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Appunti di bioinformatica UNIVPM secondo modulo seconda parte
Tipologia: Appunti
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Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Una delle tecniche analitiche più diffusa nel campo della ricerca è la risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica permette di analizzare, individuare ma soprattutto scoprire nuove molecole, studiare la struttura primaria e secondaria delle proteine, analizzare il contenuto di alimenti, piante e bevande. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare è una tecnica di analisi che si basa sulla misura degli assorbimenti energetici che si osservano quando nuclei dotati di spin attivo immersi in un campo magnetico, vengono eccitati con radiazioni elettromagnetiche nel campo delle radiofrequenze. Il risultato delle misure si rappresenta mediante spettri di assorbimento. Gli esperimenti più semplici utilizzano una sola dimensione, mentre quelli più sofisticati si estendono a più dimensioni, fino alla quarta. I nuclei dotati di proprietà magnetiche e maggiormente utilizzati nell’identificazione dei composti presenti in natura sono: gli isotopi più abbondanti 1 H (99.9% in natura) e 31 P (100% in natura) e quelli meno abbondanti come l’isotopo 13 C (1.1% in natura) e 15 N (0.37% in natura). I principi fisici fondamentali su cui si basa il fenomeno dell’NMR riguardano le proprietà magnetiche dei nuclei (atomi). Tutti i nuclei possiedono una carica ed in alcuni, questa carica ruota attorno all’asse nucleare. Questo movimento di carica produce un dipolo magnetico orientato parallelamente all’asse nucleare e caratterizzato da un momento magnetico m. Inoltre ad ogni nucleo è associato un numero quantico di spin (I) che è caratteristico di ogni nucleo; I può assumere valori diversi come I=0 per i nuclei senza spin o valori frazionari od interi (1/2 e suoi multipli). Il numero di spin determina il numero di orientazioni che un nucleo può assumere in un campo magnetico statico uniforme B0, in accordo con la seguente formula: (1) 2I+ Considerando nuclei con I pari ad ½ si hanno due possibili orientazioni (cioè due stati di spin) che corrispondono a due livelli energetici differenti: a o -1/2 che corrisponde allo stato ad energia minore e b o +1/2 che rappresenta lo stato ad energia maggiore. In assenza di campo magnetico tutti gli stati energetici sono degeneri, ossia hanno la stessa energia. Quando invece applichiamo un campo magnetico B0, la differenza di energia tra due stati dipende dall’intensità campo magnetico statico applicato: (2) DE = (hg/2p) B
Dove h è la costante di Plank, g è il rapporto giromagnetico, una costante caratteristica di ciascun nucleo, legata al momento magnetico m ed al numero di spin. Data la presenza di due livelli energetici, se si fornisce energia sottoforma di radiazione elettromagnetica applicando un campo a radiofrequenza (n1), gli atomi vengono eccitati: ciò significa che passano da uno stato ad energia minore and uno stato ad energia maggiore. Affinché ci sia questa transizione la frequenza che sarà applicata dovrà rispettare le seguenti leggi: (3) DE = hn (4) n = (g/2p) B Rispettando le leggi fisiche (3) e (4) il sistema si trova in condizioni di risonanza. A questo punto i nuclei non potranno rimanere nello stato ad energia superiore all’infinito ma, dopo un certo tempo, cominceranno a ritornare nello stato di energia iniziale (più basso). Durante questo “salto” energetico i nuclei hanno assorbito energia e successivamente quando ritornano allo stato di energia più basso, emettono energia che si traduce in uno spettro NMR. Lo spettro è l’espressione grafica di ciò che avviene a livello microscopico. La rappresentazione grafica (spettro) rappresenta come e dove i nuclei sono posizionati nella struttura chimica di una qualsiasi molecola. La foto sottostante rappresenta la struttura “spaziale” di uno spettrometro da 900Mhz, uno dei più potenti e sofisticati strumenti, che permette le analisi strutturali delle molecole chimiche!
