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MICROSCOPIA, LO STUDIO DELLA CELLULA AL MICROSCOPIO
pt. I tessuti e le cellule possono essere studiati in 3 metodi:
- Morfologicamente (citofluorimetri) - Biochimicamente (cromatografi, elettroforesi, spettrometri. Tecnica frazionamento) - Funzionalmente L’ analisi morfologica prende in esame l’organizzazione strutturale delle cellule, dei loro componenti e dei costituenti extracellulari mediante l’uso di microscopi. Per questo tipo di analisi, l’approccio al campione studiato dovrà essere il più possibile conservativo, la cellula deve mantenere il più possibile tutte le sue informazioni, la sua integrità risulta di cruciale importanza per l’analisi. Per quanto riguarda i restanti tipi di analisi, l’approccio qui sarà più “distruttivo”, in quanto ci si pone lo scopo di analizzare la natura chimica, le modalità di funzionamento cellulare, delle loro parti e delle loro interrelazioni in ambito tissutale; l’approccio sperimentale risulta essere piuttosto distruttivo. Analisi morfologica Per conoscere l’organizzazione della cellula in condizioni fisiologiche o patologiche, è necessario utilizzare metodi di osservazione diretta, che richiedono l’intervento del microscopio. Esistono due tipi di microscopi che a loro volta determinano due tipi diversi di microscopia:
- Microscopia ottico
- Microscopia elettronico Ciò che contraddistingue queste due branchie della microscopia è la natura del mezzo con cui si analizza il campione: la microscopia ottica utilizza la luce, mentre la microscopia elettronica utilizza un fascio di elettroni. Microscopio ottico Un microscopio ottico con solamente una lente si dice “semplice”, da due lenti invece si chiamano “composti”. (basato sull’interazione tra un raggio luminoso e la luce). Se nel microscopio ottico composto, l’obbiettivo è a corta distanza focale e l’oggetto viene posto giusto al di la del fuoco: di esso si forma un’immagine reale ingrandita e capovolta detta: immagine intermedia (IR). Se l’oculare viene posto in modo che l’IR cada all’interno della distanza focale: si ottiene un’immagine secondaria, virtuale ingrandita e dritta (capovolta rispetto all’oggetto). Il rapporto tra le dimensioni dell’immagine finale e quelle dell’oggetto esprime l’ingrandimento ottenuto (prodotto dell’ingrandimento della lente obiettivo per l’ingrandimento della lente oculare). Grazie all’ottica geometrica, conoscendo la distanza focale focale dei due sistemi di lenti ( oculare = lenti vicine all’occhio, obiettivo= vicino all’oggetto) si può calcolare l’ingrandimento totale, che è pari al prodotto degli ingrandimenti imputabili ai due singoli gruppi diottrici.
Aumentando l’ingrandimento ci si rende conto che, oltre un certo limite, non si distinguono particolari ulteriori: non cresce il potere di risoluzione (capacità di distinguere come separati due punti molto vicini. L’occhio umano può al massimo risolvere particolari fino a 0,2 mm, il microscopio ottico fino a 0,2 μm, mentre quello elettronico fino a 0,2 nm). L’ingrandimento utile del microscopio ottico è dunque di circa 1000 volte (x1000), ed il suo potere risolutivo è di 0,2 μm. Questa risoluzione è il limite massimo per ogni microscopio di base ottica: il motivo sta nella natura ondulatoria delle radiazioni luminose. Limite di risoluzione R= lunghezza d’onda della luce/ 2x indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente (aria) x semiangolo di apertura della lente obiettivo. (*Tanto più piccola è la lunghezza d’onda tanto maggiore è il potere di risoluzione *Tanto più grande è l’apertura numerica tanto maggiore è il potere di risoluzione). Il prodotto fra n e alpha viene definito apertura numerica (alpha nei migliori obiettivi può essere considerato prossimo a 1, in quanto l’indice di rifrazione dell’aria è anch’esso 1. Da ciò si deduce che R corrisponde a 1/2 della lunghezza d’onda della luce. Considerando dunque la lunghezza d’onda della luce equivalente a 400nm, il potere di risoluzione sarà dunque pari a 200 nm (0,2). Si deduce dunque che per migliorare il potere di risoluzione bisognerà agire aumentando il valore dell’indice di rifrazione del mezzo interposto. A questo scopo tra la lente frontale dell’obiettivo e l’oggetto posto si può porre una goccia d’olio (n= 1.5 come il vetro). In questo caso si parla di osservazione microscopica a immersione che permette di distinguere punti distanti poco più di 100 nm. In alternativa si possono usare i raggi ultravioletti (utilizzando una luce con raggio di lunghezza d’onda minore; 250-350 nm) con i quali si arriva ad un R circa di 100 nm—-> limite estremo microscopia ottica. Essendo la luce ultravioletta invisibile all’occhio umano, per poter vedere le immagini si utilizzano pellicole speciali sensibili ai raggi UV. (A.N.= massima qt. Di luce che l’obiettivo è in grado di ricevere per la formazione delle immagini ) Struttura microscopio ottico Tubo portaottica= sorregge una coppia di oculari, dal lato dell’osservatore e gli obiettivi dal lato del tavolino. Gli obiettivi sono montati su un revolver. Tubo e tavolino sono montati su un braccio ricurvo, il tutto poggia su un basamento (braccio e basamento= stativo ). Per la messa a fuoco= vite macrometrica , per grandi spostamenti; Vite micrometrica= per messe a fuoco fini. —> alcuni agiscono alzando o abbassando il tavolino, altri agiscono sul braccio. Sotto il tavolino= dispositivi di illuminazione ( sorgente d’illuminazione ) composto da luce e condensatore di Abbe.
