MICROSCOPIA
Si possono dividere i microscopi a seconda del tipo di onda utilizzata per visualizzare le immagini: microscopi
ottici e microscopi elettronici.
MICROSCOPIA OTTICA
Nei microscopi ottici ci si rende conto che durante l’ingrandimento, oltre un certo limite, non si presentano
ulteriori distinzioni nei particolari, cioè il potere di risoluzione non cresce. Quindi qualsiasi sistema di lenti si
usi non si possono distinguere come separati due punti che distano tra loro meno di 0,2 um. Perciò si dice
che l’ingrandimento utile fornito è di 1000 volte e il suo potere risolutivo è di 0,2 um.
I microscopi ottici si possono distinguere in microscopi a fluorescenza e microscopi confocali.
TIPI DI OBIETTIVO
Si sono diffusi sempre più microscopi i cui obiettivi proiettano l’immagine a una distanza infinita, perciò i
raggi che escono dall’obiettivo corrono quasi paralleli lungo il tubo microscopico. Questa immagine viene
ripresa da una lente intermedia e proiettata in un ben preciso piano focale del tubo microscopico, infine
l’immagine intermedia è ripresa dall’oculare e ulteriormente ingrandita. Questi obiettivi vengono chiamati
obiettivi all’infinito.
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
Il preparato viene illuminato con luce ultravioletta ad una determinata lunghezza d’onda e i suoi componenti
vengono esaminati in base alla fluorescenza emessa, come sorgente luminosa viene utilizzata una lampada
a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette.
La fluorescenza è il fenomeno per cui determinate sostanze colpite dalle radiazioni ultraviolette emettono
luce di lunghezza d’onda maggiore. Essa è dovuta al rilascio di energia da parte di elettroni, che venendo
eccitati dalla luce ultravioletta, passano da un orbitale a quello superiore, però essendo elettroni instabili
ritornano al punto di partenza restituendo l’energia assorbita sotto forma di calore e luce. Poiché parte
dell’energia assorbita viene ceduta sotto forma di calore, la luce emessa avrà un’energia minore di quella
eccitante e una maggiore lunghezza d’onda.
Si possono avere due tipi di fluorescenza: quella naturale (prodotta da sostanze presenti nel tessuto) e quella
secondaria (viene indotta da una colorazione con coloranti fluorescenti detti fluorocromi). Nel caso della
fluorescenza secondaria sono disponibile in commercio diversi tipi di fluorocromi. I più comuni sono l’arancio
di acridina che ha particolari affinità con gli acidi nucleici, lo ioduri di propidio che colora in rosso il DNA e il
DAPI che lo colora di blu.
Un tempo, nei microscopi a fluorescenza, la lampada a vapori di mercurio era messa sotto il condensatore,
per cui la luce ultravioletta attraversava il preparato eccitandolo. La luce ultravioletta, per evitare danno alla
vista, veniva poi fermata prima di arrivare all’oculare da appositi filtri di sbarramento, per cui all’occhio
dell’osservatore arrivavano solo i raggi luminosi emessi per fluorescenza.
Attualmente si preferisce utilizzare un sistema molto più sensibile denominato epifluorescenza. Tale
microscopio si avvale di una sorgente luminosa ad alta energia, di un filtro di eccitazione e uno specchio
dicroico.
Il vantaggio è che è semplice da usare, poco costoso ed ha medio-buona sensibilità.
