Scarica Dispende Microscopia e più Dispense in PDF di Microscopia solo su Docsity!
MICROSCOPIA
Analisi Morfologica Le cellule e i tessuti si possono studiare dal punto di vista morfologico, biochimico e funzionale. L’analisi morfologica prende in esame l’organizzazione strutturale delle cellule, delle varie parti di esse e dei costituenti extracellulari; allo s copo, si avvale dei microscopi, che sono strumenti atti ad ingrandire l’immagine delle strutture prede in esame. Una premessa necessaria riguarda l’impiego dei termini microscopia ottica e elettronica. Ciò che contraddistingue le du tecniche è la natura del mezzo con cui si analizza l’oggetto e cioè, rispettivamente, la luce e gli elettroni. I microscopi ottici si distinguono nuovamente in:
- Microscopi ottici semplici : costituiti da una sola lente
- Microscopi ottici composti : costituiti da due o più lenti. (campo chiaro, campo scuro, contrasto di fase, a fluorescenza..) Semplice Composto I microscopi elettronici sono invece così distinti:
- Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
- Microscopio elettronico a scansione (SEM) ERNST ABBE Ernst Abbe è considerato il padre della moderna microscopia in quanto consolidò le basi di questa scienza grazie all’introduzione della sua famosa formula teorica. Quest’ultima rappresenta la formula che lega il potere risolutivo di uno strumento alle caratteristiche del sistema stesso ed alla lunghezza d’onda della luce usata secondo la seguente espressione:
Retina
Lente semplice
Campione
Immagine
virtuale
2 °Lente
Immagine intermedia
1° Lente
Campione
Campione
𝝀 𝟐𝒏 ⋅ 𝒔𝒆𝒏𝜶 ]-> formula di Abbe R/D = limite di risoluzione, 𝝀 = lunghezza d’onda della luce N =indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente (solitamente ARIA (n=-1)) α = angolo di apertura della lente obiettivo. (massima quantità di luce che l’obiettivo è in grado di ricevere per l formazione delle immagini) N x sin a= apertura numerica Il potere di risoluzione, in particolare, è la capacità di distinguere come separati due punti molto vicini tra loro. L’occhio umano è capace al massimo di risolvere particolari fino a 0,3 mm, il microscopio ottico fino a 0,2 u m, mentre il microscopio elettronico fino a 0,2 nm. Aumentando l’ingrandimento ci si rende conto sperimentalmente che, oltre un certo limite, non si distinguono particolari ulteriori, cioè no cresce il potere di risoluzione. Si dice allora che l’ingrandimento UTILE del microscopio ottico è circa mille volte (1000x) e il suo potere risolutivo è di 0,2 u m. Questo limite risolutivo è il massimo che si può ottenere da qualunque microscopio su base ottica. La ragione di questo limite va ricercata nella natura ondulatoria delle reazioni luminose. Infatti, il limite di risoluzione R viene espresso dalla formula di E. Abbe (λ è la lunghezza d’onda della luce, n l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente - solitamente aria- e a il semiangolo di apertura della lente obiettivo. Il prodotto fra n e sen a viene definito apertura numerica. Dato che l’indice di rifrazione dell’aria è circa 1 e sen a può essere genericamente considerato, prossimo a 1, R risulta proporzionale a 1/2 λ, cioè alla metà della lunghezza d’onda della luce. Considerando che la luce con lunghezza d’onda di 400 nm, il potere di risoluzione sarà quindi pari a 200 nm (0, 2 u m); ciò corrisponde a quanto verificato sperimentalmente. Si deduce che, per migliorare il limite di risoluzione di un microscopio, non potendo agire incrementando sen a , una via possibile è quella di aumentare il valore dell’indice di rifrazione del mezzo interposto (n). si potrà interporre pertanto fra la lente frontale e oggetto un mezzo con indice di rifrazione più alto, come per esempio una goccia d’olio con indice di rifrazione all’incirca pari a quello del vetro (1,5): in questo caso si parla di osservazione microscopica ad IMMERSIONE che permette di distinguere come separati punti distanti più di 0,1 u m. In alternativa, si può utilizzare luce a lunghezza d‘onda minore, quale la radiazione ultravioletta (λ pari a 250 - 350 nm) con la quale si può raggiungere un potere di risoluzione di 0,1 u m, che rappresenta il limite estremo della microscopia ottica. In questo caso, essendo la luce ultravioletta invisibile all’occhio umano, per il rilevamento delle immagini occorre fare ricorso a pellicole fotografiche sensibili all’ultravioletto. IL POTERE DI RISOLUZIONE DI UN MICROSCOPIO OTTICO :
POTERE DI ACCOMODAZIONE: Capacità del cristallino di modificare la distanza focale (messa a fuoco). In altre parole, è il meccanismo autonomo dell’apparato visivo, attuato attraverso l’aumento della curvatura della superficie anteriore del cristallino tramite muscolo ciliare, che permette di creare sulla retina immagini a fuoco (vedi immagine 1.2). Il potere di accomodazione si arresta verso i 20-25 cm. A tale distanza si possono distinguere due punti che distano fra di loro 0,2 mm.
