Pré-visualização parcial do texto
Baixe Capítulo 4 - Elementos de Engenharia Genética e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity!
sezange and pla- 71, 1949. - In: ALVES, ms e evolução diri- RE. (Edts.). Mo- 1964. origin in Asper- 5, 1980. atant of Aspergil- cation strain of al fungi In: Sustrial Micro- ra with unsta- - DE ENGENHARIA GENÉTICA | 4.1 — Introdução Alt Clara G. sehenhera O surgimento da Engenharia Genética, na década de 70, foi uma de- corrência natural da grande quantidade de conhecimentos que vinham se acumulando na área de Biologia Molecular, envolvendo principalmente as bactérias e seus vírus. Entretanto, em contraste com os demais progressos verificados nesta área, o advento da Engenharia Genética teve um impacto formidável sobre a Biotecnologia. Hoje, o homem pode intervir diretamen- te sobre os comandos da vida: é possível programar geneticamente os orga- nismos vivos, não apenas para a superprodução de algum metabolito, mas, ainda, de substâncias que só são normalmente produzidas por outros organis- mos. Pela facilidade de manipulação que proporcionam, os microrganismos foram os primeiros a serem empregados como hospedeiros da informação genética heteróloga. Em princípio, qualquer proteína pode assim vir a ser produzida em fermentações industriais, desde que o gene que a codifica seja enxertado num microrganismo (ou, em outras palavras, clonado) e passe a ser por ele expressado. De crucial importância é a possibilidade que a nova tecnologia trouxe de amplificar segiiências individuais de DNA: a clonagem de um dado fragmento de DNA permite que, partindo-se de apenas uma mo- lécula, sejam produzidas quantidades ilimitadas desta mesma molécula. De- pois que um fragmento de DNA tiver sido assim isolado e amplificado, as suas propriedades podem ser caracterizadas e a sua sequência de nucleotíde- os determinada com precisão, o que proporcionou um progresso vertiginoso do conhecimento básico. Por outro lado, a relevância biotecnológica decorre do fato de que a síntese de proteínas estrangeiras pelos microrganismos leva a uma importante redução dos custos de produção. Para citar apenas um exem- 14 Elementos de engenharia genética plo, para produzir, pelas vias tradicionais, 5 mg de somatostatina, um hormô- nio de vertebrados, são necessários 500.000 cérebros de carneiro. Quando se conseguiu, por meio da Engenharia Genética, enxertar o gene da somatostati- na na bactéria Escherichia coli, o mesmo rendimento foi alcançado com apenas 7,5 kg de bactérias, o que se obtém de maneira rápida e pouco dispendiosa. Chama-se de Engenharia Genética ao conjunto de técnicas que tornam possível a criação de novas combinações gênicas, inexistentes na natureza. A recombinação genética consiste na formação de novas combinações estáveis de genes, provenientes de diferentes organismos, podendo, em consegiiência, surgir novos fenótipos. Entretanto, na natureza, a recombinação genética so- mente ocorre entre organismos de uma mesma espécie ou de espécies muito proximamente relacionadas. A Engenharia Genética, também conhecida sob o nome de Tecnologia do DNA Recombinante, permite que contrariemos a na- tureza no que se refere à recombinação genética. Tornou-se possível construir novas espécies de material genético, através da recombinação realizada artifi- cialmente no laboratório entre moléculas de DNA isoladas de organismos não relacionados. Hoje em dia, as possibilidades de manipulação do material ge- nético em tubo de ensaio (in vitro) são praticamente ilimitadas: costuma-se di- zer que a única limitação reside na capacidade imaginativa do pesquisador. Em 1972, numa experiência que viria a revolucionar toda a pesquisa bio- lógica e criar perspectivas inéditas para a Biotecnologia, PAUL BERG e seus co- laboradores”” demonstraram que era possível cortar in vitro moléculas de DNA de diferentes origens e ligar os fragmentos resultantes entre eles, obten- do assim moléculas híbridas de DNA, inexistentes na natureza. Essa experiên- cia pioneira foi realizada por intermédio de diversas manipulações genéticas e bioquímicas, que se tornaram viáveis graças a uma série de descobertas, que ocorreram em rápida