Estrutura Molecular e Interações: Níveis de Energia e Espectros, Exercícios de Técnicas Experimentais

Baixe Estrutura Molecular e Interações: Níveis de Energia e Espectros e outras Exercícios em PDF para Técnicas Experimentais, somente na Docsity! 3. Técnicas Experimentais Muito do nosso atual conhecimento acerca da estrutura da matéria é baseado em investigações espectroscópicas. Informações sobre a estrutura molecular e sobre a interação de moléculas com seus vizinhos podem ser derivadas de diversos modos a partir dos espectros de emissão e absorção gerados quando a radiação interage com os átomos ou moléculas da matéria. Apresentamos aqui uma breve descrição sobre os processos de absorção e de fluorescência sob condições foto-estacionárias (excitação com uma fonte contínua). 3.1 Conceitos básicos A luz, em seu aspecto ondulatório, é uma onda eletromagnética, que consiste de campo elétrico e magnético mutuamente perpendiculares que oscilam senoidalmente. Quando uma onda deste tipo encontra uma molécula, ela pode ser espalhada (sua direção de propagação muda) ou absorvida (sua energia é transferida à molécula). A probabilidade relativa de cada processo é uma propriedade da molécula particular encontrada. Se a energia eletromagnética da luz é absorvida, a molécula passa a um estado excitado. Uma molécula ou sua parte que pode ser excitada por absorção é chamada cromóforo. Esta energia de excitação é usualmente convertida em calor (energia cinética) pela colisão da molécula excitada com outra molécula (molécula do solvente). Em algumas moléculas é re-emitida em fluorescência. Em ambos casos, a intensidade da luz transmitida por um conjunto de cromóforos é menor que a intensidade da luz incidente. Uma molécula possui um conjunto de quantidades discretas (quanta) de energia, descritas pelas leis da mecânica quântica. Estas quantidades são chamadas níveis de energia da molécula. Os níveis principais de energias são determinados pelas possíveis distribuições espaciais dos elétrons e são chamados níveis eletrônicos de energia; sobre estes estão superpostos níveis vibracionais, 37 que indicam os vários modos de vibração da molécula. Há ainda subdivisões menores chamados níveis rotacionais. O nível eletrônico mais baixo é chamado estado fundamental e os outros são os estados excitados (Freifelder, 1982). Figure 3.1 Esquemas para as probabilidades de transição de uma molécula envolvendo os estados vibracionais de dois estados eletrônicos, sendo R a distância internuclear. O mínimo de energia corresponde à distância de equilíbrio em cada estado eletrônico (www.chemkeys.com). Espectro molecular Podemos expressar a energia total de excitação de uma molécula, com boa aproximação, como a soma das energias de excitações parciais dos níveis eletrônico, vibracional e rotacional mencionadas acima: E = Eel + Evib + Erot (3), onde os subscritos el, vib e rot significam eletrônica, vibracional e rotacional, respectivamente. As Figuras 3.1 e 3. ilustram os níveis vibracionais e rotacionais em dois estados eletrônicos de uma molécula, I e II, e as possíveis transições entre eles. 40 Transições σ → σ∗ Um elétron num orbital ligante σ é excitado ao correspondente orbital antiligante σ∗. A energia requerida é grande. Por exemplo, o metano (que tem somente ligações C-H e pode somente se submeter a transições σ → σ∗) mostra um máximo de absorbância em 125 nm. O pico de absorção, devido a estas transições, não é visto no espectro típico do ultravioleta e visível (200-700 nm). Transições n → σ∗ Compostos saturados contendo átomos com pares solitários (elétrons não ligantes) são capazes de transições n → σ∗. Estas transições usualmente necessitam menos energia que as transições σ → σ∗. Podem ser iniciadas pela luz cujos comprimentos de ondas estão no intervalo 150-250 nm. O número de grupos funcionais orgânicos com picos n → σ∗ na região ultravioleta é pequeno. Transições n → π∗ e π → π∗ A maioria da espectroscopia de absorção de compostos orgânicos é baseada em transições de elétrons n ou π para o estado excitado π∗. Isto se deve a que os picos de absorção para estas transições caem numa região experimentalmente conveniente do espectro (200 – 700 nm). Estas transições necessitam um grupo insaturado na molécula para fornecer os elétrons π. As absorções molares de transições n → π∗ são relativamente baixas e estão em intervalos de 10 a 100 M −1 cm −1 . Transições π → π∗ normalmente dão absorções molares entre 10 3 a 10 4 M −1 cm −1 . Figura 3.3 Esquema de energias correspondentes a transições eletrônicas (SHU - School of Science and Mathematics: www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/). 