Dall’oggetto di fase, colpito dal cono cavo di luce, partono onde di luce diretta e onde diffratte sfasate tra loro di 1⁄4 lambda. Le onde dirette verranno ulteriormente sfasate di 1⁄4 l dall’anello di fase dell’obiettivo mentre le onde diffratte passeranno inalterate. Così si ha una differenza di fase di mezza lunghezza d’onda (-1/4 +1/4) tra onde dirette e onde diffratte, che è la stessa di un oggetto di ampiezza. lo sfasamento è dato dal rapporto fra cammino ottico e lunghezza d’onda. Le condizioni di contrasto sono quindi variabili all’interno dello spettro ottico :si ottiene la sovrapposizione di infinite immagini leggermente diverse fra loro, corrispondenti a tutti i valori di λ presenti nella radiazione utilizzata: ciò riduce il contrasto e compromette la definizione. È per questo motivo che molti costruttori forniscono nel corredo di fase un filtro verde: introducendolo nell’illuminatore, si fa lavorare il sistema per quella porzione dello spettro per cui l’occhio è più sensibile e per cui, quindi, il progettista ha calcolato il sistema. Contrasto di fase positivo: L’anello di fase anticipa l’ onda diretta di 1⁄4 l (oggetti con n più alto del mezzo che li circonda appaiono più scuri su fondo chiaro). Contrasto di fase negativo: L’anello di fase ritarda l’onda diretta di 1⁄4 l (oggetti con n più basso del mezzo appariranno più chiari su fondo scuro). Il normale condensatore qui è sostituito con un condensatore paraboloide, che deflette il fascio di luce in modo che attraversi l’oggetto con forte obliquità, proseguendo in massima parte fuori dal sistema ottico.
• Microscopio a luce polarizzata
Ormai in disuso, utilizza la luce polarizzata (con raggi che vibrano unicamente in un solo piano). Sotto questa luce un oggetto può risultare isotropo o birifrangente. Dal primo caso ne consegue che il campione vanta dello stesso indice di rifrazione in tutte le direzioni, dal secondo invece che l’oggetto studiato presenterà N diversi secondo il piano di vibrazione rispetto all’orientamento di molecole.
• Microscopio interferenziale di Nomarski
Utilizza la luce polarizzata, che attraverso un particolare prisma di wollastone viene suddivisa in due raggi divergenti tra loro di 0,1-1 μm. Tra i due raggi, dopo aver toccato punti diversi del campione si crea una sfasatura, che attraverso un secondo prisma di wollastone viene fatta ricoincidere: l’immagine che si crea è simile a quella del microscopio a contrasto di fase, ma più tridimensionale.
• Microscopio a^ fluorescenza
Principio di base: l’immagine non è dovuta alla luce che attraversa l’oggetto ma alla luce che viene prodotta. I preparati si AUTOILLUMINANO. Principio di funzionamento= FLUORESCENZA. Una radiazione non compresa nel visibile eccita l’elettrone periferico di un atomo; quando l’elettrone torna al suo livello di origine perde l’energia acquistata che si trasforma ANCHE in energia luminosa di lunghezza d’onda maggiore e quindi VISIBILE. La sorgente luminosa del microscopio a fluorescenza è una lampada a vapori di mercurio, che emette radiazioni UV invisibili. Si possono avere due tipi di fluorescenza: quella naturale, primaria o autofluorescenza: prodotta da sostanze presenti nel tessuto; e quella secondaria: indotta da una colorazione fluorocromizzazione con coloranti fluorescenti detti fluorocromi: si legano in modo selettivo a diversi componenti cellulari e/o tissutali e ne consentono la visione al M.F. Esempi de fluorescenza primaria sono: vitamina A, riboflavina, porifirine, clorofille, cellulosa e lipofuscine. Esempi di fluorescenza secondaria: arancio di acridina (affinità per nucleoproteine e acidi nucleici), ioduro di propidio (colora in rosso Il DNA), DAPI (colora in blu adenina e timina, si lega alla doppia elica), FITC (immunofluorescenza) e TRITC (utilizzate per la marcatura di anticorpi). Nel microscopio a fluorescenza si utilizza il sistema dell’ epifluorescenza: preparato viene eccitato dall’alto.—> microscopio si avvale di: 1 sorgente luminosa ad alta energia: lampada ai vapori di mercurio ad argon o xenon; filtro di eccitazione; specchio dicroico. L’emissione del fascio di luce da parte della lampada a vapori di mercurio deve avere lunghezza d’onda strettamente dipendente dal tipo di cromogeno così da eccitarlo. Il filtro di eccitazione fa passare radiazioni a ristretta lunghezza d’onda. Nel caso del FITC la lunghezza d’onda è compresa fra 450 e 490 nm (luce blu).