sucessão nos 5 anos que antecederam a experiência de Paul Berg. Entretanto, não faria sentido guardar o novo DNA no tubo de ensa- io. Na verdade, a Engenharia Genética pressupõe uma segunda etapa, in vivo, que consiste na introdução do material genético construído artificialmente (DNA recombinante) numa célula viva, onde ele possa se manifestar. Essa eta- pa de transformação genética é mais delicada, não sendo poucos os problemas que o DNA montado in vitro terá que enfrentar no interior da célula viva. Para que tenha realmente um significado biológico, é necessário que o DNA re- combinante seja não apenas mantido ao longo das divisões celulares da cé- lula originalmente transformada, mas, ainda, transcrito e traduzido na proteína que codifica e, em muitos casos, o produto do gene estrangeiro deverá ainda sofrer passos adicionais de processamento pós-traducional na célula hospedeira. Como esquematizado na Fig. 4.1, são essencialmente necessários quatro passos para uma experiência desse tipo: 1) Um método para clivar e voltar a ligar in vitro diferentes moléculas de DNA, originando a molécula de DNA recombinante; 2) Um elemem multiplicado pela es transporta também & 3) Um meio de cá-lo; 4) Uma manei apenas aquelas ques Plasmídes Origem da replicação Gene de resistência à Tetraciclina ] E e ls Figura 4.) — Esquema gsm dupla fita que const o único sítio suscetível, org fragmentado por meio se Em seguida, as duas que resultará na formaçao: do DNA estrangeiro. Esse biótico tetraciclina, pas. crescerão as células que, las-filhas idênticas (dons! 16 Elementos de engenharia genética 4.2 — Enzimas de restrição: as tesouras moleculares que cortam a molécula de DNA em pontos específicos A construção do DNA recombinante requer que seja possível cortar as moléculas de DNA de modo preciso e reprodutível. Além de ser necessário cortar o vetor num único ponto específico, onde será inserido o DNA estran- geiro, é imprescindível que todas as moléculas do vetor sejam cortadas exata- mente na mesma posição. Conseqiientemente, não se pode realizar esse tipo de construção através da clivagem aleatória do DNA do vetor. Na verdade, a Engenharia Genética só se tornou possível após a descoberta de uma classe es- pecial de enzimas, as endonucleases de restrição, que rendeu o Prêmio Nobel a W. Arber, H. Smith e D. Nathans em 1978. A observação inicial do fenômeno de restrição tinha sido feita cerca de 30 anos antes por LURIA e HUMAN”, que haviam descrito a capacidade que algumas cepas da bactéria E. coli apresentam de se proteger da infecção por bacteriófagos, ou, nas palavras desses autores, de restringir o crescimento do bacteriófago. Hoje se sabe que tal mecanismo de defesa consiste na produção pela bactéria de uma enzima capaz de degradar o DNA viral invasor. O DNA próprio da bactéria fica protegido do ataque pela enzima de restrição porque, ao mesmo tempo em que produz a enzima de restrição, a bactéria também produz umã enzima de modificação, pela ação da qual são acrescen- tados grupos metila a algumas das bases que compõem a segúência de DNA que é reconhecida pela enzima de restrição em questão. Uma vez metilada, essa sequência deixa de ser reconhecida pela enzima de restrição. Assim, para uma determinada enzima de restrição, existe uma enzima de modifica- ção correspondente e fala-se em sistemas de restrição-modificação. As endonucleases de restrição são sintetizadas por muitas, senão to- das, as espécies de bactérias, sendo comum uma mesma espécie bacteriana produzir mais de uma enzima de restrição, mas tais enzimas nunca foram encontradas em organismos eucarióticos. Essa classe de enzimas compreen- de três tipos, que diferem quanto à genética e enzimologia. As enzimas de restrição de Tipo Ie Tipo III têm um modo de ação mais complexo e não são de utilidade em Engenharia Genética. Em contrapartida, sem as enzimas de restrição de Tipo II, não teria sido possível a Engenharia Genética. Assim, daqui por diante, quando falarmos em enzimas de restrição, estaremos nos referindo àquelas de Tipo II. As enzimas de restrição são endodesoxiribonucleases, ou endonuclea- ses, que reconhecem segjiiências específicas de nucleotídeos na