41 O solvente no qual os cromóforos são dissolvidos têm também um efeito no espectro das espécies. Os picos resultantes das transições n → π∗ são deslocados a comprimentos de ondas mais curtos ("blue shift") com o incremento da polaridade do solvente. Isto se origina da solvatação incrementada do par solitário, que abaixa a energia do orbital n. Freqüentemente, mas não sempre, o reverso ("red shift") é visto para transições π → π∗. Isto é causado por forças atrativas de polarização entre o solvente e o cromóforo, que abaixam os níveis de energia dos estados excitados e não excitados. Este efeito é maior para o estado excitado, e assim a diferença de energia entre o estado não excitado e o excitado é fortemente reduzida - tendo por resultado um "red shift" pequeno. Este efeito também influencia transições n → π∗ mas é sobrepujado pelo "blue shift" resultante da solvatação dos pares solitários. b. Transições envolvendo elétrons por transferência de carga. Muitas espécies orgânicas mostram absorção por transferência de carga e são chamados complexos de transferência de carga. Para um complexo demonstrar comportamento de transferência de carga, um de seus componentes deve ter propriedades de doador e o outro aceptor de elétrons. Absorção de radiação então envolve a transferência de um elétron do doador a um orbital associado a um aceptor. Absorções molares associadas a transferência de carga são grandes (maiores que 10 4 M −1 cm −1 ) (S.H.U. School of Science and Mathematics: www.shu.ac.uk/ schools/sci/chem/tutorials/). Em condições normais de temperatura (ambiente ou próxima dela) as moléculas estão no estado vibracional de menor energia do estado fundamental eletrônico. Deste modo, a absorção do fóton de radiação irá excitar as moléculas para um estado eletrônico maior e para os diversos níveis vibracionais e rotacionais deste estado eletrônico. O espectro de absorção será, portanto, composto por um conjunto de bandas, associadas às diversas transições vibracionais e rotacionais possíveis dos dois estados eletrônicos envolvidos na transição, e dependerá das regras de seleção espectroscópicas válidas para cada caso. Já que o espaçamento entre os estados rotacionais é muito pequeno, normalmente estas transições não aparecem em forma de bandas resolvidas. 42 3.2.1 Intensidade de absorção Se a luz da intensidade I0 passa através de uma substância de espessura b (em cm) e concentração molar c (M ou mol.L −1 ), a intensidade I da luz transmitida obedece à lei de Beer-Lambert: cb oII ε−⋅= 10 ou ( ) bcIIo ε=/log Onde ε é o coeficiente de absorção molar. Os dados de absorção são reportados como transmitância ( %100/ ⋅= oIIT ) ou, mais usualmente, como a absorbância, ( )IIA olog= . Quando b = 1 cm, A é chamado de densidade óptica, ODλ. A densidade óptica é mais conveniente porque é igual a ε c. O coeficiente de absorção molar é característico de uma substância em condições definidas de comprimento de onda, solvente e temperatura. Tem unidades M −1 cm −1 . A lei de Beer-Lambert tende a sofrer limitações devidas a certos desvios. Desvios químicos, que são resultados de alterações químicas associadas com a mudança de concentração, já que em soluções relativamente concentradas (> 0,01 M) a distância média entre as moléculas diminui e as interações entre as mesmas começam a afetar as distribuições de cargas. Isto pode alterar a habilidade das espécies absorverem num dado comprimento de onda e em alguns casos, quando c é alto, ε aparece ser uma função de c. Muitas moléculas, em algumas soluções, formam dímeros ou polímeros maiores à medida que a concentração aumenta, ocasionando certos problemas já que o espectro dos dímeros pode diferir daquele dos monômeros. Outro efeito em concentrações altas é a agregação; isto conduz freqüentemente ao espalhamento da luz, decrescendo a quantidade de luz transmitida. Outra causa do desvio da lei de Beer é a desnaturação de proteínas em baixas concentrações. Desvios e limitações instrumentais: dependem do equipamento e da forma como a medição é feita. 