Tali radiazioni penetrano nell’obiettivo e riflesse dallo specchio dicroico eccitano il fluorocromo. Le radiazioni emesse dal fluorocromo passano sia il filtro dicroico sia il filtro di sbarramento. Il filtro di sbarramento (o di arresto) seleziona lunghezze d’onda di emissione tipiche del cromogeno. Nel caso del FITC comprese nello spettro del giallo-verde fra 520 e 560 nm. VANTAGGI: sistema relativamente semplice da usare, poco costoso ed a medio-buona sensibilità SVANTAGGI: -Il campione si illumina completamente, tutte le molecole fluorescenti presenti sono eccitate => photobleaching -Il campione se “vivo” è sottoposto a fenomeni di fotocitotossicità => danneggiamento campione -La luce osservata al detector non arriva esclusivamente dal piano di osservazione, ma può arrivare da sopra o da sotto => immagini poco nitide -In esperimenti di co-localizzazione di due molecole non si può essere certi che queste si trovino sullo stesso piano di osservazione Approfondimento sui fluorocromi I FLUOROCROMI sono sostanze particolari che, se colpite da una luce incidente ad una particolare lunghezza d’onda, hanno la capacità di emettere luce ad una lunghezza d’onda maggiore. Ogni fluorocromo è caratterizzato da uno spettro di eccitazione e da uno spettro di emissione. Non solo limitati a M.F.: anche per studiare altre caratteristiche delle cellule: il “ flow cytometer ” (citometria a flusso: pag.80)= è simile ad un microscopio, ma al posto di riprodurre l’immagine di una cellula ne misura luce, estensione e intensità fluorescente. Il “ flow cytometer ” ha tre componenti fondamentali:
- Un sistema fluido che trasporta ed allinea le cellule
- Un sistema ottico che illumina le particelle risultanti dalla luce
- Un sistema elettronico che converte i segnali luminosi in segnali processabili dal computer. “photobleaching” : Eccitazione irreversibile e distruttiva di un fluorocromo. Non crea problemi al fluorocromo purché il tempo di eccitazione sia molto breve (altrimenti si rischia di far esplodere il fluorocromo). Pochi fluorocromi hanno questa peculiarità (uno di questi è il PerCP). “quentching” Fenomeno grazie al quale le molecole tornano allo stato basale senza emettere raggi fluorescenti. Questo accade perché un'elevata concentrazione di molecole potrebbe produrre assorbanza tra le molecole di fluorocromo (dipendente dalla struttura della molecola). = le molecole assorbono reciprocamente l’una le radiazioni luminose dell’altra. L’ossigeno molecolare cosi come il ph aumentano il verificarsi di questo fenomeno. I solventi polari come l’acqua invece effettuano il fenomeno del “quentching” disponendosi attorno alla disposizione polare delle molecole Svantaggi del microscopio a fluorescenza Il campione si illumina completamente, tutte le molecole fluorescenti sono eccitate: photobleaching. Se vivo il campione è sottoposto a fenomeni di fototossicità e quindi a danneggiamento. La luce procura delle immagini poco nitide. - Microscopio confocale Il microscopio confocale consente l’osservazione di una immagine ingrandita in forma tridimensionale, grazie alla sua capacità di analizzare più sezioni ottiche sottili e di unirle insieme per formare l’immagine finale, è costruito con tecniche a fluorescenza (immagine ricostruita infine dal computer). Un raggio laser colpisce punto per punto i vari piani del preparato provocando l’emissione luminosa, la luce emessa da ogni punto viene rivelata da un rivelatore confocale al laser che esclude ogni altra emissione. Le informazioni luminose sono ottenute tramite scansione del preparato, raccolte e utilizzate dal software per ricostruire l’immagine sullo schermo.