molécula de DNA e cortam as duas cadeias de DNA num ponto dentro desta segiiência. Uma determinada enzima de restrição irá catalisar a quebra da dupla fita apenas quando encontrar aquela sequência particular que reconhece. É essa especificidade que em Engenharia Ga Poul (produzida ps encontra uma segã restrição Puull, ps contrar uma sega restrição reconhess que reconhecem se Admitindo & quiência ao longo & 4 pares de bases db uma de 6 bp oa ção de sítios de DNA pode ser tística. Os dife restrição podem manho, através tir desses dados, que envolve a di molécula de DNA. As segii tacional. Em gi isto é, as 2 fitas ita e a outra, da lidas na direção 55 cias de reconhecim na Tabela 4.1. A primeira & nhecem mais de 2. terianas, compress muitos casos, duas tes bactérias, reco chamadas de isos mente aproxi O resultado Há enzimas que 0a como é o caso da É extremidade cess ação. Por outro E dupla fita dem ser necessário Do DNA estran- Na verdade, a uma classe es- Do feita cerca de Espacidade que infecção por grescimento do e na produção invasor. O a de restrição , à bactéria são acrescen- cia de DNA == vez metilada, ição. Assim, = de modifica- Nias, senão to- bacteriana s munca foram as compreen- &s enzimas de exo e não são as enzimas de Semética. Assim, estaremos nos & pu endonuclea- ma molécula de Besta sequência. sa da dupla fita peconhece. É essa Enzimas de restrição: as tesouras moleculares que cortam a molécula de DNA HT especificidade que faz das enzimas de restrição instrumentos tão importantes em Engenharia Genética. Assim, por exemplo, a enzima de restrição chamada Povul (produzida pela bactéria Proteus vulgaris) corta o DNA somente quando encontra uma sequência de 6 nucleotídeos CGATCG. Por sua vez, a enzima de restrição Puull, produzida pela mesma bactéria, só corta o DNA quando en- contrar uma sequência hexanucleotídica CAGCTG. A maioria das enzimas de restrição reconhece sequências hexanucleotídicas, mas há também algumas, que reconhecem segjiiências de 4 a 12 nucleotídeos. Admitindo que os 4 diferentes nucleotídeos ocorram com a mesma fre- qiuiência ao longo da molécula de DNA, calcula-se que uma dada segiência de 4 pares de bases (bp) ocorra em média a cada 256 bp (0,25º = 1/256), enquanto uma de 6 bp ocorra a cada 4.096 bp da molécula. Entretanto, como a distribui- ção de sítios de reconhecimento não é regular, uma determinada região do DNA pode ser cortada mais, ou menos, frequentemente do que a média esta- tística. Os diferentes fragmentos originados pela digestão com uma enzima de restrição podem facilmente ser separados uns dos outros, com base no seu ta- manho, através de eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida. A par- tir desses dados, é possível construir o que se chama de mapa de restrição, o que envolve a determinação da posição e da orientação de cada fragmento na molécula de DNA original. As sequências de reconhecimento no DNA apresentam uma simetria ro- tacional. Em geral, a seqiiência de reconhecimento constitui um palíndromo, isto é, as 2 fitas têm a mesma segjiiência, se uma é lida da esquerda para a dire- ita e a outra, da direita para a esquerda (ou, em termos de DNA, se ambas são lidas na direção 5' para 3' ou ambas são lidas na direção 3' para 5). As segiên- cias de reconhecimento de algumas enzimas de restrição estão apresentadas na Tabela 4.1, A primeira enzima de restrição foi isolada em 1970” e hoje já se co- nhecem mais de 2.500, isoladas a partir de uma vasta gama de espécies bac- terianas, compreendendo 230 diferentes segiiências de reconhecimento. Em muitos casos, duas ou mais enzimas de restrição, provenientes de diferen- tes bactérias, reconhecem a mesma segiiência de DNA: essas enzimas são chamadas de isoesquizômeros. Hoje, encontram-se disponíveis comercial- mente aproximadamente 170 diferentes enzimas de restrição. O resultado do corte pode ser diferente, segundo a enzima de restrição Há enzimas que cortam exatamente no meio da segiência de reconhecimento, como é o caso da Pvulle da Alul (ver Tab. 4. 