45 Algumas das bandas de absorção consistem de picos múltiplos e os comprimentos de onda correspondentes aos picos que têm coeficientes de absorção molar menores são freqüentemente registrados. Por exemplo: Aminoácido λMAX (nm) 10 −3 ε (M −1 cm −1 ) 280 5,6 Triptofano 219 47 274 1,4 222 8,0 Tirosina 193 48 257 0,2 206 9,3 Fenilalanina 188 60 Histidina 211 5,9 Cisteína 250 0,3 O espectro de absorção dum cromóforo é principalmente determinado pela estrutura química da molécula. Entretanto, um número grande de fatores ambientais produz mudanças detectáveis em λMAX e ε. As características gerais destes efeitos ambientais são os seguintes: Efeitos de pH. O pH do solvente determina o estado de ionização dos cromóforos ionizáveis. Efeitos de polaridade. Para cromóforos polares, o valor de λMAX para transições n → π∗ ocorre em comprimentos de onda mais curtos em solventes polares (água, álcoois) do que em solventes não polares. Esta mudança dá-se em direção a comprimentos de onda maiores para transições π → π∗. Esta última transição é a mais comum para moléculas biológicas. Exceções são os aminoácidos que são geralmente usados em análises de conformação (Freifelder, 1982). 46 3.3 Espectroscopia de Emissão A fluorescência é um tipo de luminescência que consiste no processo de emissão envolvendo estados eletrônicos de mesma multiplicidade de spin (estados eletrônicos singletes). Tais transições na mecânica quântica são "permitidas" e as taxas emissão são tipicamente perto de 10 8 seg −1 . Estas altas taxas de emissão dão como resultado um tempo de meia-vida de fluorescência perto a 10 −8 s ou 10 ns. Certas substâncias que apresentam fluorescência significativa, como por exemplo a antroil-ouabaína (Figura 2.11), geralmente têm elétrons deslocalizados presentes nas ligações duplas conjugadas. O diagrama sugerido por A. Jablonski para os níveis de energia ilustra o processo de absorção e emissão de luz (Figura 3.5). Figura 3.5 Diagrama de Jablonski para o sistema de níveis de energia para a molécula de benzeno (www.chemkeys.com). Na Figura 3.5, os diferentes tipos de processos para a desativação molecular dos estados eletrônicos e vibracionais excitados, estão representados por: transições radiativas permitidas por multiplicidade de spin (setas contínuas,
); transições radiativas proibidas por multiplicidade de spin (setas tracejadas,  ); as transições não radiativas (setas onduladas, ∼∼
), como no processo de relaxação 47 vibracional, que ocorrem dentro de um mesmo nível eletrônico e envolvem a desativação por liberação de calor através dos modos normais de vibração. Além destas transições outras podem ocorrer na molécula como: cruzamento intersistemas, que representa transições não radiativas, isoenergéticas, envolvendo estados de multiplicidades de spin diferentes; conversão interna, associada a transições isoenergéticas que ocorrem em 10 −12 s envolvendo estados de mesma multiplicidade de spin (Atvars e Martelli, 2002). No processo de absorção de luz há uma transição eletrônica que ocorre em 10 −15 s, tempo demasiado curto para um deslocamento significativo do núcleo (princípio Franck-Condon); isto é devido a que a massa de um núcleo é muito maior do que a do elétron. Por isso é que na Figura 3.5 as transições entre os vários níveis eletrônicos são verticais. Uma diferença entre os espectros de absorção e emissão é que o espectro de absorção reflete os níveis vibracionais dos estados excitados eletronicamente e o espectro de emissão reflete os níveis vibracionais do estado eletrônico fundamental (Lakowicz, 1983). 3.3.1 Espectrofluorímetros Existem duas classes de espectrofluorímetros: os fotoestacionários e os pulsados. Os espectrofluorímetros que operam em condições fotoestacionárias excitam as espécies em modo contínuo, obtendo-se os espectros eletrônicos de emissão e de excitação. Os espectrofluorímetros pulsados excitam as espécies por meio de pulsos de radiação, obtendo-se os tempos de decaimento do estado eletrônico excitado e os espectros resolvidos no tempo. O espectrofluorímetro utilizado em nosso trabalho é um espectrofluorímetro fotoestacionário, já que tem uma fonte de excitação que emite de modo contínuo e conseqüentemente origina uma população constante de espécies no estado eletrônico excitado. Os espectrofluorímetros estacionários Um espectrofluorímetro é geralmente composto por dois monocromadores, um de excitação e um de emissão, um sistema de excitação e um sistema de detecção. 50 proteína ou o solvente induz uma mudança de conformação que o leva à superfície. 3. Se uma substância conhecida como supressor (suprime a fluorescência do aminoácido livre), tal como o iodeto, nitrato, ou íons de césio, suprime a fluorescência da tirosina ou do triptofano, o aminoácido deve estar na superfície da proteína. Se não fizer assim, existem varias razões: a. O aminoácido pode estar no interior. b. O aminoácido pode estar numa fenda cujas dimensões são muitas pequenas para que o supressor entre. c. O aminoácido pode estar numa região altamente carregada e a carga pode repelir o supressor. 