- la luce riflessa o la fluorescenza emessa vengono rilevate da un tubo fotomoltiplicatore e convertite in segnale digitale (=> monitor)
- principio di Minsky: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo elemento del volume dell'oggetto biologico, ovvero sono confocali Collocazione: presenza di due o più strutture nella stessa posizione. In microscopia a fluorescenza, la presenza di due o più fluorocromi sulla stessa struttura cellulare.Proteine marcate di colori differenti che co- localizzano danno come output un terzo colore, ad esempio rosso + verde = giallo. Collocazione apparente o falsa collocazione: Affinchè la presenza di un colore “da fusione” rappresenti realmente la colocalizzazione spaziale di due molecole marcate da due diversi fluorocromi e non la semplice sovrapposizione di molecole dotate delle stesse coordinate X Y ma di diverse coordinate Z (sovrapposizione di più piani focali), è indispensabile che venga analizzato un singolo piano focale. ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI PER MICROSCOPIA CONFOCALE Il campione può essere osservato:
- fissato: di norma con paraformaldeide 2-4%
- a fresco: cellule in condizioni vitali (CONFOCAL LIVE IMAGING) Per campioni fissati:
- Fissazione
- Inclusione e Taglio (solo per campioni di tessuto)
- Permeabilizzazione (solo per immunofluorescenza) - Colorazione
- Montaggio VANTAGGI:
- Miglioramento della qualità delle immagini: migliore risoluzione e contrasto, minor "rumore di fondo"
- Rapidità di acquisizione e archiviazione delle immagini
- Sezionamento ottico XY e Z (evita la preparazione di sezioni sottili e permette di effettuare una ricostruzione 3D del campione)
- Aumentata risoluzione sui tre assi XYZ
- Permette di lavorare su cellule vive (si evitano gli artefatti di fissazione e inclusione) => CONFOCAL LIVE IMAGING
- Possibilità di eseguire osservazioni in TIME-LAPSE
- Possibilità di effettuare analisi di colocalizzazione SVANTAGGI:
- Costo elevato
- Alta fototossicità
- Alto rischio di photoblicing.
FISSAZIONE
- Ha lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolo stabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti
- Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandone la morfologia
- Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking) Per la microscopia a fluorescenza e confocale: Paraformaldeide 2-4% in PBS pH 7.2-7.
INCLUSIONE E SEZIONAMENTO ( non necessario per colture cellulari) Se il nostro campione ha uno spessore elevato (es. tessuti) si deve procedere al sezionamento. Il campione viene incluso in paraffina e tagliato al microtomo seguendo gli stessi protocolli utilizzati per la microscopia ottica tradizionale. Le sezioni di tessuto possono avere spessore maggiore rispetto alla fluorescenza tradizionale. La fissazione può essere combinata con la PERMEABILIZZAZIONE (per colorare componenti del citoplasma o del nucleo con immunofluorescenza): Si effettua trattando i campioni fissati con detergenti blandi (Es. Triton X100). E’ indispensabile per immunomarcature intracitoplasmatiche e nucleari in quanto permeabilizza le membrane permettendo l’ingresso dell’Ab negli organuli. Non è necessaria per immunomarcature su Ag di membrana. COLORAZIONE Si utilizzano gli stessi fluorocromi utilizzati in microscopia a fluorescenza tradizionale:
- Fluorocromi per marcatura diretta di strutture cellulari, 2)Proteine fluorescenti della famiglia della GFP: trasfezioni cellulari con plasmidi batterici o virus (solo per campioni a fresco). La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina di 238 aa (27 KDa) isolata dalla medusa Aequorea victoria. Inducendo mutazioni nel gene della GFP sono state prodotte varianti di questa proteina con caratteristici spettri di assorbimento ed emissione: BFP - Blue Fluorescent Protein, CFP - Cyan Fluorescent Protein, YFP - Yellow Fluorescent Protein, RFP - Red Fluorescent Protein. G)FP: proteine intrinsecamente fluorescenti
- Possono essere fuse geneticamente alla proteina da marcare
- Sono assolutamente biocompatibili e il legame al target è forte
- La fisiologia della cellula o dell’organismo non viene significativamente alterata, quindi sono sonde ideali per l’osservazione "in vivo"
- E’ possibile creare linee cellulari o organismi transgenici che esprimono direttamente la proteina marcata anziché quella normale.
