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Approccio strumentale allo studio della materia vivente Analisi morfologica → si avvale della microscopia ottica ed elettronica; in entrambi lo strumento finale di analisi è l’occhio umano ma è diversa la natura del mezzo con cui si analizza→ ottica= impiego della luce; elettronica=impiego di elettroni. Ottico : basato sull’interazione tra un raggio luminoso e il campione.
ANALISI MORFOLOGICA E MICROSCOPIO OTTICO L’analisi morfologica è l’esame dell’organizzazione strutturale delle cellule, avvalendosi dei microscopi. Consente di ingrandire, cioè aumentare con mezzi artificiali l'immagine di un oggetto fino a portarlo allo spettro del visibile, e di risolvere, ovvero di consentire una visione distinta di due punti di un oggetto tra di loro vicini. La microscopia la dividiamo in microscopia ottica o elettronica , la cui principale differenza sta nel mezzo con cui si analizza l’oggetto: quella ottica si avvale della luce, mentre quella elettronica di elettroni. Indipendentemente da quale si utilizza, in ultima fase si deve sempre fare riferimento al nostro strumento naturale: l’occhio umano. Occhio → composto da:
- cristallino : lente che proietta un’immagine sulla retina
- iride : diaframma che regola l’incidenza dei raggi luminosi
- coni a bastoncelli : recettori fotosensibili che sono l’inizio della via ottica che porta le info al cervello dove si elabora l’immagine NB: principi di ottica geometrica → se un raggio luminoso si propaga in un mezzo non omogeneo può subire fenomeni di riflessione (colore), assorbimento e rifrazione. Se i raggi provenienti dallo stesso punto, dopo aver subito riflessioni e/o rifrazioni, convergono nuovamente in uno stesso punto si dice che formano un’immagine reale della sorgente. *nel microscopio elettronico non incide la rifrazione, quindi solo trasmissione e assorbimento. ** microscopia ottica a trasmissione (=formazione immagine) Lente : mezzo trasparente limitato da due superfici curve.
Parti del microscopio: 1 oculare ( due lenti piano-convesse e un diaframma anulare fisso; fuoco al di la dell’immagine intermedia per cui si ottiene l’immagine finale virtuale, capovolta e ingrandita; fuoco→che deve passare al di là dell’immagine, quindi è soggettivo) 2 tubo porta ottica 3 revolver 4 obiettivo (lente frontale piano-convessa e altre lenti; funzionano come un’unica lente convergente: dà un’immagine intermedia dell’oggetto che è reale,capovolta e ingrandita. Deve essere corretto per le aberrazioni delle lenti) 5 tavolino 6 braccio 7 condensatore (sistema di lenti con diaframma ad iride) 10 supporto per filtri (diffusori di vari colori→dei filtri colorati il verde è quello che vediamo meglio; filtri verdi quando vogliamo vedere senza colore) 11 supporto per lenti ausiliarie 14 diaframma di campo 15 base/basamento/stativo (braccio e basamento vanno sotto il nome generico di stativo; stativo=blocco che regge tutte le porzioni del microscopio)
- 1 illuminatore
- 1 via micrometrica
- 1 via macrometrica 9 leva per centratura del condensatore
- 1 leva per allontanamento della lente frontale dal condensatore *sorgente luminosa dal basso Parte meccanica del micro: stativo, tavolino porta oggetto,porta obiettivo, revolver Parte ottica: obiettivo, oculare, ottica intermedia (=lente o lenti nel tubo del binoculare) Impianto di illuminazione: sorgente di luce, diaframma, filtri, condensatore
una goccia di olio con indice di rifrazione all'incirca uguale a quello del vetro (n pari a 1 , 5 ): in questo caso si parla di osservazione microscopica a immersione che permette di distinguere punti distanti poco più di 0 , 1 μm.; In alternativa, si può utilizzare luce di lunghezza d'onda minore, quale la radiazione ultravioletta con la quale si può raggiungere un potere di risoluzione di 0 , 1 μm., che rappresenta il limite estremo della microscopia ottica. In questo caso, essendo la luce ultravioletta invisibile all'occhio umano, per il rilevamento delle immagini occorre fare ricorso a pellicole fotografiche sensibili all'ultravioletto. Potere di risoluzione = capacità di distinguere come separati due punti molto vicini tra loro; Il potere risolutivo, il potere di risoluzione, la risoluzione spaziale, la risoluzione angolare (=la risoluzione angolare è il minimo angolo che un sistema ottico è in grado di distinguere, senza che il fenomeno della diffrazione confonda l'immagine), esprimono la capacità