Limiti di risoluzione:
- Occhio umano: 0,2 mm
- Microscopio ottico: 0, 2 u m
- Microscopio elettronico: 0,2 nm PERCORSO OTTICO E RISOLUZIONE DEL MCROSCOPIO OTTICO: I microscopi ottici sfruttano l’uso di lenti convergenti, ossia lenti in grado di far convergere il fascio luminoso in un punto detto fuoco (img.1.3). Le lenti si presentano più spesse al centro e più sottili verso i bordi.
Le lenti convergenti possono formare due tipi di immagini:
- immagini reali
- immagini virtuali
- Quando l’oggetto si trova, rispetto al fuoco, ad una distanza maggiore della distanza focale del sistema di lenti fornito dall’obiettivo, si formerà un’immagine reale, capovolta ed ingrandita, definita immagine intermedia (IR).
- Distanza (P) oggetto (B) - fuoco (F) > distanza (Q) centro della lente (O) - fuoco (F) = immagine reale, capovolta ed ingrandita. (img. 1.4)
Schematizzazione del cambiamento
strutturale del cristallino durante il
processo di accomodazione.
Centro ottico: è il punto attraverso il quale i raggi
luminosi passano senza cambiare direzione. È
situato al centro della lente.
F: rappresenta il fuoco, ossia il punto in cui i raggi
luminosi convergono.
Distanza focale: è la distanza tra il cento ottico e il
fuoco.
2)La lunghezza del tubo del microscopio è calcolata in modo tale che l’IR cada all’interno della distanza focale dell’oculare, il quale produrrà un’immagine virtuale, ingrandita e dritta ma capovolta rispetto all’oggetto. La distanza tra l’immagine reale e il fuoco risulta quindi minore della distanza focale.
- Distanza immagine reale – fuoco < distanza centro della lente dell’oculare – fuoco = immagine virtuale, dritta ed ingrandita. (img. 1.5) 1. L’ingrandimento finale è il prodotto dell’ingrandimento dato dall’oculare e di quello dato dall’obiettivo. SCHEMA MICROSCOPIO COMPOSTO: Apparato ottico: Apparato meccanico: Apparato di illuminazione: obiettivo braccio sorgente di luce oculare basamento condensatore revolver diaframmi tavolino portaoggetti viti macrometrica e micrometrica Apparato ottico: Il tubo portaottica sorregge una coppia di oculari dal lato dell’osservatore (uno solo per i microscopi detti monoculari) e gli obiettivi dal lato del tavolino portaoggetti su cui viene appunto esposto l’oggetto da osservare. Gli obiettivi sono montati su una torretta girevole denominata revolver che consente una loro
Gli stereomicroscopi sono strumenti progettati in modo differente dal microscopio ottico convenzionale, e per una differente finalità. Sono dotati di coppie di obiettivi e oculari che lavorano simultaneamente dando una visione realistica del soggetto. Sono adatti all'osservazione di insetti, foglie, pietre, circuiti elettronici, fibre, tessuti o per eseguire attività come dissezione, determinazione di macroinvertebrati e microchirurgia MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO CHIARO: E’ lo strumento più in uso per lo studio dei preparati fissati ma non consente un buono studio di materiale biologico “a fresco” poiché fornisce solo un debole contrasto. Il campione è visualizzato grazie alla luce che passa direttamente dal condensatore al vetrino. Si può optare per diversi ingrandimenti. Il potere di risoluzione della microscopia a campo chiaro (determinato dalla lunghezza d'onda della luce usata per illuminare il campione e dal suo angolo di entrata negli obiettivi) è il fattore limitante di questa tecnica: può arrivare al massimo a discriminare dettagli nell'ordine del decimo di micron, usando lenti a immersione in olio. Spesso sono usate delle colorazioni, dato che gli indici di rifrazione degli organismi e dello sfondo spesso sono simili e risulta difficile distinguere il campione. MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO SCURO: Il normale condensatore in campo chiaro è sostituito con un condensatore (paraboloide) che deflette il fascio di luce in modo tale che attraversi l’oggetto con forte obliquità proseguendo in massima parte fuori dal sistema ottico. In