all’orientamento a più bassa energia, emettendo l’energia che era stata fornita, che dipende non solo dal campo magnetico ma anche dall’intorno chimico del nucleo. E’ QUESTO IL FENOMENO DELLA RISONANZA. SI VIENE AD AVERE COME RISULTATO UNO SPETTRO. Alcuni nuclei (1H, 13C, 15N, 31P) hanno momento angolare. Utilizzando campi magnetici elevati possiamo separare i livelli di energia dei nuclei con diversi momenti angolari di spin. lo spin si allinea lungo il campo, ma l’assorbimento della radiazione elettromagnetica di frequenza appropriata (radio) induce una transizione. Quando i nuclei tornano al loro stato di equilibrio emettono radiazioni; può essere misurata la frequenza esatta della radiazione emessa che dipende dall'intorno del nucleo. NMR: chemical shifts La frequenza esatta delle radiazioni emesse dipende dall'intorno del nucleo. Nuclei con diversi intorno chimico assorbiranno a frequenze leggermente diverse. Queste diverse frequenze (relative ad un segnale di riferimento) sono chiamati spostamenti chimici. Salti per tutti gli idrogeni in questa piccola molecola: idrogeni che sono parte del CH3, o CH2 o gruppo OH Hanno differenti comportamenti(salti energetici, differenti spettri). Ad esempio nello spettro dell’etanolo, è possibile vedere gli idrogeni che risentono dell’intorno chimico e in base alle informazioni che otteniamo possiamo ricostruire le molecole. Ogni idrogeno ha un intorno differente in base agli atomi con cui interagisce, e questo dipende dal tipo di amminoacidi che sono vicini nell’esperimento
considerato. Il segnale che ogni idrogeno fornisce dipende dagli idrogeni vicini, dipende dalla loro distanza. Però si deve tenere conto degli ingombri sterici. Se osserviamo su PDB le strutture risultanti mediante tecnica NMR non sarà una sola ma saranno tante. Ci saranno regioni in cui i risultati di diversi esperimenti saranno molto simili, altri in cui i risultati si assomigliano poco o per nulla, questo perché bisogna ricordare che le proteine sono in soluzione, quindi si muovono. Le distanze degli idrogeni variano, è possibile determinare valori medi (esempio delle corde che se non vengono bloccati gli estremi si aprono). La parte più a contatto col solvente si muove di più rispetto alla parte che non lo è, e questo significa che è quella più importante da studiare. NMR: proteine Per le proteine tali spettri NMR unidimensionali contengono un tale grande numero di picchi sovrapposti da non essere ben interpretabili. Ma è possibile per progettare esperimenti NMR 2D, i cui risultati sono tracciati in un diagramma. La diagonale corrisponde al solito Spettro 1D. Il picco fuori dalla diagonale risulta dalle interazioni tra atomi di idrogeno che sono vicini nello spazio. I processi di rilassamento sono molto sensibili sia alla geometria che al movimento della molecola: tipicamente solo interazioni tra atomi che sono distanti meno di 5 Å.
NMR vs cristallografia proteica § entrambi possono generare strutture a risoluzione atomica § entrambi hanno bisogno di grandi quantità di proteine purificate NMR § NMR non ha bisogno di cristalli ma determina la struttura del proteina in soluzione (tuttavia è una soluzione piuttosto non fisiologica) § L'NMR è limitato alle piccole proteine (30 kDa è già una sfida) § facile rilevare quale bit di una proteina interagisce con i ligandi § le strutture non sono molto accurate (numero insufficiente di interazioni) Proteine con la cristallografia § necessità di ottenere cristalli (spesso piuttosto difficili) § la struttura può essere molto accurata § nessuna limitazione delle dimensioni (sono state risolte strutture fino a 106 dalton) Qual è la vera struttura proteica? ● Raggi X - stato "congelato" di una proteina ● contatti di cristallo ✔ grande struttura proteica ● NMR ✔ proteine in soluzione - dimensioni limitate