1), originando o que se chama de extremidade cega ou abrupta nos fragmentos de DNA resultantes da sua ação. Por outro lado, um número considerável de enzimas de restrição corta a dupla fita de maneira a gerar extremidades coesivas nos fragmentos resultantes. p= =s sequências de fps = cxosina, respecti- seno de reconheci- palindrômica dentídeos. O cor- ja ão palindró- gera extre- extremida- Es ou cegas. de 4 nucleotí- emidades ce- Es purina (Pu) ou = (Py) pode es- de & nuclcotí- o fregênte no mamífero: ades coesivas jo de fita sim- pode ser qual- =n= ou pirimidi- & das raras enz produz exten- ais de 4 bases. | écula de DNA ro da segliência adas de curtas se- mostrado para o Enzimas de restrição: as tesouras moleculares que cortam a molécula de DNA 119 DNA de plasmídeo integro CTTAAG Quebra por Eco RI DNA linearizado de plasmídeo com extremidades coesivas G AATTC CTTAA G Figura 4.2 Digestão de DNA pela enzima de restrição Eco RI, Uma molécula de DNA circular de dupla fita con- tendo apenas uma sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição Eco RI, após tratamento com esta enzima, será convertida numa molécula linear com extremidades coesivas do tipo Eco RI. Assim, por menor que seja a semelhança entre as sequências de nucleo- tídeos de duas moléculas de DNA, a enzima de restrição saberá encontrá-la e cortará ambas as moléculas neste ponto. Fragmentos originados a partir de moléculas de DNA diferentes, porém digeridas pela mesma enzima de res- trição, quando dotados de extremidades coesivas, irão se associar com gran- de facilidade através da complementaridade de segiiência, como mostrado na Fig. 4.1. Todas as enzimas de restrição clivam a ligação fosfodiéster, deixando grupos 5º fosfato (5' P) e 3” hidroxila (3' OH) nos fragmentos resultantes, que constituem exatamente o substrato da enzima DNA ligase. Assim, os fragmentos gerados por ação de uma enzima de restrição poderão ser facil- mente reunidos através de ligação covalente, por adição da DNA ligase, que catalisa a formação de novas ligações fosfodiéster. Também é possível realizar a ligação entre fragmentos de DNA dotados de extremidades abruptas (como, por exemplo aquelas geradas pela digestão com a enzima de restrição PuulI), empregando-se a DNA ligase produzida por E. coli in- fectada pelo bacteriófago T4. O modo de ação da DNA ligase de E. colie o 120 — clementos de engenharia genética da DNA ligase de T4 são muito semelhantes, diferindo entretanto quanto ao co-fator requerido: Enquanto a DNA ligase de E. coli requer NAD, a de T4 requer ATP. Apesar da facilitação que se obtem para a etapa de ligação, quando se utiliza a mesma enzima de restrição para ambas as espécies de DNA a serem recombinadas, surgem também alguns inconvenientes. Como, por exemplo, uma extremidade EcoRI vai ser capaz de se emparelhar com qualquer outra extremidade EcoRI, no momento em que a enzima DNA ligase for adicionada ao sistema, algumas moléculas do vetor irão se recircularizar através da rea- ção entre as suas 2 extremidades, sem que tenha ocorrido nenhuma inserção de DNA estrangeiro. Por outro lado, também irão se formar moléculas híbri- das, contendo inserções de vários fragmentos do DNA estrangeiro religados entre cles através das suas extremidades EcoRI. Como mostrado na Fig. 4.3, a recircularização do plasmídeo pode ser evitada, se, antes da etapa da DNA li- gase, o plasmídeo linearizado for submetido à ação da enzima fosfatase alcali- na, que remove os fosfatos das extremidades 5º da molécula, impedindo em consegiiência a ação da DNA ligase, cujo substrato é constituído de extremi- dades 5'P e 30H. Assim, quando as 2 espécies de DNA a serem recombinadas forem postas em presença uma da outra e da DNA ligase, as extremidades 5'P dos fragmentos do DNA estrangeiro serão ligadas às extremidades 3'0H do plasmídeo, numa das fitas. Na outra fita, sobrará uma interrupção, porque tampouco poderá ocorrer a ligação entre as extremidades 3'OH do DNA es- trangeiro com o plasmídeo, mas a célula bacteriana é capaz de reparar tais interrupções de fita simples, de modo que, uma vez dentro da célula, o plas- mídeo recuperará a sua integridade conformacional. Outras alternativas existentes para contornar o problema da recircularização do vetor serão ex- plicadas mais adiante. 