di un sistema ottico (=è un sistema in grado di modificare la propagazione della luce) per misurare - i microscopi, i telescopi o occhio, ma anche alcuni rivelatori, in particolare quelli utilizzati in immagini - per distinguere i dettagli. Può essere caratterizzato dall' angolo o distanza minima che deve separare due punti contigui per poterli distinguere correttamente. Può, in modo equivalente, essere caratterizzato dalla massima frequenza spaziale (=frequenza con cui si alternano le zone scure e chiare),che il sistema può misurare o ripristinare: è quindi espressa in cicli per millimetro (cy/mm) o in coppie di righe per millimetro (pl/mm). La definizione di potere risolutivo può essere ugualmente applicata alla capacità risolutiva spaziale, spettrale e temporale. Limite di diffrazione Gli strumenti ottici contengono molto spesso una camera oscura [la "camera obscura" si basa sul principio che i raggi luminosi provenienti da un oggetto fortemente illuminato, passando per una piccola apertura, si incrociano e, proiettandosi su uno schermo piano, formeranno un'immagine rovesciata e invertita dell'oggetto in questione], dove la luce che passa attraverso l'apertura della camera oscura è diffrattiva. Anche se il sistema ottico è considerato perfetto nel senso che è privo di qualsiasi aberrazione (=deviazione, traviamento), la diffrazione ne limita il potere risolutivo: un oggetto puntiforme dà un'immagine “sfocata”, chiamata punto di Airy. Se due dettagli di un oggetto sono troppo vicini, i punti di diffrazione si sovrappongono e diventa impossibile ottenere immagini separate di quei dettagli. Difetti nelle lenti→ difetti nel creare l’immagine; cromatiche e sferiche. Aberrazione cromatica : la luce bianca è costituita da fasci monocromatici con diversa lunghezza d'onda, che viaggiano nel vetro della lente con differente velocità e vengono quindi riflessi con angoli diversi.Esistono obiettivi corretti per tre lunghezze d'onda detti acromatici e corretti per quattro lunghezze d'onda detti apocromatici. Lente apocromatica: fa convergere tutte le frequenze nella stessa direzione cioè in un unico punto di fuoco. NB i colori non esistono; nella nostra corteccia distinguiamo i colori e ne vediamo milioni ma solo dal blu al rosso; il vantaggio della macchina è che puoi vedere dove non vedi (UV,..) Aberrazione di sfericità: le zone periferiche della lente presentano angoli di rifrazione progressivamente diversi, cioè tutti i raggi non arrivano nello stesso punto. Se si riesce a correggere, la lente è plan-apo-cromatica. Modalità diverse di utilizzazione della luce nei microscopi ● CAMPO CHIARO (controluce, luce da sotto)
● CAMPO CHIARO IN LUCE OBLIQUA CAMPO OSCURO (luce trasversale) ● CAMPO MISTO COLORATO (Rheinberg) ● EPI-ILLUMINAZIONE (luce da sopra) - fluorescenza ● LUCE POLARIZZATA (semplice o con lamina ausiliaria) ● CONTRASTO DI FASE (Zernike) ● CONTRASTO INTERFERENZIALE (Nomarski) ● CONTRASTO A MODULAZIONE (Hoffman) ● MICROSCOPIO INVERTITO (varie modalità) ● MICROSCOPI A FLUORESCENZA (varie modalità) ● MICROSCOPIO CONFOCALE (varie modalità) ● STEREOMICROSCOPI (si utilizza a bassi ingrandimenti (circa max. 40 x) per osservare oggetti tridimensionali con luce incidente) MICROSCOPIA NON OTTICA (infrarosso, ultravioletto)
- Elettronica: "in campo chiaro" e “a scansione” (Ad ultrasuoni) (A raggi X)
- Microscopia a scansione (AFM) con punta esplorativa (microsensori di vario tipo, anche ottico) UTILIZZAZIONE DEI MICROSCOPI Laboratori per indagini: medicina, veterinaria, agricoltura, criminologia, ambiente ..... Nell'industria: alimentare, microelettronica,metallurgia .... Istituti di ricerca: biologia, fisica, mineralogia, paleontologia, archeologia ..... INSEGNAMENTO a vari livelli o per DILETTO INNOVAZIONI UTILI PER IL MICROSCOPISTA ● Applicazione di fotocamera o videocamera digitale ● Collegamento di queste con televisore e videoregistratore ● Collegamento con computer e con videoproiettore, anche a distanza ● Raccolta di foto e filmati digitalizzati ● Elaborazione e riproduzione con computer ● Comunicazione con e-mail e www. CCD Il dispositivo ad accoppiamento di carica, sigla CCD (dall'inglese Charge Coupled Device), consiste in un circuito integrato [=circuito realizzato con un unico procedimento fisico-chimico, che consente di ottenere una elevata densità dei componenti in dimensioni molto ridotte] formato da una riga, o da una griglia, di elementi semiconduttori (photosite) in grado di accumulare una carica elettrica (charge) proporzionale all'intensità della radiazione elettromagnetica che li colpisce. Questi elementi sono accoppiati (coupled) in modo che ognuno di essi, sollecitato da un impulso elettrico, possa trasferire la propria carica ad un altro elemento adiacente. Inviando al dispositivo (device) una sequenza temporizzata d'impulsi, si ottiene in uscita un segnale elettrico grazie al quale è possibile ricostruire la matrice dei pixel[= l'unità minima convenzionale della superficie di un'immagine digitale] che compongono l'immagine proiettata sulla superficie del CCD stesso. Questa informazione può essere utilizzata direttamente nella sua forma analogica, per riprodurre l'immagine su di un monitor o per registrarla su supporti magnetici, oppure può essere convertita in formato digitale per l'immagazzinamento in file che ne garantiscano il riutilizzo futuro. [vedi slide per immagini percorso luce in campo chiaro e scuro]
Fissativi delle proteine:
- Coagulanti: determinano la precipitazione delle proteine eliminando l’H 2 O
- Additivi: creano legami tra le macromolecole senza eliminare l’ H 2 O
- Semplici
- Miscele Fissativi semplici:
- Etanolo: coagulante non additivo
- Formaldeide: additivo non coagulante
- Acidi organici e minerali
- acido picrico: coagulante;
- acetico: additivo
- Tetrossido di osmio: non coagulante
- Sali di metalli pesanti Miscele fissative:
- Liquido di Bouin: acido picrico, formalina, acido acetico glaciale
- Liquido di Carnoy: etanolo assoluto, cloroformio, acido acetico glaciale La soluzione di Bouin → è una scelta eccellente per i campioni di tessuto da colorare con metodi tricromatici e per la conservazione di strutture morbide e delicate; L'uso principale del liquido di Bouin è la fissazione di biopsie dei linfonodi, prostata e reni. È, inoltre,particolarmente utile come fissativo per i tessuti con cromosomi in stadi di mitosi e si utilizza per osservare la meiosi perché conserva eccezionalmente bene nuclei e cromosomi. La soluzione di Carnoy → Il fissativo di Carnoy tradizionale. è un fissativo che penetra rapidamente nei tessuti ed è eccellente per la fissazione di glicogeni, granuli di Nissl e materiali nucleari. Essendo un fissativo anidro a base di alcool, fissa e disidrata contemporaneamente. È consigliato per l'uso con campioni colorati secondo il metodo AZAN o Congo Red Highman. INCLUSIONE: serve per dare consistenza al tessuto e prepararlo al taglio. Schema orientativo a partire da pezzi già fissati, lavati e di spessore non superiore a 5 mm.
- Disidratazione: serie ascendente degli alcool ( 50 ° , 70 ° , 80 ° , 95 °) : un passaggio di un’ora in ciascun alcool; etanolo assoluto: due passaggi di un’ora ciascuno
- Chiarificazione : benzolo o toluolo o equivalente: due passaggi di mezz’ora ciascuno, controllare la chiarificazione a vista
- Infiltrazione: due passaggi in paraffina fusa di un’ora ciascuno (in termostato) punto di fusione tra 40 - 60 °C
- Inclusione: pezzi lasciati solidificare in paraffina in appositi contenitori per almeno 12 ore a temperatura ambiente TAGLIO: Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1 - 10 μm. Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia. COLORAZIONE Quando viene attraversato da raggi luminosi, il protoplasma cellulare rivela un comportamento sostanzialmente omogeneo. In altri termini i campioni biologici a fresco (non preventivamente colorati) non possono essere analizzati microscopicamente.
Diviene quindi necessario ricorrere a delle colorazioni delle strutture biologiche per instaurare una certa disomogeneità di comportamento nei confronti della luce bianca e rendere possibile l'individuazione delle strutture. Ogni colorazione prevede sostanzialmente la rimozione di materiali inclusi nel protoplasma grazie all'uso di uno specifico solvente, e quindi la successiva reidratazione, colorazione e fissazione del colorante sul preparato. Colorazione= insieme di passaggi in particolari sostanze, i coloranti, atti ad evidenziare le strutture cellulari o tissutali. I coloranti sono a base acquosa, per cui si deve eliminare lo xilene e poi riidratare le sezioni attraverso passaggi in etanolo a concentrazioni decrescenti. Dopo la colorazione, i preparati si disidratano di nuovo e si montano i vetrini con coprioggetto usando il balsamo.
- Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche negativamente: basici, sostanze basofile.
- Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche positivamente: acidi, sostanze acidofili. Esempi di colorazioni: ● Ematossilina : ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). L ' ematossilina è un colorante vegetale, estratto dal legno di una leguminosa, l'Haematoxylum campechianum, più noto con il nome di campeggio. Il preparato viene prima immerso nella soluzione di ematossilina e mordente, quindi dopo il lavaggio viene immerso nella soluzione di eosina. L'ematossilina o emallume di Mayer colora in blu-violetto i componenti cellulari carichi negativamente (quindi si comporta come una base), come acidi nucleici, proteine di membrana e membrane cellulari, elastina. Questi componenti sono detti basofili e si trovano prevalentemente a livello del nucleo, che assume pertanto il colore blu. ● Eosina : ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol). L'eosina colora invece in rosso rosato i componenti carichi positivamente (quindi si comporta come un acido), come molte proteine cellulari, le proteine mitocondriali, le fibre collagene. Questi componenti sono detti eosinofili o acidofili e determinano una colorazione rosata di tutte le rimanenti zone cellulari, il citoplasma e le sostanze extracellulari. *E&E= ematollislina-eosina. ● Cresyl-violetto : ha affinità per le molecole cariche negativamente, che colora in blu. Il violetto cresolo viene impiegato in particolare per la colorazione dei nuclei e per la visualizzazione di corpi di Nissl. La sostanza tigroide o sostanza cromofila o corpo di Nissl è una sostanza formata da piccole masserelle di reticolo endoplasmatico rugoso all'interno del citoplasma del neurone, simili a sfere. Il nome deriva da Franz Nissl, un neuropatologo tedesco, che ne ha scoperto la presenza. In una colorazione istologica in ematossilina-eosina si notano nel citoplasma delle zolle fortemente ricche in ematossilina; ciò significa che in queste zolle, colorate in blu, all'interno di un citoplasma colorato in rosa, sono contenuti materiali di origine nucleare. In realtà è RNA e quelle zolle sono costituite da RE rugoso e ribosomi liberi. Queste zolle sono le sostanze di Nissl. Altre colorazioni possono essere fatte con il blu di toluidina, la tionina oppure il cresil violetto (tutti coloranti basici essendo la sostanza tigroide acida e quindi basofila) ↴
Nel caso della fluorescenza secondaria sono oggi disponibili in commercio svariatissimi fluorocromi, ciascuno dei quali può essere utilizzato per fluorocromizzare in modo elettivo sostanze differenti; tra i più adoperati si ricordano l'arancio di acridina che ha, in determinate condizioni, particolare affinità per le nucleoproteine e gli acidi nucleici, lo ioduro di propidio, che colora in rosso il DNA, il DAPI ( 4 , 6 - diamidino- 2 - fenilindolo cloridrato), che dà un'intensa fluorescenza blu per il DNA, specie per i tratti ricchi in adenina e timina, la fluoresceina isotiocianato [FITC,unita ad anticorpi localizza antigeni (IMMUNOCITOCHIMICA*)] e la rodamina isotiocianato (TRITC), utilizzate per la marcatura di anticorpi, usati, a loro volta, per localizzare svariati antigeni tissutali.
- Immunocitochimica : Colorazione con anticorpi coniugati con traccianti, che fungono da coloranti, per evidenziare in situ costituenti tissutali che sono specifici antigeni. I traccianti dipendono dal microscopio usato per osservare il preparato: Se si usa il microscopio a fluorescenza sono fluorocromi. Antigene: sostanza immunogenica, cioè in grado di indurre un'attivazione del sistema immunocompetente che porta alla formazione di anticorpi. Anticorpo: proteine del siero prodotte in seguito all'esposizione ad un antigene che formano con essi un complesso immune. ↓ Produzione di anticorpi verso specifici targets cellulari che fungono da antigeni:
- cellule B producono anticorpi →sono una classe di leucociti; ogni cellula a riposo espone in superficie una diversa molecola anticorpale,legata alla membrana, che funziona da recettore per il riconoscimento di un antigene specifico. Se un antigene si lega ad uno dei recettori, la cellula B viene stimolata a dividersi ea secernere grandi quantità del suo anticorpo in forma solubile.
- produzione di anticorpi negli animali→Gli anticorpi possono essere prodotti in laboratorio iniettando a un animale (in genere un topo, un coniglio, una pecora o una capra) l'antigene A. Iniezioni ripetute dello stesso antigene a intervalli di parecchie settimane stimolano le cellule B specifiche a secernere grandi quantità di anticorpi anti-A nel sangue.
- uso degli anticorpi come marcatori molecolari→L'anticorpo fluorescente si lega all'antigene A nei tessuti e si mette in evidenza al microscopio ottico grazie alla fluorescenza. In questo caso l'antigene è la pectina nelle pareti cellulari di un tessuto vegetale in sezione. [accoppiamento a marcatori fluorescenti]. Reazione indiretta: poiché ad ogni anticorpo primario a livello della porzione Fc, si legano 2 molecole di anticorpo, ad ogni molecola di antigene corrisponde un maggior numero di fluorocromo Un tempo, nei microscopi a fluorescenza, la lampada a vapori di mercurio era messa sotto il condensatore, per cui la luce ultravioletta attraversava il preparato eccitandolo. La luce ultravioletta, per evitare danni alla vista, veniva poi fermata prima di arrivare all'oculare da appositi