4. Se uma substância que não afeta o rendimento quântico do aminoácido afeta a fluorescência de uma proteína, ela deve produzir uma mudança conformacional na proteína (Freifelder, 1982). 3.3.3 Fluorescência em membranas As propriedades de membranas comumente estudadas por técnicas de fluorescência incluem aspectos dinâmicos, estruturais e organizacionais. Aspectos dinâmicos incluem a taxa de movimento das cadeias lipídicas, a região da cabeça polar dos fosfolipídios e outros componentes lipídicos e proteínas de membranas. Aspectos organizacionais incluem a distribuição de lipídios em ambos lados da membrana, no plano da membrana (separações de fase) e através da bicamada (assimetria na composição de fosfolipídios), assim como distâncias da superfície ou profundidade na bicamada. Finalmente, existem propriedades das membranas que pertencem à superfície tal como a carga superficial e as propriedades dielétricas. Técnicas de fluorescência têm sido amplamente usadas em estudos de membranas principalmente já que a escala de tempo de tempo vida de fluorescência coincide com a escala de tempo de interesse para o movimento do lipídio e já que existe um amplo número de sondas fluorescentes disponíveis, que podem ser usadas para produzir informação específica sobre propriedades da membrana. Um número de estudos tem tirado vantagem do fato que proteínas de membranas contêm um ou mais resíduos de triptofano, cuja fluorescência pode ser 51 usada para determinar a conformação da proteína ou sua posição na membrana. Por suposto, a informação é limitada pelo número de resíduos de triptofano e pelo fato de que um triptofano não pode ser posicionado na região de interesse da proteína (Lakowicz, 1983). 3.4 Associação de ligantes a macromoléculas Um evento comum nos sistemas vivos é a ligação não covalente de uma ou mais moléculas a uma macromolécula simples. Uma molécula ligada a uma macromolécula é chamada ligante. Existem muitos tipos de ligação. Por exemplo, uma molécula pode ter só um sítio de ligação simples ou pode haver muitos sítios. Os sítios podem ser idênticos ou diferentes e eles podem ser apenas para uma classe de moléculas ou diversas moléculas distintas. Além disso, múltiplos sítios podem ser interdependentes, no sentido em que a ocupação de um sítio por uma molécula ligante pode afetar a afinidade de outros sítios para seus ligantes. 3.4.1 Macromoléculas com um sítio de ligação Considera-se uma molécula P que tem um sítio de ligação para uma molécula A. Na saturação, um mol de P combina-se com um mol de A para formar um complexo PA. PAAP ↔+ (1) A constante de dissociação KD para essa reação é definida como: ][ ]][[ PA AP KD = (2) Definindo-se r como o número de moles de moléculas ligadas a um mol de macromoléculas, então: ][][ ][ ][ ][ PAP PA P A r TOTAL LIGADA + == (3) A maioria das equações que descrevem ligação são expressas em termos de KD e r. Para avaliar r, uma concentração particular [A’] de ligantes é somado a uma conhecida concentração [P’] das macromoléculas e então a concentração de 52 ligantes ligados [PA] ou de ligantes não ligados [A] são medidos. Onde: [A’] = [A] + [PA] e [P’] = [P] + [PA] . Combinando as equações 2 e 3: 1 ][ 1 += A K r D (4) Usando esta equação, o gráfico de 1/r contra a 1/[A] é uma linha reta cujo coeficiente angular é KD. 3.4.2 Macromoléculas com vários sítios de ligação. Muitas macromoléculas biológicas têm mais de um sítio de ligação. Por exemplo, uma típica molécula de proteína pode algumas vezes ligar vários centros de íons de H + . Ademais, os sítios de ligação não sempre são idênticos. Múltiplos sítios de ligação podem ser independentes ou interativos, no caso em que a ocupação de um sítio influi na ligação de um segundo sítio. Discutiremos aqui sítios de ligações independentes. Ligações fortes No caso de ligações firmes, assume-se que cada molécula ligante está ligada se o número total de moléculas ligantes adicionadas for menor que o número total de sítios de ligações na solução. Também, se a quantidade de ligante adicionado excede ao número n de sítios de ligação na solução, cada um dos sítios n é ocupado e os ligantes adicionais permanecem sem ligar. A partir da concentração de ligante na qual algumas moléculas ficam sem ligar, o número de sítios de ligação pode ser medido, isto é, a concentração na qual a quantidade de moléculas ligadas alcança um máximo. Ligações fracas Sítios de ligação fracos independentes e idênticos: Se todos os sítios são idênticos e independentes vamos ter a seguinte equação: ][ 11 An K nr D+= (5) na qual KD é uma constante de dissociação média. Quando a equação (5) é usada, um gráfico 1/r em função de 1/[A] nos dá uma linha reta. Se os sítios de