questa tecnica si utilizza uno speciale condensatore, munito di diaframma, applicato ad un comune microscopio ottico: esso consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano raggiunti soltanto dalla luce difratta (oppure diffusa) che attraversa il campione. Il microscopio a campo oscuro si ottiene collocando un diaframma apposito (detto: “diaframma per campo oscuro”) sotto al sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico. Si viene cosi’ a creare un cono di luce cavo che colpisce l’oggetto: solo la luce riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l’immagine, diversamente da quanto accade nel campo chiaro. Il condensatore ha lo scopo di dare al preparato un’illuminazione radente, lasciando buia la parte inquadrata dall’obiettivo. In questo modo, soltanto i raggi che hanno attraversato la struttura biologica verranno raccolti dall’obiettivo, mentre quelli che attraversano il mezzo invece verranno deviati fuori dal campo di osservazione. Dal momento che il percorso seguito dalla luce della sorgente non è più rettilineo e che parte delle sue componenti sono state inoltre filtrate, l’occhio dell’osservatore percepirà il tipico effetto del campo scuro. Nella microscopia a campo scuro in particolare, è possibile osservare strutture batteriche quali i flagelli di Treponema pallidum , solitamente di dimensioni ben al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico.
Questa tecnica inoltre risulta molto utile per osservare le diatomee (normalmente invisibili in campo chiaro) ed è sfruttata in diagnostica clinica per un particolare esame del sangue (detto: “ esame del sangue vivo ”), che consente tra l’altro di verificare facilmente la presenza di parassiti di varie specie.
2. Microscopio in campo chiaro 3. Microscopio in campo oscuro E’ lo strumento più in uso per lo studio dei preparati fissati Ha un condensatore che deflette il fascio di luce in modo tale che attraversi l’oggetto con forte obliquità proseguendo in massima parte fuori dal sistema ottico Non crea un buono studio di materiale biologico “a fresco” a causa del debole contrasto MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE Esistono delle differenze molto piccole di indice di rifrazione tra le cellule e la soluzione circostante, e anche che nelle cellule stesse tra il citoplasma ed il nucleo. Per esempio, un’onda luminosa, quando passa attraverso un nucleo di una cellula, risulta in ritardo di un quarto di lunghezza d’onda rispetto ad un’onda luminosa che attraversa solo l’acqua. Questo ritardo viene chiamato differenza di fase. Prima di entrare nel preparato le onde luminose sono "in fase", cioè la loro ampiezza e la loro frequenza erano uguali e le onde si sovrapponevano in modo che i massimi di una si trovassero in corrispondenza dei massimi dell’altra, quindi in questo modo le onde si rafforzavano a vicenda. Dopo essere passate in mezzi differenti, non sono più in fase. Il microscopio a contrasto di fase ha un diaframma ad anello, detto anello di fase , posto nel condensatore, che lascia passare la luce solo sottoforma di una corona circolare così che alla lente del condensatore arriverà un fascio di luce conico, cavo (vuoto) al centro. All’uscita di ogni punto del preparato, ci sono due raggi, uno trasmesso e uno difratto, che è deviato e sfalsato rispetto a quello trasmesso di 1\x l, dove x dipendente dalla densità del mezzo in cui è passato. Successivamente c’è un disco trasparente con una scanalatura circolare (lamina di fase) posto nel piano focale dell’obiettivo (cioè al suo interno) in modo tale che i raggi trasmessi vengono a passare nella scanalatura (dove il vetro è meno spesso),nmentre quelli diffratti, avendo un percorso diverso rispetto ai trasmessi, passano dove il vetro ha maggior spessore per cui vengono ulteriormente ritardati di 1\4 l, il quale deve essere sommato al ritardo precedente per avere il ritardo totale dei raggi diffratti rispetto a quelli trasmessi (1\x + 1\4).