- Immunofluorescenza: fluorocromi legati ad anticorpi diretti contro una specifica molecola: Colorazione con anticorpi coniugati con fluorocromi per evidenziare in situ costituenti tissutali che sono specifici antigeni. Antigene: sostanza immunogenica, cioè in grado di indurre una attivazione del sistema immunocompetente che porta alla formazione di anticorpi Anticorpo: proteine del siero prodotte in seguito alle esposizione ad un antigene che formano con essi un complesso immune. Possiamo avere un processo diretto (anticorpo primario marcato) facile veloce e meno sensibile; e uno indiretto (anticorpo secondario mercato) in cui si hanno tempi lunghi un elevata probabilità di reazioni a specifiche e si ha peró un segnale amplificato. L’immonufluorescenza per antigeni di suoerficie si può effettuare anche su cellule vive, Mentre quella per gli antigeni intracellulari è necessario fissare e permeabilizzare le cellule. MONTAGGIO DEL CAMPIONE Con ANTIFADING, collante e vetrino coprioggetto. Serve a ridurre il fotodecadimento (Photobleaching) e a preservare la struttura tridimensionale del campione. ANTIFADING: reattivi anti- ossidanti, che possono essere aggiunti al mezzo utilizzato per chiudere il vetrino, che attenuano il decadimento della fluorescenza. ATTENZIONE A:
- presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura
Questo scopo viene raggiunto grazie all’azione di agenti chimici che generalmente disattivano gli enzimi, uccidendo cosi la cellula. La fissazione si può eseguire sia grazie a fissativi chimici che grazie a fissativi fisici. I fissativi chimici più comuni si possono dividere in due gruppi a seconda della loro azione sulle proteine:
- Coagulanti: determinano la precipitazione delle proteine eliminando l’H2O.
- Addittivi: creano legami tra le macromolecole senza eliminare l’ H2O. - Fissativi che coagulano le proteine (semplici) —> alcol etilico, acido acetico e acido picrico,tetrissimo di osmio, sali di metalli pesanti, etanolo, formaldeide. - Fissativi non coagulanti le proteine (miscele fissative)—> acido panico, liquido di bouin, liquido di Carnoy. Nel caso di fissazione fisica si opera per congelamento o rapido riscaldamento. Le cellule che presentano una sostanza fondamentale liquida o semiliquida si esaminano agevolmente grazie alla tecnica degli strisci. 2 INCLUSIONE E SEZIONAMENTO Nell’osservazione di grossi frammenti compatti di tessuto, in seguito alla fissazione è necessario rendere il campione trasparente alla fonte d’illuminazione che si sta usando. Per questo motivo il campione sarà tagliando in sezioni sottili con spessore non superiore ai 10 μm, preferibilmente attorno ai 2-5 μm in modo da garantire una buona risoluzione. A questo scopo si adopera uno strumento: il microtomo, strumento che realizza sezioni istologiche di tessuto. 1.Disidratazione:serie ascendente degli alcool (50°, 70°, 80°, 95°) : un passaggio di un’ora in ciascun alcool; etanolo assoluto: due passaggi di un’ora ciascuno
- Chiarificazione: benzolo o toluolo o equivalente: due passaggi di mezz’ora ciascuno, controllare la chiarificazione a vista
- Infiltrazione: due passaggi in paraffina fusa di un’ora ciascuno (in termostato)
- Inclusione: pezzi lasciati solidificare in paraffina in appositi contenitori per almeno 12 h. 3 COLORAZIONI ISTOLOGICHE Si parla di colorazione quando il colorante si fissa alle strutture cellulari nonostante ripetuti lavaggi. I coloranti sono a base acquosa, per cui si deve eliminare lo xilene e poi riidratare le sezioni attraverso passaggi in etanolo a concentrazioni decrescenti. Dopo la colorazione I preparati si disidratano di nuovo e si montano I vetrini con coprioggetto usando il balsamo. Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche negativamente: basici, sostanze Basofile. Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche positivamente: acidi, sostanze acidolfili. - Colorazioni dirette o sostantive —>sezioni prendono colore dalla soluzione del colorante (mitocondri= mitotracker, si lega alla membrana mitoc., filamenti= phallodin-conjugates, F- actina, lisosomi= lysotracker. Cellule in divisione: apparato Golgi, microtubuli, DNA) - Colorazioni indirette o per mordenzatura—> preparato sottoposto a azioni preliminari alla colorazione. Le colorazioni sono di 2 tipi: 1. Semplici —>un colorante 2. Combinate —>più coloranti I coloranti a loro volta sono: _1. Naturali
- Artificiali I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E
- Sangue, linfa etc.
