle alte frequenze, è più basso nelle basse frequenze. Esempio. La radiazione elettromagnetica della luce ad alta frequenza ( es. blu e viola ) ha un angolo di rifrazione molto più marcato rispetto a quella a bassa frequenza ( es. rosso e giallo ). Sappiamo che la luce bianca è composta dalle radiazioni con diverse lunghezze d'onda ( colori ). Poiché ogni colore ha un angolo di rifrazione diverso, quando il raggio di luce bianca esce dal prisma devia in modo diverso a seconda della lunghezza d'onda ( colore ). Per questa ragione si forma un ventaglio di colori dal rosso al viola. In conclusione, nella dispersione della luce i raggi sono deviati con un angolo differente a seconda della lunghezza d'onda. La scomposizione della luce è reversibile o irreversibile? La scomposizione della luce è un fenomeno fisico reversibile. E' infatti possibile ricomporre il fascio di luce bianca originario facendo convergere i raggi colorati. La ricomposizione della luce bianca tramite un secondo prisma rovesciato Se collochiamo un secondo prisma capovolto dopo il primo, l'angolo di rifrazione viene esattamente compensato.
La luce bianca, emessa dal sole e da molte sorgenti artificiali, si può considerare una miscela di radiazioni elettromagnetiche di lunghezza d'onda compresa tra i 400 nm (violetto) e 700 nm (rosso) Il microsco pio ottico utilizza la luce bianca della lampadina o del sole come fascio di lunghezza d’onda che diffonde a 360°. Poi una lente focalizza il fascio, in modo da collimare il fascio in una direzione, questo è importante per visualizzare l’immagine. Anche il laser collima il fascio con una sua lunghezza d’onda anche se la sorgente è lontana, è l’esempio pratico di un collimatore, concentrandolo in un punto. Quindi la lente collima il fascio. Questo fascio passa attra verso il campione, viene diffratto in varie direzioni, poi un sistema di lenti lo rifocalizza, importante è l’obiettivo che permette la rifocalizzazione sulla lente su cui poggiamo il nostro occhio per visualizzare il campione. Lo schema di visualizzazione coi raggi X è identico, cambia solo il metodo di viasualizzazione, ovvero attraverso un ‘’detector’’. La diffrazione deve dipendere dalla struttura del campione. Grazie al fenome dell’INTERFERENZA, che determina la diffrazione del fascio in base alla struttura del campione, l’immagine di INTERFERENZA o DIFFRAZIONE è visualizzabile come scattering da una serie di spot su lastra fotografica o mediante altre tecniche di visualizzazione. L’interferenza può essere positiva o negativa. È il fenomeno dell’interferenza che permette di visualizzare le particelle. Il fascio incidente è in questo caso monocromatico, che è un campo magnetico oscillante nel tempo, che ha una sua direzione. La lunghezza d’onda in fisica è la distanza tra due creste, che nel caso dei raggi X è dell’ordine dell’amstrong. In ogni punto il fascio di raggi X deve essere in fase, viaggiando insieme con stesso valore o multipli. Il fascio nell’oscillazione ha valori massimi e minimi.
Questa sommatoria è utile per determinare la densità elettronica di un cristallo, considerando con I l’intensità dei puntini di diffrazione. Essendo sia in campo reale che immaginario, bisogna considerare entrambi col simbolo +/-. PROBLEMA DELLE FASI Non sappiamo quali sono i valori delle sommatorie positive o negative, quindi non si sa che simbolo mettere, se + o -. Adesso i matematici hanno trovato delle soluzioni per determinare il segno. Otteniamo una DISTRIBUZIONE=MAPPA DI DENSITA’ ELETTRONICA. PER OTTENERE DELLE BUONE IMMAGINI DI DIFFRAZIONE LE MOLECOLE DEVONO ESSERE POSTE IN MODO OTTIMALE, UNICO. DISTRIBUZIONE DELL’INTENSITA’ ELETTRONICA IN VARIE RISOLUZIONI A più alta risoluzione è possibile visualizzare gli atomi di carbonio dove la distribuzione degli elettroni è più elevata. RISOLUZIONE 6Å: Struttura del modello, caratteristica come le eliche possono essere identificate. 3Å: Può tracciare la catena polipeptidica utilizzando i dati della sequenza, stabilire topologia pieghevole. Assegna le catene laterali. 2Å: Stabilire con precisione la conformazione della catena principale, backbone, assegnare le catene laterali,
Preparazione proteica -Clonaggio e sovraespressione Scelta dei sistemi di espressione, vettori e cellule Estrazione e purifivcazione La macromolecola deve essere altamente (> 95%) pura -Poly-istidina tag, purificazione su Ni
colonna innestata in un unico passaggio -anticorpi specifici
- ... Problemi: corpi di inclusione; necessaria la rinaturazione -Preparazione del campione Ad esempio, dissalare in HPLC ... In genere, sono necessari 10-50 mg di proteine pure Le proteine di membrana (MP) se disciolte in un solvente possono perdere la loro struttura. Alcuni laboratori mediante clonaggio permettono un’espressione su piccola scala, altri su media scala, altri ancora su larga scala, come il MaBSC.