MICROSCOPIO INTERFERENZIALE DI NOMARSKY:
E’ fondato sui principi del microscopio a contrasto di fase. Permette lo studio di oggetti trasparenti non colorati in cui appaiono gli aspetti tridimensionali dei preparati. Consente di osservare i diversi piani di un oggetto relativamente spesso fornendo immagini con caratteristico rilievo. Questo tipo di microscopio utilizza la luce polarizzata (in cui le onde luminose vibrano su un solo piano). La luce polarizzata, tramite un particolare prisma di Wollaston, viene scissa in due raggi divergenti tra loro di una piccola distanza (variabile da obiettivo a obiettivo) e compresa tra 1 e 0,1-0,2 u m (minima distanza risolvibile dall’obiettivo usato). In questo modo un raggio colpisce un certo punto dell’oggetto e l’altro punto immediatamente vicino ma compreso all’interno della risoluzione dell’obiettivo. Tra i due raggi si viene a creare una certa sfasatura, dipendente dall’indice di rifrazione e dallo spessore dei mezzi attraversati. Tramite un secondo prima di Wollaston i due raggi vengono fatti interferire e l’immagine che si ottiene è simile a quella del contrasto di fase, con un più evidente effetto tridimensionale.
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA :
Con questo microscopio il preparato viene illuminato con luce ultravioletta a una determinata lunghezza d’onda e i suoi componenti vengono esaminati in base alla fluorescenza emessa. La sorgente luminosa è una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette, quindi invisibili. La fluorescenza è il fenomeno per cui determinate sostanze, dette fluorescenti, colpite delle radiazioni ultraviolette emettono luce di lunghezza d’onda maggiore quindi VISIBILI. Essa dipende dal rilascio di energia da parte degli elettroni di una molecola che, eccitati dalla luce ultravioletta, passano da un determinato orbitale all’orbitale superiore. Gli elettroni eccitati sono però instabili e tendono a ritornare al punto di partenza, restituendo l’energia sotto forma di calore e luce. La luce emessa viene chiamata appunto, fluorescenza. Poiché è parte dell’energia assorbita viene ceduta sotto forma di calore, la luce emessa avrà energia minore di quella eccitante e, di conseguenza, una maggior lunghezza d’onda, per cui rientra nel campo visibile. Si possono avere due tipi di fluorescenza:
- Fluorescenza naturale, primaria o autofluorescenza: prodotta da sostante presenti nel tessuto come la clorofilla, la vitamina A, la riboflavina e le porfirine.
- Fluorescenza secondaria: indotta da una “colorazione” detta fluorocromizzazione con coloranti fluorescenti detti fluorocromi. Questi si legano in modo selettivo a diversi componenti cellulari e/o tessutali e nel consentono la visione al microscopio a fluorescenza. Sono oggi disponibili in commercio numerosi fluorocromi, i più adoperati sono l’arancio di acridina che presenta particolare affinità con le nucleoproteine e gli acidi nucleici, lo ioduro di propidio che colora in rosso il DNA e il DAPI che dà un’intensa colorazione di blu al DNA, specie per i tratti ricchi di adenina e timina. Un tempo nei microscopi a fluorescenza, la lampada a vapori di mercurio era messa sotto il condensatore (ipofluorescenza), per cui la luce ultravioletta attraversava il preparato eccitandolo. La luce ultravioletta, per
evitare danni alla vista, veniva fermata prima di arrivare all’oculare da appositi filtri di sbarramento. All’occhio dell’osservatore arrivavano solo i raggi luminosi emessi per fluorescenza, peraltro affievoliti a causa dell’eccessivo assorbimento della luce da parte dei diversi sistemi diottrici da essa attraversati. Attualmente si preferisce utilizzare un sistema molto più sensibile denominato epifluorescenza, nel quale il preparato viene eccitato dall’alto. Tale microscopio, si avvale di una sorgente luminosa ad alta energia (lampada a vapori di mercurio, ad argon o allo xenon), di un filtro d’eccitazione (lascia passare la luce a λ che eccita il fluorocromo in uso), un filtro di sbarramento lascia passare la luce a λ corrispondente a quella emessa dal fluorocromo) e uno specchio dicroico (riflette la luce a λ pari o inferiore a quella di eccitazione e trasmette la luce a λ superiore a quella di eccitazione). Non tutti gli obiettivi sono idonei per essere utilizzati nelle osservazioni in fluorescenza; quelli più adatti sono detti obiettivi a fluorite ( o con lenti a fluorite) e sino identificati con la sigla FLUOR o FL. Il grande sviluppo della microscopia a fluorescenza si deve anche alla produzione di moltissimi fluorocromi, che emettono luce a diversa lunghezza d’onda, consentendo la visualizzazione e localizzazione contemporanea di tipi cellulari distinti o di organuli diversi all’interno di una cellula. Immunofluorescenza: Colorazione con anticorpi coniugati con fluorocromi per evidenziale in situ costituenti che sono specifici antigeni. ANTIGENE: sostanza immunogenica, cioè in grado di indurre una attivazione del sistema immunocompetente che porta alla formazione di anticorpi. ANTICORPO: proteine del siero prodotte in seguito all’esposizione ad un antigene che formano con essi un complesso immune. L’immunofluorescenza è la tecnica utilizzata per etichettare un antigene bersaglio con uno specifico fluorocromo. Il fluorocromo è un composto chimico fluorescente che può emettere la luce dopo eccitazione che si lega all’anticorpo. Quando poi l’anticorpo si lega all’antigene bersaglio, consente il rilevamento della molecola bersaglio nel campione. Per descriverlo ulteriormente, quando un antigene si lega a un anticorpo specifico, può essere coniugato con il fluorocromo. Quindi risulta facile rilevare la presenza dell’antigene bersaglio nel campione quando si osserva al microscopio a fluorescenza. Inoltre, ci sono due tipi di immunofluorescenza: quella diretta e quella indiretta.