4.3 — Vetores genéticos: as moléculas de DNA que veiculam a propagação dos fragmentos de DNA de interesse Um vetor genético nada mais é que uma molécula de DNA, que pode aceitar introduções de DNA estrangeiro em regiões não essenciais para a sua multiplicação dentro da célula hospedeira. Tais moléculas de DNA serão, portanto, as transportadoras do DNA heterólogo para o interior da célula hospedeira, possibilitando a sua multiplicação, sob a forma de uma molécu- la híbrida. É desejável que o DNA do vetor possa ser extraído em separado do DNA cromossômico do hospedeiro, para facilitar que se recupere o DNA estrangeiro inserido neste vetor. Entre as bactérias, são frequentemente en- contrados elementos genéticos extracromossômicos, tais como plasmídeos e vírus (bacteriófagos), que preenchem esses requisitos. Podemos dizer que a Engenharia Genética só se tornou realidade porque plasmídeos e vírus bac- terianos se mostraram capazes de reprodução após a adição de sequências de DNA estrangeiras ao seu genoma. oH Fosfatase alcalina! Ho [5 Fragmento ds! estrangeiro Figura 4.3 — Desfososd o DNA do plasmídeo em presença do fragments Para que o D da célula viva que & DNA recombina: síntese de DNA lp novo DNA. Para & correspondente a & tese de DNA da css gens de replicação do cromossomo da deira, haverá cópias lula irá originar ao 5 122 Flementos de engenharia genética Tor outro lado, para que aquelas células que tiverem efetivamente incor- porado o novo DNA possam ser identificadas, o replicon deve conter algum gene que confira às células uma nova característica, facilmente detectável (marcador genético). Os marcadores genéticos mais frequentemente utiliza- dos para a manipulação de bactérias são os genes de resistência a drogas. Assim, das milhares de bactérias submetidas ao agente infeccioso, poderão ser facilmente selecionadas aquelas poucas que tiverem realmente sido infec- tadas, através de uma simples semeadura sobre meio contendo a droga em questão, à qual as células eram originalmente sensíveis. O primeiro vetor a ser utilizado em Engenharia Genética foi o plas- mídeo pSC101, um pequeno círculo extracromossômico de DNA de dupla fita, natural da bactéria E. coli, portador de um gene que confere resistên- cia ao antibiótico tetraciclina. COHEN et al. “ utilizaram esse plasmídeo, porque ele continha apenas um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição EcoRI e, consequentemente, após digestão por esta enzima, é convertido numa molécula linear, dotada de extremidades coesivas do tipo EcoRI. Quando essa molécula de DNA linearizada foi posta em pre- sença de diferentes fragmentos de DNA de outra procedência, porém tam- bém obtidos por digestão pela EcoRI, e esta mistura submetida à ação da DNA ligase, formaram-se diferentes plasmídeos híbridos. Cada um des- ses continha um ou mais pedaços do DNA estrangeiro inseridos no sítio de EcoRI do plasmídeo recircularizado e se mostraram capazes de trans- formar uma linhagem selvagem da bactéria E. coli, sensível ao antibiótico, numa linhagem resistente ao antibiótico. A partir dos plasmídeos naturais de bactérias, foram a seguir deriva- dos novos plasmídeos, mais adequados para servir como vetores de clo- nagem. O mais conhecido desses plasmídeos artificiais é o pBR322º, um pequeno plasmídeo multicópias, de 4.363bp, construído a partir de frag- mentos provenientes de vários plasmídeos naturais de E. coli (Fig. 4.4). À sua origem de replicação provém do plasmídeo ColE1, cujo número de có- pias por célula é normalmente 15, mas que pode ainda ser amplificado até 3.000 cópias /célula, através da adição de cloranfenicol à cultura. Ocorre que a replicação desse tipo de plasmídeo está sob controle dito relaxado, de tal modo que, embora a maquinaria de replicação de DNA e de síntese pro- téica da célula hospedeira seja inibida pelo cloranfenicol, a replicação do plasmídeo ainda continua por várias horas após a adição da droga. Além da origem de replicação do plasmídeo ColE1, o plasmídeo pBR322 contém 2 marcadores de seleção, Amp" e Tet” (genes de resistência à ampicilina e te- traciclina), e apresenta 39 sítios únicos de reconhecimento para diferentes enzimas de restrição, alguns dos quais situados inclusive dentro destes