La CRISTALLIZZAZIONE è piuttosto un’arte che una scienza, in quanto per produrre cristalli non c’è un'unica procedura che bisogna seguire, ma bisogna variarla molte volte fino ad ottenere un risultato ottimale, ciò viene fatto in maniera automatizzata dalle macchine. Questo è un problema per riprodurre la proteina su larga scala per poterla studiare. Infatti lo studio viene fatto su poche proteine. Inoltre le proteine vengono poste in soluzione e devono avere una bassa solubilità. Le proteine in soluzione si aggregano in modo ordinato. Le proteine devono essere lavorate in modo da alterare pochissimo le loro proprietà di solubilità. Cristallizzazione delle proteine protezione controllata della proteina.
- Gli aggregati proteici si associano e formano contatti intermolecolari che assomigliano a quelli trovati nel cristallo finale. Gli aggregati raggiungono le dimensioni nucleari critiche, la crescita procede per aggiunta di molecole al reticolo cristallino.
- I processi di nucleazione e crescita dei cristalli si verificano entrambi in sovrasaturazione delle soluzioni.
cristallizzato prima? • Le proteine devono essere pure (> 99%) e completamente piegate Controlla l'attività della tua proteina se hai un saggio Controlla il folding con altri spettroscopici metodi La sorgente delle radiazioni X è un tubo non una lampadina, TUBO A RAGGI X. Il tubo a raggi x è costituito da un filo metallico che a temperature molto elevate trasmette elettroni che vengono accelerati grazie ad un campo elettrico verso un anodo A, poi con molta velocità urtano contro i nuclei e perdono ENERGIA CINETICA, che viene rilasciata sottoforma di RAGGI X. L’intensità(quantità) dei raggi X prodotti è molto bassa.
BRILLANZA= quantità di fotoni prodotti nell’unità di tempo e spazio, nell’unità angolare. Siccome il sistema dei TUBI A RAGGI X è limitato nella produzione dei RAGGI X si utilizzano i SINCOTRONI, che sono macchine enormi (europee), e l’intensità di fasci X prodotti è enorme. Gli elettroni vengono fatti ruotare lungo l’anello del sincotrone, vengono fatti oscillare lungo la direzione di propagazione, oppure rallentare, con un moto zig-zag, prima accelerano poi decelerano e questo permette la formazione di raggi X, che hanno una direzione tangenziale rispetto alla direzione degli elettroni. In questo modo l’intensità risultante è notevolmente superiore. Quindi lavorare con il laser, in modo che si possa lavorare con un fascio di raggi X, sono stati fatti esperimenti utilizzandolo, su nanocristalli. In questo caso il fascio risultante è monocromatico, fatto passare su campi magnetici in modo che si ottiene un moto a zig-zag e produrre in questo modo un FASCIO DI RAGGI X IN FASE, COERENTE. Nell’X-FEL il fascio di raggi x avrà una brillanza dell’ordine di 10 33 . DESY è UN CENTRO DI RICERCA HERA ANELLO DI SINCOTRONI XFEL ONDULATORI CHE PERMETTONO LA FORMAZIONE DI FASCIO DI RAGGI X
Biologia strutturale: determinazione della struttura delle biomolecole ● Imaging a singola particella - Determinazione della struttura di molecole / oggetti che non può essere raggiunta con la diffrazione a raggi X standard - Per determinare la funzione è necessaria la risoluzione atomica - Grandi macromolecole o gruppi macromolecolari ● particelle di virus ● Membrane proteiche e assemblaggi ● Intere cellule - Processi dipendenti dal tempo ● ad es. primi passi del ripiegamento delle proteine ● Dinamica delle macromolecole - Utilizzo della spettroscopia sugli atomi della sonda - Phonon density-of-state. XFEL viene utilizzato nella Biologia strutturale per studiare singole proteine, singole strutture biologiche, per avere informazioni che con altre tecniche non sono possibili. Ovviamente la durata dell’impatto del fascio sulla proteina è dell’ordine dei femtosecondi. In 4 femtosecondi il segnale emesso viene rilevato dal detector. La proteina esplode in 5 femtosecondi, in un’esplosione columbiana. Questo è stato calcolato da un tale attraverso una simulazione, e con questa ha ottenuto un finanziamento.SVOLTA? LA NUOVA RIVOLUZIONE PROTEOMICA? Il NYSBC è il centro principale degli stati uniti d’america per la biologia strutturale con strutture ineguagliabili per la risonanza magnetica nucleare Spettroscopia (NMR), Cryoelectron Microscopy (CEM) e Cristallografia a raggi X. Le strutture di ricerca del NYSBC includono strumentazione all'avanguardia per analizzare proteine e altre molecole che innescano malattie come batteri e virus infezioni; malattia e neurodegenerazione; e trauma. Il NYSBC si trova a 133rd Street e Convent Avenue a Manhattan.
