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VISUALIZZAZIONE DELLA CELLULA
La biologia cellulare ha avuto inizio con il microscopio ottico e negli ultimi anni la microscopia ottica è diventata importantissima soprattutto nei metodi per: ● MARCATURA SPECIFICA ● VISUALIZZAZIONE DEI SINGOLI COSTITUENTI CELLULARI ● RICOSTRUZIONE TRIDIMENSIONALE DEI COSTITUENTI CELLULARI E’ diventata importante perché la luce causa pochi danni ai costituenti che possono essere intrinsecamente fluorescenti (proteine). Però, il microscopio ottico non è in grado di andare più a fondo quindi sono nati nuovi strumenti per mappare la posizione delle singole molecole e uno di questi strumenti è il microscopio elettronico.
OSSERVAZIONE DELLE CELLULE
1838: DOTTRINA CELLULARE.
Schleiden e Schwann scoprirono che tutti i tessuti animali e vegetali sono aggregati di singole cellule. Questa scoperta è stata possibile grazie alla disponibilità di buoni microscopi ottici. Ma le cellule animali sono prive di colori e traslucide e quindi grazie ai vari coloranti che fornivano un contrasto su ciente si sono scoperte le principali caratteristiche interne delle cellule. Ancora oggi la microscopia dipende tanto da: ● PREPARAZIONE DEI CAMPIONI ● PRESTAZIONI DEL MICROSCOPIO
A causa della sua natura ondulatoria, la luce non segue esattamente la via diritta di un raggio idealizzato postulata dall’ottica geometrica. DIFFRAZIONE OTTICA: le onde interferiscono tra di loro. ONDE IN FASE: raggiungono lo stesso oggetto da due percorsi diversi ONDE FUORI FASE: interferiscono tra di loro e si annullano a vicenda. LIMITE DI RISOLUZIONE: è la separazione limite a cui due oggetti possono ancora essere visti come distinti. Dipende sia dalla lunghezza d’onda della luce sia dall’apertura numerica del sistema di lenti usato e quest’ultima influisce sulla capacità delle lenti di raccogliere luce.
QUANDO I LIVELLI DI LUCE SONO BASSI IL RUMORE DEI FOTONI CREA
ULTERIORI LIMITI DI RISOLUZIONE
Con una forte illuminazione (grande numero di fotoni o elettroni) le caratteristiche del campione sono determinate dalla distribuzione di queste particelle nel rivelatore ma un basso numero di particelle rende il campione sfocato e la precisione è limitata. Questa variabilità CASUALE è definita RUMORE.
Però, i tessuti risultano essere troppo molli e fragili dopo la fissazione quindi è importante congelarli o includerli in un mezzo di supporto (cere o resine) prima di sezionarli. Possono poi essere induriti per formare un corpo solido da passare al microtomo ed essere sezionati e stesi su un vetrino al microscopio. Nel contenuto della maggior parte delle cellule ci sono pochissimi elementi che impediscono il passaggio della luce e per studiare i campioni di tessuto esistono tre approcci di erenti che possono mettere in evidenza le di erenze nei tipi di molecole presenti: ● PRIMO APPROCCIO: colorare le sezioni con coloranti organici che hanno a nità con componenti subcellulari. Il più comunque è l’ematossilina che rivela la distribuzione di DNA, RNA e proteine acide della cellula. ● SECONDO APPROCCIO: si possono usare i tessuti sezionati per visualizzare schemi specifici di espressione genica di erenziale. Ad esempio, l’ibridazione in situ rivela la distribuzione e l’abbondanza di RNA nel materiale selezionato o in preparato con interi organismi. E’ usato insieme a sonde fluorescenti. ● TERZO APPROCCIO: è applicato per localizzare proteine di interesse e anche in questo caso si usano sonde e marcatori.
MOLECOLE SPECIFICHE POSSONO ESSERE LOCALIZZATE NELLE CELLULE
Le molecole fluorescenti assorbono la luce a una lunghezza d’onda e la emettono a un’altra più lunga quindi con l’uso di coloranti fluorescenti, di un microscopio a fluorescenza e con un’illuminazione avente lunghezza d’onda pari a quella di assorbimento è possibile vedere, su sfondo scuro, le molecole di interesse. Questo microscopio è come quello ottico solo che la luce che illumina (molto potente) passa attraverso due serie di filtri: ● PRIMO: filtra la luce prima che raggiunga il campione. Lascia passare solo le lunghezze d’onda che eccitano il colorante fluorescente ● SECONDO: filtra la luce ottenuta dal campione. Blocca la luce che eccita il colorante e fa passare solo quella che emana il colorante La microscopia a fluorescenza viene usata spesso per rivelare proteine specifiche o altre molecole in cellule e tessuti. Una tecnica è quella di accoppiare coloranti a molecole altamente reagenti (anticorpi) per trovare particolare macromolecole nelle cellule o nella matrice extracellulare. I coloranti più comuni in questo caso sono: ● FLUORESCEINA che emette un’intensa fluorescenza con luce blu ● RODAMINA che emette una fluorescenza rossa con luce giallo-verde
Alcuni coloranti, però, sono stati sviluppati proprio per questa microscopia come Cy3, Cy5 e i coloranti Alexa ma svaniscono molto rapidamente se illuminati continuamente perché sono organici. Per questo sono stati sviluppati dei fluorocromi inorganici molto più stabili. Si tratta di minuscoli cristalli di materiale semiconduttore chiamate nanoparticelle e possono emettere una fluorescenza blu ad ampio spettro. Il colore dipende dalle dimensioni del nanocristallo (da 2 a 10 nm). Inoltre, queste nanoparticelle, possono essere accoppiate ad altre sonde e possono addirittura essere introdotte in una cellula viva, come un embrione.