filtri di sbarramento, per cui all'occhio dell'osservatore arrivavano solo i raggi luminosi emessi per fluorescenza. Questo sistema veniva chiamato ipofluorescenza ; esso era, però, poco sensibile a causa dell'eccessivo assorbimento della luce da parte dei diversi sistemi diottrici da essa attraversati. Attualmente, si preferisce utilizzare un sistema molto più sensibile denominato epifluorescenza , nel quale il preparato viene eccitato dall’alto. Tale microscopio si avvale:
- di una sorgente luminosa ad alta energia (lampada a vapori di mercurio, ad argon o allo xenon)
- di un filtro d'eccitazione (lascia passare luce a 𝜆 che eccita il fluorocromo in uso)
- un filtro di sbarramento (lascia passare luce a 𝜆 corrispondente a quella emessa dal fluorocromo)
- uno specchio dicroico (riflette la luce a 𝜆 pari o inferiore a quella di eccitazione e trasmette la luce a 𝜆 superiore a quella di eccitazione). Non tutti gli obiettivi sono idonei per essere utilizzati nelle osservazioni in fluorescenza; quelli più adatti sono detti obiettivi a fluorite (o con lenti in fluorite) e sono identificati dalla sigla FLUOR o FL. ⬇ Rivoluzione scientifica: luce fatta di particelle. Nel 1852 Stokes scopre che la luce ultravioletta produce l'emissione di luce dalla Fluorite e conia per questo fenomeno il termine "Fluorescenza". L' osservazione di Stokes è fondamentale, perché è la prova che la luce interagisce con la materia! Fino al 1900 domina il modello ondulatorio di Maxwell: la luce visibile è quella parte di spettro della radiazione elettromagnetica compreso fra 400 (violetto) e 700 (vicino infrarosso) nm. Nel 1900 Plank e nel 1905 Einstein postulano l'esistenza di "particelle" indivisibili di luce che costituiscono la radiazione elettromagnetica: i "fotoni". La relazione che lega energia E di un fotone alla lunghezza d'onda 𝜆 (colore) della radiazione elettromagnetica corrispondente è semplicissima: E = hc/𝜆 dove: h = costante di Plank; c = velocità della luce nel vuoto. L'energia di un fotone è inversamente proporzionale alla sua lunghezza d'onda ⤷ Seconda rivoluzione:meccanica quantistica. Secondo la meccanica quantistica, l'energia delle molecole può assumere solo valori discreti che prendono il nome di Livelli energetici. In condizione di equilibrio la molecola si trova nello stato di minima energia, detto Stato fondamentale (S 0 ). Quando la luce colpisce una molecola, se l'energia dei fotoni è uguale alla differenza fra l'energia dello stato fondamentale e quella di un livello di uno Stato eccitato (S 1 ,S 2 ,S 3 ...), la radiazione viene assorbita: Efot = Es 1 - Es 0 Dal momento che l'energia di un fotone è associata alla lunghezza d'onda della luce, ogni molecola può assorbire solo determinate lunghezze d'onda. Queste lunghezze d'onda costituiscono lo Spettro di assorbimento della molecola. ⬇⬇⬇ La fluorescenza: Restituzione dell'energia assorbita:
- La luce assorbita "eccita" la molecola, facendo saltare gli elettroni in un orbitale più esterno
- In queste condizioni la molecola si trova in uno stato metastabile, per cui gli elettroni tendono a tornare allo stato fondamentale.
- Una rapidissima perdita di energia per effetti termici porta allo stato eccitato di energia minima ( Conversione interna )
Nem/Nex く 1. Questo numero è detto QY ovvero QUANTUM YIELD ed è specifico per ogni fluorocromo e misura l’efficienza di emissione. Stabilità della fluorescenza: La fluorescenza è un processo ciclico, ma il n° di cicli possibili è limitato per via di reazioni chimiche che portano alla perdita irreversibile delle capacità di emettere luce; questo fenomeno è detto fotodecadimento. La velocità di distribuzione del fluorocromo dipende dall’intensità e dalla durata dell’eccitazione: la fluorescina emette circa 4 x 10 alla quarta fotoni prima di fotodecadere effettivamente. Il fotodecadimento si previene:
- usando obiettivi con alta apertura numerica
- riducendo l’intensità e/o durata dell’eccitazione Poiché la fotosensibilità è una proprietà intrinseca di ogni molecola fluorescente, è sempre opportuno scegliere fluorocromi più stabili. Utilizzo dei fluorocromi: ● come coniugati per studiare la distribuzione di macromolecole (es: anticorpi mono e policlonali) ● come mezzo per identificare specifici compartimenti ● come biosensori di processi cellulari Quindi, i parametri per la scelta di un fluorocromo sono: ➔ il ɛ ➔ il QY ➔ gli spettri di eccitazione ed emissione e lo Stokes shift ➔ la stabilità del photobleaching (=si intende la diminuzione della fluorescenza di un campione dovuta alla degradazione fotochimica del fluoroforo) ➔ in cellule e tessuti viventi la salvaguardia dell’attività biologica del preparato dopo la marcatura Principio di base: l’immagine non è dovuta alla luce che attraversa l’oggetto ma alla luce che viene prodotta. I preparati si AUTOILLUMINANO. Principio di funzionamento= FLUORESCENZA. Una radiazione non compresa nel visibile eccita l’elettrone periferico di un atomo; quando l’elettrone torna al suo livello di origine perde l’energia acquistata che si trasforma ANCHE in energia luminosa di lunghezza d’onda maggiore e quindi VISIBILE.