- Si riconoscono come ampi spazi bianchi_
- Anche i lipidi ed il grasso non si colorano. La colorazione maggiormente usata in istologia è la “ _ematossilina-eosina”: Ematossilina / eosina Ematossilina: ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). Eosina: ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol). Altre colorazioni: ioni Colorazione
- PAS :Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
- Tricromica: Per i tessuti connettivi, Le fibre si colorano in blu, Con E&E sono rosa. •Adiposo Bianco: Le aree bianche sono lipidi •Osmio o Sudan black: Per grasso/lipidi/mielina, I lipidi non incorporano coloranti acquosi •Argento ed oro: Per fibre delicate e processi cellulari_
- Giemsa: Per le cellule del sangue, simile ad E&E. MICROSCOPIA ELETTRONICA La microscopia elettronica permette di superare il limite della microscopia ottica di 0,2μm, colpendo il campione con un fascio di elettroni. La microscopia elettronica utilizza gli elettroni come “fonte d’illuminazione”. Il grosso vantaggio in questo tipo di analisi deriva dal raggiungimento di lunghezze d’onda molto piccole che migliorano il potere di risoluzione del microscopio. Gli elettroni hanno una lunghezza d’onda che varia a seconda della loro velocità (λ= 0,0086 nM a 20kV; λ= 0,0025 nM a 200kV). (V è la differenza di potenziale che accelera gli elettroni). Gli elettroni, accelerati da campi elettrici, si comportano nel vuoto proprio come la luce: viaggiano infatti in linea retta, e anche ad essi è possibile associare una lunghezza d’onda caratteristica che è circa 100.000 volte più piccola di quella della luce visibile. Su questa base si costruì un microscopio dove la sorgente luminosa era sostituita da elettroni e le cui lenti erano dotate di elettromagneti: potendo cosi raggiungere un limite di risoluzione inferiore a 0,1nm. Ciononostante il limite di risoluzione non può essere cosi basso in quanto l’apertura delle lenti è abbastanza piccola. I microscopi più moderni pero possono raggiungere un limite di 0,28nm. I microscopi che usano gli elettroni per la formazione dell’immagine sono di due tipi fondamentali: 1. TEM - Transmission Electron Microscopy 2. SEM - Scanning Electron Microscopy ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI NEL MICROSCOPIO ELETTRICO A TRASMISSIONE In microscopia elettronica l’esame di materiale vivente è impossibile. Il campione deve avere uno spessore massimo di 50-80nm. 1 FISSAZIONE fissativi in soluzioni tampone per veicolarli nelle cellule. In animali da esperimento si usa per fondere il fissativo. 2 DISIDRATAZIONE Dopo la fissazione, il tessuto viene sottoposto a disidratazione in concentrazioni crescenti di alcol etilico o acetone. 3 INCLUSIONE E SEZIONAMENTO
MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)
Il SEM è largamente utilizzato per lo studio delle superfici cellulari o di strutture cellulari isolate. Dal momento che il suo potere risolutivo è circa 20 volte superiore a quello del microscopio ottico, le superfici degli oggetti analizzati vengono riprodotte con un maggiore grado di accuratezza. Al contrario del TEM, nel SEM:
- il fascio di elettroni illuminante eccita le molecole del preparato (CON ELETTRONI PRIMARI ) che rispondono a tale eccitazione emettendo elettroni secondari ; l’immagine deriva quindi dagli elettroni emessi dal preparato e non dagli elettroni del fascio in grado di oltrepassare il campione.
- non vi sono lenti per la rilevazione; gli elettroni secondari vengono catturati da un rilevatore posto ad un lato del preparato.
- fa una scansione della superficie del campione producendo immagini 3D.
SEGNALI EMESSI
- Elettroni secondari: elettroni a bassa energia ( perché persa in seguito ad urti anelastici) provenienti dalla superficie del campione= morfologia della superficie
- Elettroni backscattered: elettroni che emergono dal campione senza perdita di energia ma con cambiamento di direzione= informazioni sulla composizione
- Catodoluminescenza
- Raggi X COSTITUITO DA
- Sistema di illuminazione = sorgente elettronica, lenti di focalizzazione, bobine di deflessione
- Sistema di rivelazione e trasferimento dei segnali = segnali elettronici trasformati in corrente elettrica e opportunamente amplificati
- Sistema di produzione e registrazione delle immagini: sorgente che genera il fascio responsabile dell’immagine, anodo che li accelera, schermo fluorescente
- Sistema del vuoto CARATTERISTICHE SEM:
- Rivela la superficie degli oggetti.
- Gli oggetti vanno rivestiti da una sottile lamina metallica, che riflette gli elettroni.
- Permette di osservare forme, superfici, ma non strutture interne.
- Grande profondità di campo.