marcadores. Figura 4.4 - Plesmíceose 2 genes marcadores, 4 te, Estão indicados aleusss a direção de transcrição ds Como se pod serção do DNA esa a bactéria transíom nas à tetraciclina, D Como as células nã tinguir de imediata) meio completo ad células transforma daquelas transíorms não ocorreu inse aos dois antibióticos acarretando um fe dois genes de pBR322 um insirus ormente, foram co sempenhar o papel pUCI8 contém um 3 amente incor- conter algum detectável encia a drogas. , poderão e sido infec- e plasmídeo, = a enzima de esta enzima, é coesivas do posta em pre- . porém tam- da à ação da Cada um des- idos no sítio É »o antibiótico, seguir deriva- estores de clo- PBR322º, um partir de frag- E (Fig. 4.4). A múmero de có- amplificado até tura. Ocorre ro relaxado, de de síntese pro- “a replicação do da droga. Além 2BR322 contém ampicilina e te- para diferentes dentro destes Vetores genéticos: as moléculas de DNA que veiculam a propagação dos fragmentos 123 Clal AatW ssp| Bam HI Sph! “sera Sail (4363 bp) 44868 br) Eagl Nrul Bsml AfiuL Nde | Sapl Pyult Th Figura 4.4 — Plasmídeo pBR322. Molécula circular de DNA de dupla fila, contendo uma origem de replicação (ori) e 2 genes marcadores, Amprº e Tet?, que conferem resistência aos antibióticos ampicilina e tetraciclina, respeclivamen- te, Estão indicados alguns dos sítios únicos de reconhecimento para diferentes enzimas de restrição. As flechas indicam a direção de transcrição dos genes marcadores, Como se pode observar pela Fig. 4.4, se utilizarmos o sítio Pstl para a in- serção do DNA estrangeiro, o gene Amp" ficará inativado e, consequentemente, a bactéria transformada por este plasmídeo recombinante ficará resistente ape- nas à tetraciclina, porém continuará sensível à ampicilina (fenótipo Ampí Tet9. Como as células não transformadas tem fenótipo Amp” Tet, será possível dis- tinguir de imediato, num teste em placa de Petri (basta semear as células sobre meio completo adicionado do antibiótico), as células não transformadas das células transformadas pelo plasmídeo recombinante e, ainda mais importante, daquelas transformadas por um plasmídeo não recombinante, ou seja, em que não ocorreu inserção do fragmento estrangeiro: Essas últimas serão resistentes aos dois antibióticos (Amp" Tet. A possibilidade de tal inativação insercional, acarretando um fenótipo facilmente reconhecível, que resulta da presença de dois genes de resistência contendo sítios de clonagem diferentes, fez do pBR322 um instrumento extremamente útil em Engenharia Genética. Posteri- ormente, foram construídos plasmídeos ainda mais aperfeiçoados para de- sempenhar o papel de vetores de E. coli, Assim, por exemplo, o plasmídeo pUCI8 contém um grande número de sítios únicos para diferentes enzimas de a de polylin- a inserção de acarretar a ina- m=io contendo o emombinante po- ração azul para , consiste na emidades gera- sítios para de clonagem Esses siste- as híbridas, dos para trans- puderam ser asbda, do qual do ciclo lítico, abordagem Emsão será peque- » geradas partí- contenha um região ausente das técnicas que Dbtém-se dessa D que aumenta sSormação utili- em, o dos plas- de vetores ar- quais foram fos sítios cos), beca da partícula. bactéria sob a cotados in vitro, o que, como já deos continuam Vetores genéticos: as moléculas de DINA que veiculam a propagação dos fragmentos 125 sujeitos à limitação de tamanho imposta pela cabeça da partícula, mas permi- tem que seja empacotada uma quantidade muito maior de DNA estrangeiro (até 45 kb), uma vez que tiveram removida praticamente a totalidade do geno- ma fágico. Em relação aos plasmídeos, os cosmídeos apresentam a vantagem de que o DNA pode ser acondicionado em partículas de fago, que são muito mais estáveis, permitindo que o DNA seja conservado por períodos de tempo mais longos, Existem ainda vários outros vetores, derivados do lambda e de diferentes bacteriófagos, porém a sua descrição foge ao escopo deste capítulo. São dignos de nota os vetores derivados de fagos de DNA de fita simples, como é o caso do fago M13 de E. coli, porque facilitam grandemente certas eta- pas de manipulação genética. Assim, por exemplo, o sequenciamento de DNA, a