MICROSCOPIO CONFOCALE
Nella microscopia ottica tradizionale, il preparato è ridotto in sottili sezioni e quanto più la sezione è sottile tanto più sarà elevata la qualità dell'immagine. Nel processo di sezionamento, però, si perde la tridimensionalità dell'oggetto; se poi si osserva una struttura biologica senza sezionarla, l'eccessivo spessore dà immagini confuse, dovute alla sovrapposizione del piano focale su cui è stato regolato il microscopio, con i piani immediatamente soprastanti o sottostanti. L'inconveniente può essere superato con il microscopio confocale il quale, con dispositivi elettronici, focalizza solo un determinato piano per volta , eliminando le informazioni luminose che provengono da zone sovra- e sottofuoco. Viene cioè registrata ogni volta una ben precisa sezione ottica sottile. Dall'unione delle immagini relative alle differenti sezioni ottiche sottili, registrate a diversi livelli del preparato, è possibile ricostruire, con l'ausilio di un computer, l'immagine tridimensionale della struttura in esame anche se di notevole spessore. Lo schema→ Il sistema somiglia per certi aspetti a quello della microscopia per epifluorescenza; la sorgente luminosa è data da un fascio laser che viene concentrato in un foro (foro confocale) la cui immagine, riflessa da uno specchio dicroico, viene focalizzata dall'obiettivo solo in un ben definito punto dell'oggetto sotto osservazione, i cui organuli sono stati marcati con uno o più fluorocromi. La luce emessa da quello stesso punto per fluorescenza, tornando indietro, attraversa lo specchio dicroico e viene focalizzata dall'obiettivo su un secondo foro confocale (che, cioè, ha lo stesso fuoco rispetto al primo foro confocale di illuminazione); a questo punto la luce viene raccolta da un apposito rilevatore che registra l'informazione su un computer. La fluorescenza emessa da punti contigui a quello di focalizzazione torna anch'essa indietro; tuttavia, non è focalizzata nel secondo foro confocale, per cui viene fermata, non giunge al rilevatore e non crea disturbo. Facendo scorrere, attraverso un dispositivo di scansione, il raggio laser nei vari punti dei piani di sezione ottica, il computer registra una serie di immagini puntiformi, perfettamente a fuoco, in base alle quali ricostruisce l'immagine complessiva del piano di sezione. Il grande sviluppo del microscopio confocale è dovuto anche al fatto che esso consente una buona visione di cellule e tessuti in vivo. La maggior parte dei fluorocromi precedentemente usati in epifluorescenza era citotossica e perciò dannosa alle cellule viventi. La messa a punto di molecole fluorescenti vitali, quali la proteina fluorescente verde (green fluorescent protein, GFP) e suoi derivati, ha superato questo limite consentendo l'osservazione in vivo di cellule o strutture che, per il loro spessore, non darebbero immagini accettabili con i tradizionali microscopi. Il microscopio confocale consente, inoltre, di studiare la mobilità é le interazioni delle molecole mediante le tecniche FRAP (fluorescence recovery after photobleaching recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento) e FRET (fluorescence resonance energy transfer, trasferimento di energia per risonanza durante la fluorescenza). ● La tecnica FRAP è relativamente semplice ed è utilizzata per misurare la mobilità delle molecole: si avvale del photobleaching (fotosbiancamento delle molecole fluorescenti di una definita zona tramite un'intensa illuminazione, in genere usando la luce laser). Il recupero di fluorescenza, poi, è registrato nel corso del tempo. Il recupero di fluorescenza può essere misurato e può fornire il tasso di trasporto o le costanti di diffusione delle molecole. ● La tecnica FRET permette di studiare le interazioni tra le molecole. Si avvale del quenching (letteralmente smorzamento) che consiste nel trasferimento di energia da una molecola fluorescente (donatrice) a un'altra molecola fluorescente (accettore), che si trova fisicamente vicina al fluorocromo eccitato (donatore). Il fenomeno del trasferimento di energia per risonanza durante la fluorescenza avviene se lo spettro di emissione del fluorocromo donatore si sovrappone a quello del fluorocromo accettore e se i due
Lo schema a destra mostra come un sistema ottico per microscopia convenzionale venga modificato per la realizzazione di un sistema di acquisizione confocale per sezionamento ottico. In un microscopio confocale si ritrova la struttura di un microscopio tradizionale. Cambia la sorgente luminosa (laser) e vengono inseriti i pinhole. ● Laser: fascio di luce coerente e monocromatica concentrata in un raggio rettilineo estremamente conciso e luminosità delle sorgenti laser elevatissima. ● Il sistema dei “pinholes”:
- elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obiettivo (fa arrivare poca luce al campione)
- raccoglie solo la luce proveniente dal piano a fuoco Funzionamento:
- La luce di un laser viene fatta convergere dalle lenti dell'obiettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato. Il raggio laser colpisce punto per punto i vari piani del preparato provocando l’emissione luminosa.
- Il punto di focalizzazione, attraverso un sistema di specchi oscillanti, viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell'obiettivo così da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale.