Metodo diretto: l’anticorpo marcato si lega con l’antigene. Questo metodo non permette una buona visibilità al microscopio. Metodo indiretto: l’antigene reagisce con un anticorpo non marcato, detto “anticorpo primario”. Successivamente un anticorpo marcato, definito secondario, reagisce con il complesso antigene-anticorpo. Più anticorpi marcati si legano a questo complesso, più buona sarà la visione al microscopio. Un altro vantaggio del metodo indiretto, è che si può evitare che le sostanze chimiche impiegate per marcare l’anticorpo, modifichino la specificità dell’anticorpo primario, infatti ciò gli potrebbe impedirebbe di legarsi all’antigene. È possibile marcare l’anticorpo secondario con metodi colorimetrici. Si coniuga l’enzima perossidasi con l’anticorpo secondario. Dopo ciò l’enzima viene individuato con una reazione chimica a base di diaminobenzidina (DAB) e di acqua ossigenata. L’azione dell’enzima su queste due sostanze porta alla formazione di un precipitato di colore rosso mattone, li quale permette di individuare l’antigene. Un altro enzima molto utilizzato è la fosfatasi alcalina. Perché viene usato questo metodo? Perché occorrono poche molecole di enzimi per produrre una reazione visibile al microscopio. Un ulteriore metodo è marcare l’anticorpo secondario con isotopi radioattivi, come lo iodio radioattivo. Per individuarlo viene impiegata l’autoradiografia. IMMUNOISTOCHIMICA: è una tecnica in grado di individuare specifiche molecole o strutture del compartimento intra- o extra cellulare basandosi sulla specificità della reazione antigene/antiorpo. Gli anticorpi specifici, ottenuti immunizzando un animale contro un antigene di cui si vuole studiare la locazione, vengono coniugati con una sostanza fluorescente (fluorescina o rodamina) o con una molecola opaca agli elettroni, quale la proteina ferritina, oppure marcati con particelle di oro colloidale. La sezioni di tessuto sono poi esposte all’anticorpo, in modo che questo si leghi solo nei siti del tessuto in cui è presente l’antigene.se l’anticorpo viene marcato con fluorescina o rodamina, si formerà un complesso antigene- anticorpo visibile al microscopio a fluorescenza; se viene marcato con ferritina o oro colloidale, sarà visibile al microscopio elettronico. Quando si fa legare direttamente l’anticorpo marcato all’antigene si parla di metodo diretto, che però è spesso poco sensibile. Nel cosiddetto metodo indiretto, usato più comunemente, l’antigene viene prima fatto reagire con un anticorpo non marcato (anticorpo primario); successivamente, una volta che si è formato il complesso antigene-anticorpo, si fa reagire con un altro anticorpo, questa volta marcato, contro l’anticorpo primario (anticorpo secondario). Più copie dell’anticorpo primario si possono legare con quello secondario in modo da fornire un segnale più evidente; inoltre si esclude che la specificità dell’anticorpo primario venga modificata dai procedimenti chimici impiegati per la marcatura. L'identificazione dell’anticorpo secondario, oltre che per fluorescenza può essere effettuata con metodi colorimetrici. L’immunoistochimica ha infatti compiuto un notevole progresso con l'impiego dell’enzima perossidasi. Questo enzima può essere coniugato con l'anticorpo secondario e successivamente rivelato per mezzo di una reazione isochimica usando come
substrato la diaminobenzidina (DAB) e l'acqua ossigenata. L'azione dell'enzima perossidarsi sul substrato determina un precipitato colore rosso mattone che consente di localizzare l'antigene. Altro enzima molto utilizzato come marcatore è la fosfatasi alcalina. L'utilizzo di anticorpi marcati con enzimi ha consentito di incrementare la sensibilità dei metodi immunoistochimica chimici in quanto occorrono poche molecole di enzimi per produrre una reazione visibile al microscopio. Si può anche marcare l'anticorpo secondario con isotopi radioattivi, come per esempio lo iodio radioattivo, ricorrendo, per la rivelazione, al autoradiografia.