- Ingrandimenti fino a 100.000 X. Fasi di allestimento preparati per microscopia elettronica a scansione
- Fissazione
- Disidratazione : serie crescente degli alcooli
- Disidratazione al punto critico (CPD)= serve per passare dalla fase liquida a quella gassosa senza danni: CO
- Montaggio su supporto
- Metallizzazione per sputtering= migliora l’interazione fra fascio e campione: ricopertura con metalli. Immunoistochimica Alcune tecniche consentono la localizzazione citochimica di diverse sostanze (in genere proteine o polisaccaridi) ai microscopi sia ottico sia a fluorescenza sia eletrronico. Con queste tecniche non si riesce a localizzare una generica sostanza proteica o polisaccarica, ma una ben precisa molecola (per esempio, actina o miosina) .Ognuna di queste sostanze funge da antigene, per ciascuno dei quali si possono ottenere i relativi anticorpi. Gli anticorpi specifici, ottenuti immunizzando un animale contro un antigene di cui si vuole studiare la localizzazione, vengono coniugati con una sostanza fluorescente (fluoresceina o rodamina) o con una molecola opaca agli elettroni, quale la proteina ferritina, oppure marcati con particelle di oro colloidale. Le sezioni di tessuto sono poi esposte all'anticorpo, in modo che questo si leghi solo nei siti del tessuto in cui
è presente l'antigene. Se l'anticorpo viene marcato con fluoresceina o rodamina, si formerà un complesso antigene-anticorpo visibile al microscopio a fluorescenza; se viene marcato con ferritina o con oro colloidale, sarà visibile al microscopio elettronico. Quando si fa legare direttamente l'anticorpo marcato all'antigene si parla di metodo diretto, che però è spesso poco sensibile. Nel cosiddetto metodo indiretto, usato più comunemente, l'antigene viene fatto prima reagire con un anticorpo non marcato (anticorpo primario); successivamente, una volta che si è formato il complesso antigene-anticorpo, si fa reagire con un altro anticorpo, questa volta marcato, contro l'anticorpo primario (anticorpo secondario). Più copie di anticorpo secondario sono legare all'anticorpo primario con il risultato di dare un segnale più evidente, inoltre, un altro vantaggio del metodo indiretto è che si esclude che la specificità dell'anticorpo primario venga modificata dai procedimenti chimici impiegati per la marcatura.L'identificazione dell'anticorpo secondario, oltre che per fluorescenza, può essere effettuata con metodi colorimetrici. L'immunoistochimica ha infatti compiuto un notevole progresso con l'impiego dell'enzima perossidasi. L'azione dell'enzima perossidasi sul substrato determina un precipitato color rosso mattone che consente di localizzare l'antigene. Altro enzima molto utilizzato come marcatore è la fosfatasi alcalina. Ľutilizzazione di anticorpi marcati con enzimi ha consentito di incrementare la sensibilità dei metodi immunoistochimici in occorrono poche molecole di enzimi per produrre una reazione visibile al microscopio Si può anche marcare l'anticorpo secondario con isotopi radioattivi, come per esempio iodio radioattivo, ricorrendo, per la rivelazione, all'autoradiografia. Citomeria a flusso La coerenza della luce laser può essere sfruttata per concentrare un fascio di luce monocromatica su singole cellule od organuli cellulari e analizzarne le proprietà mediante l'esame della luce riemersa per fluorescenza. L'emissione di luce fluoreScente puó essere generata da molecole presenti naturalmente nella cellula (fluore- scenza primaria) o da traccianti fluorescenti (fluorocromi) che vengono legati selettivamente alle biomolecole. Tipici fluorocromi sono alcuni coloranti per gli acidi nucleici (per esempio, lo ioduro di propidio), detti intercalanti, perché si intercalano tra le basi azotate. Inoltre, fluorocromi diversi possono essere coniugati con anticorpi diretti verso specifiche glicoproteine di membrana di cellule diverse alle quali si legano specificamente, permettendo di tipizzare vari tipi cellulari in base alla differente fluorescenza emessa. Le proprietà della luce laser possono essere sfruttate a pieno se un numero elevato di cellule, trasportato da una corrente fluida, viene fatto passare davanti al fascio luminoso monocromatico del laser. Infatti, ogni cellula, venendo attraversata dalla luce monocromatica, produce uno o più segnali in base ai quali si possono determinare paretri quali: grandezza e fattore forma, contenuto in DNA , RNA o proteine. Dato che la velocità di analisi è molto elevata con il citofluometro a flusso si possono realizzare indagini statistiche in tempi brevi e con cellule che possono essere mantenute allo stato vitale. la citometria a flusso può consentire, con opportune modifiche, separazione di cellule e organuli, in un apparecchio denominato separatore cellulare, in esso il fluido è costituito da microgocce, ciascuna delle quali contiene di solito una singola particella (cellula od organulo). Quando la cellula, contenuta nella singola microgoccia, viene attraversata dal fascio laser suscita o meno una risposta in luce fluorescente riemersa in tempo reale. Tramite un computer è possibile selezionare le cellule sulla base di alcuni parametri (per esempio, fluorescenza di membrana) in base ai quali le microgocce, contenenti le cellule, possono venire caricate elettrostaticamente, positivamente o negativamente, oppure non venire caricate affatto. Al passaggio attraverso due piastre di deflessione le microgocce non cariche proseguono rettilineamente, mentre quelle cariche vengono deflesse, cosicché esse possono essere raccolte in diversi contenitori. Con questo dispositivo il citofluorimetro a flusso diviene una sofisticata apparecchiatura che, ad alta velocità, consente di ottenere sottopopolazioni di cellule od organuli assolutamente omogenei tra loro secondo il parametro prescelto. Analisi biochimicha e funzionale Le caratteristiche molecolari e funzionali di un campione biologico possono essere valutate con l’ uso di particolari tecniche istologiche e tramite specifico metodi d analisi biochimico-molecolari.