- La luce emessa dai fluorocromi presenti nel campione viene catturata dalle lenti dell'obiettivo e deviata da uno specchio dicroico su un fotomoltiplicatore (rivelatore confocale), che trasforma l'intensità luminosa rilevata in un segnale elettrico di intensità proporzionale.
- Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore, il fascio luminoso attraversa un diaframma (o pinhole), che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco di raggiungere il fotomoltiplicatore.
- Le informazioni luminose ottenute tramite scansione del preparato sono raccolte e utilizzate dal software per ricostruire l’immagine sullo schermo. Fluorescenza vs Confocale VANTAGGI:
- Miglioramento della qualità delle immagini: migliore risoluzione e contrasto, minor "rumore di fondo"
- Rapidità di acquisizione e archiviazione delle immagini
- Sezionamento ottico XY e Z (evita la preparazione di sezioni sottili e permette di effettuare una ricostruzione 3 D del campione)
- Aumentata risoluzione sui tre assi XYZ
- Permette di lavorare su cellule vive (si evitano gli artefatti di fissazione e inclusione)→ CONFOCAL LIVE IMAGING
- Possibilità di eseguire osservazioni in TIME-LAPSE
- Possibilità di effettuare analisi di co-localizzazione
SVANTAGGI:
- Costo elevato
- Alta fototossicità
- Alto rischio di photobleaching Ottica vs Confocale: ● microscopia ottica convenzionale→ non solo il piano di fuoco dell'obiettivo, ma anche gran parte dello spessore dell'oggetto biologico sono uniformemente e simultaneamente illuminati le aree sopra e sotto il piano focale di interesse rendono meno distinguibili le strutture cellulari. ● microscopia confocale →l'illuminazione non è simultanea, ma sequenziale, concentrata come un punto su un singolo elemento del volume del campione alla volta - pinhole, messo davanti al rivelatore, elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obiettivo immagine più dettagliata, perché' vengono eliminate le informazioni fuori fuoco. Ricostruzione 3 D dell’immagine: Il laser lavora sull’asse Z effettuando una serie di sezioni ottiche collezionate a differenti livelli perpendicolari all’asse ottico. Il fascio di luce di eccitazione attua una scansione del campione piano per piano, seguendo una coordinata spaziale Z (profondità) scelta dall’operatore. Possibilità di effettuare una ricostruzione tridimensionale del volume in cui sono distribuite molecole fluorescenti. Spostandosi lungo l'asse verticale è possibile eseguire serie di scansioni successive corrispondenti a piani focali via via più profondi all'interno del campione. Queste scansioni prendono il nome di sezioni ottiche e la loro sovrapposizione ordinata, eseguita via software, consente di ricostruire un'immagine complessiva dell'intero volume scandito, in cui tutti i piani sono contemporaneamente a fuoco. Colocalizzazione COLOCALIZZAZIONE: presenza di due o più strutture nella stessa posizione. In microscopia a fluorescenza, la presenza di due o più fluorocromi sulla stessa struttura cellulare. Proteine marcate di colori differenti che co-localizzano danno come output un terzo colore, ad esempio rosso + verde = giallo. Colocalizzazione apparente o falsa : Affinché la presenza di un colore “da fusione” rappresenti realmente la colocalizzazione spaziale di due molecole marcate da due diversi fluorocromi e non la
bicloruro di mercurio, di acido acetico, di acido tricloroacetico, di acido picrico. Il secondo gruppo comprende fissativi non coagulanti le proteine, come la formalina (soluzione acquosa di aldeide formica al 10 %) e l'acido osmico (OsO 4 ). Nel caso della fissazione fisica , si opera in genere per congelamento o per rapido riscaldamento. Le cellule che si trovano disperse in un mezzo liquido, quali le cellule del sangue, quelle dei liquidi di cavità sierose e di qualunque secreto o essudato, si esaminano agevolmente con la tecnica degli strisci. Gli strisci di cellule in monostrato possono essere di solito osservati direttamente al microscopio dopo essiccamento o fissazione e colorazione. La tecnica degli strisci si usa per l'esame morfologico del sangue. Inclusione e sezionamento Il preparato dovrà essere attraversato dalla luce; pertanto, il materiale biologico da esaminare al microscopio, per risultare trasparente, deve essere tagliato in sezioni di spessore non superiore a 10 μm, preferibilmente di 2 - 5 μm, in modo da ottenere una buona risoluzione. A questo scopo, si adopera uno strumento, detto microtomo, nel quale il materiale da sezionare viene spinto progressivamente in avanti da un congegno capace di portarlo sotto una lama affilata che taglia fettine di un determinato spessore. Per effettuare sezioni così sottili di materiale appena fissato, occorre dargli una maggiore consistenza; ciò si ottiene includendolo in sostanze di natura diversa che successivamente in- duriscono. Queste sostanze sono la paraffina, la celloidina o resine plastiche nelle quali il materiale biologico è immerso quando sono ancora in fase liquida, in modo che possano impregnarlo completamente. La metodica prevede una serie di passaggi successivi alla fissazione:
- disidratazione progressiva nella serie degli alcoli ascendenti ( 50 , 75 , e 100 );
- diafanizzazione in solventi apolari; inclusione in paraffina a 50 - 60 °C;
- solidificazione a temperatura ambiente;
- sezionamento al microtomo;
- distensione delle sezioni in acqua;
- montaggio;
- sparaffinatura delle sezioni in solventi apolari;
- reidratazione delle sezioni nella serie degli alcoli discendenti ( 100 , 95 , 75 , 50 °)
- acqua distillata;
- colorazione delle sezioni;
- disidratazione nella serie ascendente degli alcoli ( 50 , 75 , 95 , 100 °);
- chiarificazione in solventi apolari;
- montaggio in resine sintetiche e loro solidificazione a 37 °C, in modo da conservare il preparato per lungo tempo. Volendo effettuare sezioni di un tessuto appena prelevato, senza fissarlo, si può congelare e poi eseguire le sezioni con un particolare microtomo, detto microtomo congelatore , o con un criostato. Il primo è praticamente un normale microtomo in cui il pezzo viene reso duro da un getto di anidride carbonica. Il criostato è invece un microtomo contenuto all'interno di una cella frigorifera (a - 20 /- 30 °C) e il pezzo è mantenuto duro dalla temperatura fredda presente nella cella. In questo modo si ottengono sezioni che, raccolte direttamente sopra i vetrini, vengono avviate alla colorazione desiderata. Il criostato, viene anche usato per dare una rapida diagnosi istologica nel corso di estemporanee chirurgiche. Colorazioni istologiche In istologia si parla di una vera e propria colorazione quando il colorante, in soluzione, si lega stabilmente ad alcune strutture cellulari che rimangono colorate anche dopo ripetuti lavaggi delle sezioni nel solvente in cui era sciolto il colorante. Si distinguono colorazioni dirette o sostantive , quando le sezioni prendono il colorante direttamente dalla soluzione, sia essa acquosa o alcolica, e colorazioni indirette o aggiuntive o per mordenzatura, quando il preparato viene sottoposto all'azione preliminare di sostanze preparatorie alla colorazione ( mordenti , quali sali d'alluminio, di ferro o di cromo). Le colorazioni possono essere semplici , quando si usa un solo colorante, e combinate , quando se ne usano due o più simultaneamente o in successione.
I coloranti possono essere naturali (estratti da animali o da piante) o artificiali. I meccanismi con i quali i coloranti si legano ai costituenti dei tessuti sono sicuramente molteplici e in gran parte sconosciuti. In istologia vengono di solito adoperate combinazioni di coloranti che hanno lo scopo di mettere in evidenza i vari componenti delle cellule e dei tessuti. La combinazione più comunemente usata è quella dell’ematossilina-eosina. ⬇ Il campione può essere osservato:
- fissato: di norma con paraformaldeide 2 - 4 %
- a fresco: cellule in condizioni vitali (CONFOCAL LIVE IMAGING) Per campioni fissati:
- Fissazione
- Inclusione e Taglio (solo per campioni di tessuto)
- Permeabilizzazione (solo per immunofluorescenza)
- Colorazione
- Montaggio Fissazione:
- Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti
- Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia
- Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)
- Per la microscopia a fluorescenza e confocale: Paraformaldeide 2 - 4 % in PBS pH 7. 2 - 7. 4 Inclusione e sezionamento: Se il nostro campione ha uno spessore elevato (es. tessuti) si deve procedere al sezionamento. Il campione viene incluso in paraffina e tagliato al microtomo seguendo gli stessi protocolli utilizzati per la microscopia ottica tradizionale. Le sezioni di tessuto possono avere spessore maggiore rispetto alla fluorescenza tradizionale. La fissazione può essere combinata con la PERMEABILIZZAZIONE (per colorare componenti del citoplasma o del nucleo con immunofluorescenza): Si effettua trattando i campioni fissati con detergenti blandi (Es. Triton X 100 ). E’ indispensabile per immuno marcature intracitoplasmatiche e nucleari in quanto permeabilizzare le membrane permette l’ingresso dell’Ab negli organuli. Non è necessaria per immuno marcature su Ag di membrana. Colorazione diretta di strutture cellulari: ★ nucleo-DNA: DAPI o ioduro di Propidio (PI) ★ mitocondri: MT Green- MT Orange- MT Red- MT Deep Red ★ citoscheletro:Probes specifici per ACTINA e TUBULINA [vedi slide x immagini] Montaggio del campione: Con ANTIFADING, collante e vetrino coprioggetto. Serve a ridurre il foto decadimento (Photobleaching) e a preservare la struttura tridimensionale del campione. ANTIFADING: reattivi anti-ossidanti, che possono essere aggiunti al mezzo utilizzato per chiudere il vetrino, che attenuano il decadimento della fluorescenza. ATTENZIONE A:
- presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura
- presenza di cellule morte: rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo→ aumenta il rumore di fondo
- usare vetrini (ed ottiche) non fluorescenti Confocal live imaging: ove possibile l’esame a fresco è da preferire a quello su campioni fissati.