mutagênese in vitro e certos métodos de preparação de sondas reque- rem DNA de fita simples, como veremos adiante. No caso de organismos eucarióticos, conhecem-se alguns poucos plas- mídeos naturais”, como, por exemplo, o plasmídeo de 2um da levedura Saccharomyces cerevisiae, do qual se obteve a origem de replicação para a construção da maioria dos vetores da levedura. Para outros organismos, em- pregam-se vírus como vetores de clonagem, como é o caso de vírus de mamí- feros e de insetos. Também foram construídos vetores-ponte ou bifuncionais, que contêm origens de replicação e marcadores de seleção compatíveis com dois sistemas hospedeiros diferentes. Na verdade, a maioria dos vetores construídos para diferentes células eucarióticas consiste de vetores bifuncionais, capazes de transformar tanto a célula eucariótica em questão quanto a bactéria E. coli. Essa estratégia é interessante, porque permite que sejam aproveitadas as van- tagens dos dois sistemas hospedeiros. Assim, por exemplo, embora a levedura também seja um microrganismo, ainda é muito mais cômodo realizar alguns dos passos da manipulação em E. coli como, por exemplo, a amplificação e ex- tração do DNA plasmidial, o que se pode realizar com grande facilidade quando se utiliza um vetor bifuncional. Quando se trabalha com genomas de eucariotos superiores, é necessário clonar fragmentos grandes de DNA. Para acomodar tais fragmentos, foi de- senvolvido um tipo especial de plasmídeo de levedura, chamado YAC (Yeast Artificial Chromosome), que é capaz de aceitar inserções de -300 kb, ou seja, 10 vezes mais DNA do que aceitam os plasmídeos bacterianos. O YAC contém todos os elementos de um verdadeiro cromossomo (origem de replicação, cen- trômero, 2 telômeros, além dos genes marcadores) e é portanto mitoticamente estável após a inserção de fragmentos grandes. Em resumo, são as seguintes as caraterísticas que deveter o plasmídeo, para ser utilizado como vetor de clonagem: 126 Elementos de engenharia genética a) Ter baixo peso molecular. Permite que o vetor seja facilmente isolado intacto. b) Apresentar pelo menos um sítio único para uma determinada enzima de restrição (sítio de clonagem). Permite que o vetor seja clivado num só ponto, onde será inserido o DNA estrangeiro. Evidentemente, a presença de vários sítios únicos para diferentes enzimas de restrição é altamente desejável. c) Ser portador de uma origem de replicação compatível com o sis- tema hospedeiro. Permite que o vetor se perpetue entre a descendência da célula ini- cialmente transformada, originando um clone molecular. d) Conter pelo menos um gene marcador. Permite a seleção dos clones transformantes dentre um grande nú- mero de células submetidas ao processo de transformação. e) Ter controle relaxado de replicação. Permite que o DNA do plasmídeo seja amplificado, possibilitando a obtenção de quantidades ainda mais significativas do gene es- trangeiro. f) Não ser um plasmídeo conjugativo. Trata-se de uma medida de segurança, visando evitar a dissemina- ção do DNA recombinante fora do laboratório. 4.4 - Construção da molécula de DNA recombinante: diferentes estratégias Há casos em que não é possível empregar enzimas de restrição para a clonagem. O principal problema advém do fato de que pode haver sítios sus- cetíveis à ação da enzima dentro da segiiência gênica que se quer clonar, sen- do portanto grande a probabilidade de se incorrer na inativação do gene. Para contornar esse problema, procede-se à fragmentação mecânica do DNA, que gera quebras ao acaso, garantindo que pelo menos algumas das moléculas não sejam quebradas dentro do gene de interesse. Essa coleção de fragmentos ale- atórios é mais representativa do genoma e essa abordagem foi portanto bas- tante utilizada para a construção de bibliotecas genômicas dos mais diversos organismos. Entretanto, não é evidentemente possível obter extremidades co- esivas através desse procedimento. Além disso, o emprego, seja de genes sin- téticos, seja de cDNA (ver adiante), tampouco fornece extremidades coesivas. Nesses casos, uma alternativa consiste no emprego da enzima transfera- se terminal. Diferentemente das demais DNA-polimerases, a transferase