- Citochimica= utilizza tecniche per localizzare sostanze all’interno della cellula per poi risalire alla composizione chimica.
metodi istochimici per gli enzimi sono basati sull’incubazione di sezioni in presenza di un opportuno substra- to specifico per l'enzima. Il substrato viene attaccato dall'enzima, presente nel tessuto, con formazione di un prodotto di reazione insolubile che è già colorato o che può essere reso visibile al microscopio mediante procedimenti successivi. Quello che viene messo in evidenza è il prodotto di una reazione che e catalizzata dall’enzima. Usando substrati adeguati è possibile localizzare molti enzimi sia idrolitici sia non idrolitici. Tra gli enzimi non idrolitici possono essere dimostrate istochimicamente le ossidasi, enzimi che catalizzano il traportò di elettroni da un substrato donatore all ossigeno e le deidrogenasi che catalizzano deidrogenazioni cioè di trasferimento di elettroni dal substrato a un accettare di elettroni. Tra quelli idrolitici le fosfatasi che liberano gruppi fosfato. Acidi nucleici Gli acidi nucleici, sia il DNA sia l’RNA, per la presenza nella loro molecola di numerosi radicali fosforici presentano spiccata affinità per i coloranti basici (azzurro B, blu di toluidina eccetera). Per la dimostrazione specifica del DNA si ricorre spesso alla reazione di Feulgen. Essa si fonda su un principio analogo a quello della reazione PAS. Le sezioni di tessuto fissato sono dapprima sottoposte a idrolisi acida blanda con acido cloridrico. L'idrolisi è sufficiente per allontanare l'RNA, ma non il DNA da cui però vengono allontanate le purine a livello del legame glucosidico purinadesossiribosio del DNA, smascherando i gruppi aldeidici del desossiribosio che reagiscono con il reattivo di Schiff (fucsina basica ridotta con acido sol- foroso e incolore) ossidandolo e riportando la colorazione rosso porpora. Così le zone contenenti DNA (cromatina) appaiono colorate in rosso, mentre il nucleolo e il citoplasma restano incolori. L'intensità di questa colorazione non dipende dal tempo di permanenza nel colorante, ma dalla quantità di DNA presente, per cui si possono effetuare analisi quantitative con uno specifico microscopio chiamato istofotometro, ora in disuso perché sostituito da specifici programmi di analisi di immagini. OCCHIO UMANO ll microscopio si è imposto come necessità operativa dal momento che l’occhio umano è uno strumento limitato Cristallino: lente biconvessa che proietta un’immagine ottica sulla retina. Iride: diaframma che regola l’incidenza dei raggi luminosi. Retina (coni e bastoncelli): recettori fotosensibili. Inizio della via ottica che porta le informazioni al cervello, dove viene poi elaborata l’immagine. I primi riconoscono i colori, i secondi sono sensibili alle differenze di intensità. ACCOMODAZIONE: capacità del cristallino di modificare la distanza focale (messa a fuoco). Il potere di accomodazione o di messa a fuoco da parte del cristallino si arresta verso i 20- 25 cm. A tale distanza si possono distinguere due punti che distano fra di loro 0,2 mm. POTERE DI RISOLUZIONE: la più piccola distanza (d) tra due punti che permette di vedere i due punti ancora come distinti.
- Limite di risoluzione dell’occhio umano: 0,2mm
- Limite di risoluzione del microscopio ottico: 0,2μm
- Limite di risoluzione del microscopio elettronico: 0,2nm Principi di ottica geometrica:
- Se un raggio luminoso si propaga in un mezzo non omogeneo può subire fenomeni di riflessione, rifrazione, assorbimento (colore).
- Se i raggi provenienti dallo stesso punto, dopo aver subito rifrazioni e/o riflessioni, convergono nuovamente in uno stesso punto, si dice che formano una immagine reale della sorgente.