Microscopio confocale:
Nella microscopia ottica tradizionale, il preparato è ridotto in sottili sezioni e quanto più la sezione è sottile tanto più sarà elevata la qualità dell’immagine. Nel processo di sezionamento, però si perde la tridimensionalità dell’oggetto; se poi si osserva una struttura biologica senza sezionarla, l’eccessivo spessore dà immagine confuse, dovute alla sovrapposizione del piano focale su cui si è stato regolato il microscopio, con i piani immediatamente soprastanti e sottostanti. Inoltre, quando i campioni fluorescenti sono osservati con un microscopio a fluorescenza tradizionale, la fluorescenza secondaria delle zone più lontane dal punto di osservazione spesso interferiscono con le parti che sono focalizzate. Questo problema è tanto più grande nel caso in cui il campione abbia uno spessore maggiore di 2 mm. Gli inconvenienti possono essere superati con il microscopio confocale il quale, con dispositivi elettronici, focalizza solo un determinato piano per volta, eliminando le informazioni luminose che provengono dalle zone sovra- e sotto fuoco. Viene cioè registrata ogni volta una ben precisa sezione ottica sottile. Dall’unione delle immagini relative alle differenti sezioni ottiche sottili, registrate a diversi livelli del preparato, è possibile ricostruire, con l’ausilio di un computer, l’immagine tridimensionale della struttura in esame anche se di notevole spessore. Per bloccare quanto più possibile l’informazione derivante dai piani sopra e sottostanti a quello desiderato è stata aggiunta, alla struttura del microscopio tradizionale, una piccola apertura denominata Pinhole che permette di illuminare solo una zona molto limitata del campione e di raccogliere solo la luce proveniente da essa. Differentemente dal microscopio tradizionale, in quello confocale, varia anche la sorgente luminosa che diviene infatti un fascio laser.
- LASER: fascio di luce coerente e monocromatica concentrata in un raggio rettilineo estremamente coinciso. Elevatissima luminosità. *PRINCIPIO DI MINSKY: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo elemento del volume dell’oggetto biologico, ovvero sono confocali. Funzionamento:
- La sorgente luminosa data da un fascio di laser viene concentrata in un foro confocale (pinhole) la cui immagine, riflessa da uno specchio dicroico, viene focalizzata dall’obiettivo solo in un ben
Quando due molecole si sovrappongono ma si trovano su due piani focali diversi, si parla di falsa o apparente colocalizzazione. Per comprendere se si tratta di una vera colocalizzazione ossia se due molecole si trovano realmente ravvicinate su uno stesso piano focale bisogna analizzare separatamente i singoli piani, con appunto l’ausilio del microscopio confocale. Confocal live image: Il grande sviluppo del microscopio confocale è dovuto anche al fatto che esso consente una buona visione di cellule e tessuti in vivo. La maggior parte dei fluorocromi usati in epifluorescenza era citotossica e perciò dannosa alle cellule viventi. La messa a punto di molecole fluorescenti vitali, quali la proteina fluorescente verde (green fluorescent protein, GFP) e i suoi derivati, ha superato questo limite consentendo l’osservazione in vivo di cellule o strutture che, per il loro spessore, non darebbero immagini accettabili con i tradizionali microscopi. Queste proteine intrinsecamente fluorescenti:
- possono essere fuse geneticamente alla proteina da marcare
- sono biocompatibili e il legame target è forte
- la fisiologia della cellula o dell’organismo non viene significativamente alterata ed è per questo che sono sonde ideali per l’osservazione “in vivo”.
- È possibile creare linee cellulari o organismi transgenici che esprimono direttamente la proteina marcata anziché quella normale. Viene costruito un vettore virale o batterico, che contiene sequenzialmente il gene per GFP e per la proteina da studiare. Successivamente viene introdotto in cellule in cultura o in ovociti/embrioni ed infinite avverrà l’espressione di una chimera GFP proteina. FRAP e FRET Il microscopio confocale consente, inoltre, di studiare la mobilità e le interazioni delle molecole mediante le tecniche FRAP (recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento) e FRET (trasferimento di energia per risonanza durante la fluorescenza).