GLI ANTICORPI POSSONO ESSERE USATI PER RIVELARE MOLECOLE
SPECIFICHE
ANTICORPI: proteine specifiche prodotte dal sistema immunitario dei vertebrati per la difesa contro le infezioni. Sono uniche perché riconoscono un singolo antigene e questa specifica specificità li rende strumenti potenti per la biologia cellulare. Quando sono marcati con coloranti fluorescenti sono preziosi per localizzare molecole specifiche nelle cellule mediante microscopio a fluorescenza. Vengono marcati con particelle elettrondense e sono usati per scopi simili alla microscopia elettronica. Quando si usano gli anticorpi come sonde per rilevare le molecole specifiche nelle cellule spesso il segnale fluorescente che producono viene amplificato con mezzi chimici. IMMUNOCITOCHIMICA INDIRETTA: sebbene un marcatore come un colorante fluorescente possa essere legato direttamente a un anticorpo usato per il riconoscimento specifico (anticorpo primario) si ottiene un segnale più forte usando un anticorpo non marcato e rivelando così gli anticorpi secondari marcati legati ad esso. L’amplificazione viene fatta spesso usando un enzima come l’enzima fosfatasi alcalina che, in presenza di sostanze chimiche, produce fosfato inorganico che a sua volta porta alla formazione locale di un precipitato colorato. Questo rivela la posizione dell’anticorpo secondario e quindi la posizione del complesso antigene-anticorpo.
LA VISUALIZZAZIONE TRIDIMENSIONALE E’ POSSIBILE AL MICROSCOPIO
OTTICO
Nel processo di sezionamento dei tessuti si perdono info riguardo alla terza dimensione e quindi come si può osservare? Anche se un microscopio ottico è messo a fuoco su un particolare piano focale all’interno di campioni complessi tridimensionali, tutte le altre parti del campione, sopra e sotto il piano del fuoco, sono anch’esse illuminate e la luce che origina da queste regioni rende complessivamente l’immagine sfuocata. Ciò può rendere molto di cile interpretare l’immagine in dettaglio e può portare all’o uscamento della struttura fine dell’immagine, resa confusa dalla luce fuori fuoco.
Però ci sono degli svantaggi in entrambi i casi: nessuno dei due è utile con i campioni molto spessi: ● METODI DI DECONVOLUZIONE: diventano ine caci a una profondità del campione maggiore di 40 micrometri. ● MICROSCOPI CONFOCALI: non va oltre i 150 micrometri Oggi i microscopi speciali possono sfruttare il modo in cui sono eccitate molecole fluorescenti, per sondare a profondità maggiore il campione. Le molecole fluorescenti sono di solito eccitate da un singolo fotone ad alta energia, a lunghezza d’onda inferiore a quella della luce emessa, ma possono anche essere eccitate dall’assorbimento di due (o più) fotoni a energia minore, purché entrambi arrivino nel giro di un femtosecondo circa. L’uso di questa eccitazione a lunghezza d’onda maggiore ha alcuni vantaggi importanti. Oltre a ridurre il rumore di fondo, la luce rossa o nel vicino infrarosso può penetrare a maggiore profondità in un campione.
SINGOLE PROTEINE POSSONO ESSERE ETICHETTATE COME COMPOSTI
FLUORESCENTI IN CELLULE E ORGANISMI VIVENTI
Varie tecniche sono state sviluppate per rendere visibili al microscopio componenti specifici delle cellule viventi. Molti di questi metodi utilizzano proteine fluorescenti e richiedono un compromesso fra preservazione della struttura e marcatura e ciente. Tutte le molecole fluorescenti discusse finora sono prodotte fuori dalla cellula e quindi introdotte artificialmente in essa. Ma l’uso di geni che codificano proteine che sono esse stesse intrinsecamente fluorescenti permette anche la creazione di organismi e linee di cellule che producono le proprie etichette visibili, senza l’introduzione di molecole estranee. La principale fra le proteine fluorescenti usate per questi scopi è la GFP (la proteina fluorescente verde isolata dalla medusa Aequorea victoria. Questa proteina è codificata da un singolo gene che può essere clonato e introdotto in cellule di altre specie. La proteina appena tradotta non è fluorescente, ma nel giro di un’ora circa (meno per alcuni alleli del gene, di più per altri) subisce una modificazione post-traduzionale auto catalizzata che genera un centro fluorescente e ciente e brillante, schermato all’interno di una proteina a forma di barile, che sarà fluorescente quando illuminata appropriatamente con luce blu. Uno degli usi più semplici della GFP è il suo utilizzo come molecola reporter fluorescente per monitorare l’espressione genica. Si può produrre un organismo transgenico con la sequenza che codifica la GFP posta sotto il controllo trascrizionale del promotore che appartiene a un gene di interesse; ciò dà un quadro direttamente visibile dello schema di espressione del gene nell’organismo vivente. La sequenza che codifica il DNA della GFP può anche essere inserita all’inizio o alla fine del gene di un’altra proteina, generando un prodotto chimerico che consiste di quella proteina con un dominio GFP attaccato. In molti casi la proteina di fusione con la GFP si comporta come la proteina originaria, rivelando direttamente la sua posizione e la sua attività per mezzo della sua fluorescenza codificata geneticamente.