- La tecnica FRAP è relativamente semplice ed è utilizzata per misurare la mobilità delle molecole e si avvale del photobleaching. Il recupero di fluorescenza, registrato nel corso del tempo, può essere poi misurato in modo tale che fornisca il tasso di trasporto o le costanti di diffusione delle molecole. Come avviene? Un laser (luce molto intensa e concentrata su una zona limitata del preparato) porta il fluorocromo al potobleaching, cioè gli fa perdere definitivamente fluorescenza (in modo irreversibile). Altre molecole fluorescenti accanto alla zona colpita da laser, riempiono lo spazio dove era scomparsa la fluorescenza facendogliela riacquistare. Questo è possibile solamente se le molecole sono in grado di moversi. La tecnica FRAP utilizza questo meccanismo. PHOTOBLEACHING: fotosbiancamento delle molecole fluorescenti di una definita zona tramite un’intensa illuminazione e all’ossidazione del fluorocromo determinata da radicali liberi dell’ossigeno.
- La tecnica FRET permette di studiare le iterazioni tra molecole. Si avvale del quenching (smorzamento) che consiste nel trasferimento di energia da una molecola fluorescente (donatrice) a un’altra molecola fluorescente (accettore), che si trova fisicamente vicina al fluorocromo eccitato (donatore). Il secondo fluorocromo si eccita ed emette fluorescenza solo se è posto ad una distanza minore di 10nm e ciò spiega che è avvenuta un’iterazione fra le due molecole, scopo principe di questa tecnica. Questi fluorocromi in grado di eccitare i fluorocromi ad una distanza inferiore a 10 nm vengono definiti tandem e possiedono stoked shift maggiori, pertanto consentono di utilizzare una quantità maggiore di colori per singola lunghezza d’onda laser. STOKES SHIFT: differenza (in unità di lunghezza d’onda o frequenza) tra le posizioni dei massimi degli spettri di eccitazione e di emissione di un fluorocromo. SPILLOVER: è un fenomeno che avviene quando le fluorescenze di due o più fluorocromi si sovrappongono. Quando accade diventa difficile comprendere quale quota di fluorescenza sia propria di un fluorocromo e quale dell'altro. Per risolvere questo problema, si ricorre alla “compensazione della fluorescenza”, grazie alla quale è possibile attribuire ad ogni fluorocromo il suo valore appropriato di fluorescenza. A questo scopo per ogni fluorocromo viene sottratta la fluorescenza “marginale”, cioè la fluorescenza che si allontana dall’emissione massima e si va a sovrapporre a quella del fluorocromo vicino. I moderni citromeri eseguono automaticamente la compensazione della fluorescenza mediante il loro software. Microscopia confocale: vantaggi e svantaggi Vantaggi:
- Miglioramento della qualità delle immagini: migliore risoluzione e contrasto, minor “rumore di fondo” (->presenza di fluorescenze su più piani che rendono l’immagine non nitida)
- Rapidità di acquisizione e archiviazione di immagini
- Sezionamento ottico XY e Z (evita la preparazione di sottili sezioni e permette di effettuare una ricostruzione 3D del campione) + aumento risoluzione sui tre assi XYZ
- Permette di lavorare su cellule vive (si evitano gli artefatti di fissazione e inclusione)
- Possibilità di eseguire osservazioni in time-lapse
- Possibilità di effettuare analisi di colocalizzazione Svantaggi:
- Costo elevato
- Alta fototossicità
- Alto rischio di photobleaching (il photobleaching può essere indotto in funzione della tecnica FRAP, ma se questo fenomeno avviene spontaneamente risulta problematico poiché impedisce la fluorescenza e, di conseguenza, di vedere ed analizzare il campione).
ACRIDINA (nucleo e citoplasma verde- vacuoli acidi arancione) NILE RED (lipidi neutri giallo- lipidi polari rosso).
- Immunofluorescenza: fluorocromi legati ad anticorpi diretti contro una specifica molecola.
- Proteine fluorescenti della famiglia della GFP: trasfezioni cellulari con plasmidi batterici o virus (solo per campioni a fresco)
4) Montaggio del campione: Con antifading, collante e vetrino coprioggetto. Serve a ridurre il
fotodecadimento e a preservare la struttura tridimensionale del campione. ANTIFADING: reattivi antiossidanti, che possono essere aggiunti al mezzo utilizzato per chiudere il vetrino, che attenuano il decadimento della fluorescenza. Attenzione a:
- Presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura
- Presenza di cellule morte. Rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo = aumenta il “rumore di fondo”
- Usare vetrini non fluorescenti DIFFERENZA MICROSCOPIO CONFOCALE E A FLUORESCENZA Il confocale alla fine è un'evoluzione del microscopio a fluorescenza, le uniche differenze sono il laser (invece che la lampada a vapori di mercurio, xenon o argon) e i pinhole. Questi elementi contribuiscono a focalizzare la luce solo su un singolo piano per volta e poi un computer mette insieme tutti i singoli piano per creare immagini tridimensionali. È questa la vera differenza dal microscopio a fluorescenza. ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI IN MICROSCOPIA OTTICA: I due principali procedimenti di analisi morfologica sono l’osservazione diretta di cellule e di tessuti viventi oppure di cellule e di tessuti uccisi con procedimenti che ne conservano le immagini il più possibile simili a quelle degli elementi cellulari viventi, ovvero dopo fissazione. A rigor di logica il primo tipo di procedimento, fornendo un’immagine reale e dinamica della cellula, dovrebbe risultare ideale ma non è così: molti fattori limitano l’applicazione di questo procedimento. Perciò il ricorso a preparati fissati e ridotti in sottili fettine trasparenti e colorate è quello che trovala più ampia applicazione in istologia. Frammenti molto sottili di organi o cellule isolate dall’organismo possono restare in vita per breve tempo- purché preservate dall’essicamento- ed essere osservate in sopravvivenza preferibilmente al microscopio a contrasto di fase. È anche possibile, utilizzando particolari tecniche, colorare cellule viventi. COLORAZIONI VITALI E SOPRAVITALI: Determinati coloranti non tossici detti coloranti vitali, hanno la proprietà di colorare selettivamente alcune cellule viventi, permettendo cosi la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Se il colorante viene iniettato nell’animale interno, si parla di colorazione vitale o intra vitam. Alternativamente si può immergere un pezzetto di organo, appena prelevato da un animale, nell’liquido
colorante e ottenere, dopo breve lavaggio del pezzo, che alcune cellule restino colorate; si parla, in questo caso, di colorazione sopravitale. La stessa si può ottenere in cellule o tessuti coltivati in vitro con aggiunta della sostanza colorante al terreno di coltura. I metodi di osservazione di cellule e tessuti alo stato vitale, per quanto in linea teorica preferibili perché consentono lo studio dinamico delle strutture in assenza degli artefatti che sono fatalmente prodotti dalla fissazione e dalle colorazioni, presentano di fatto notevoli limitazioni. Queste sono dovute sia alla limitata sopravvivenza delle cellule e dei tessuti isolati dell’organismo, sia al fatto che le cellule intere presentano uno spessore eccessivo per consentire una fine analisi microscopica. Inoltre, i componenti cellulari spesso non presentano il necessario contrasto per essere distinti fra loro. È pertanto necessario per il morfologo fissare le cellule e i tessuti in modo da impedire le alterazioni post mortem (fissazione); è, inoltre, fondamentale rendere il campione trasparente alla radiazione utilizzata (luce o elettroni), mediante inclusione e sezionamento, e, successivamente, mettere in evidenza, tramite colorazione istologica, le differenze strutturali tra i diversi organuli.
- FISSAZIONE: uccisione rapida di cellule e tessuti Serve per:
- Immobilizzare i costituenti cellulari denaturando le proteine
- Consentire di sopportare le eccessive operazioni
- Mantenere un buon grado di reattività nei preparati La fissazione si propone di preservare la struttura protoplasmatica dalle alterazioni conseguenti alla morte della cellula con il minimo cambiamento di struttura. Questo scopo viene raggiunto in genere con un trattamento chimico che uccide rapidamente la cellula agendo soprattutto sui componenti proteici cellulari in modo da impedire fenomeni autolisi. La precipitazione dei componenti cellullari porta fatalmente ad artefatti da fissazione, cioè produce immagini che non esistevano della cellula prima della fissazione. Perciò i migliori fissativi sono quelli che precipitano le proteine nella forma più fine, possibilmente in aggregati ultramicroscopici, cosicché la morfologia non sia modificata. La fissazione si può eseguire utilizzando agenti sia chimici che fisici. I più comuni fissativi chimici si possono dividere in due gruppi in base alla loro azione sulle proteine. Il primo comprende i fissativi che COAUGULANO le proteine (determinano la precipitazione delle proteine eliminando l’H2O). tra questi si ricordano l’alcol etilico, le soluzioni di bicloruro di mercurio, di acido acetico, di acido tricloroacetico, di acido picrico. Il secondo gruppo comprende fissativi che NON COAUGULANO le proteine (creano legami tra macromolecole senza eliminare l’H20), come la formalina (soluzione acquosa di aldeide formica al 10%) e l’acido osmico.