ter- minal, encontrada & deos às extremig de DNA-molde. Es nética”, Por esse p liméricas, podem nucleotídeo (por e cerca de 100 resid midades do DN. diferentes mol através de suas exb Figura 4.5 — Método cases vitro, extensões poli-dá aos ar-se e, por adição de DM vez de extensões poli-cáes dos forem dCTP e di 128 Flementos ce engenbaria genética Uma vantagem desse método é que não há possibilidade de o vetor voltar à forma original; só irão recircularizar-se os plasmídeos contendo a inserção e, consequentemente, todas as células transformadas conterão o DNA recombinante. Também é preciso considerar que, quando se trabalha com extremidades coesivas geradas por uma enzima de restrição, além de outras reações parasitas, diferentes fragmentos do DNA a ser clonado podem ligar-se entre si, de modo que teremos representada, no plasmídeo recombi- nante, uma situação diferente daquela do genoma original: sequências que não eram contíguas no genoma original poderão ficar contíguas no plasmí- deo. A aplicação do método das extensões homopoliméricas evita esse tipo de artefato. Entretanto, a desvantagem é que esse procedimento introduz longas regiões de pares poli(dA)-poli(dT) nas junções entre as duas espécies de DNA, o que pode afetar a função gênica. Outra desvantagem é que haverá di- ficuldades em se remover do vetor o fragmento de interesse, em etapas sub- sequentes da clonagem. Hoje dispõem-se de outros métodos, que consistem em se recorrer a “ligadores”, sintetizados quimicamente, constituídos de oli- gonucleotídeos contendo a sequência de reconhecimento de uma determina- da enzima de restrição. Tais ligadores são adicionados, por ação da enzima DNA ligase de T4 às extremidades do DNA que se quer clonar e, tratando-se em seguida este DNA com a enzima de restrição em questão, serão originadas as extremidades correspondentes. Uma das vantagens dessa estratégia é que o DNA inserido pode depois ser removido do vetor, através do tratamento com aquela determinada enzima de restrição. Hoje encontram-se disponíveis no mercado ligadores sintéticos desse tipo, para qualquer enzima de restrição, de modo que é possível inserir qualquer fragmento estrangeiro em qualquer sítio do vetor. A técnica da PCR (ver abaixo) também permite que se criem as ex- tremidades desejadas no fragmento de DNA a ser amplificado. Quando se realiza uma reação de ligação entre moléculas de DNA di- geridas por uma mesma enzima de restrição, a inserção do fragmento hete- rólogo pode ocorrer em qualquer uma das duas orientações em relação ao vetor. Em certos casos, isso não tem importância, mas, em outros, necessi- ta-se da entrada do fragmento apenas numa determinada orientação. Para obter a inserção na orientação correta, pode-se lançar mão do uso de duas diferentes enzimas de restrição, que produzam diferentes extremidades coe- sivas (extremidades A e B). Como somente duas extremidades A ou duas ex- tremidades B vão poder se ligar, a entrada do fragmento no vetor também aberto por essas mesmas duas enzimas de restrição, vai ocorrer somente numa das orientações. Essa abordagem também apresenta a vantagem de que o vetor não poderá se recircularizar sem inserção. O material genético a ser clonado pode ser obtido, seja diretamente a partir do genoma de outro organismo, seja por meio de síntese in vitro. Além disso, quando se conhece a segiiência de aminoácidos da proteína (casos pou- co frequentes), é possível deduzir a sequência de DNA que a codifica e obter o gene através de sim polipeptídeos e foi pequeno hormônia, meiros sucessos da Entretanto, = terminado gene cs (cDNA). Sabe-se q nes partidos”, isto presença de introms resultar em segu&: RNA mensageiro teína. Assim, quam nagem fica grandes cDNA in vitro, pos de sintetizar um D cando o procedim uma segiência p cos. À Fig. 4.6 mes Quando não trução de uma coleg determinado orgaml co, ou genoteca, d ganismo, de modo & ser conseguido pos uma digestão apess utiliza-se uma enzê enzima Sau3A, que em que não consã parcial, nem todas as tíveis à enzima e alo mentos. Com essa & plasmídeos híbrida de clones necessária nho do genoma dos tor, serão neces: E. coli, 4.600 clones mente, o número de] dos fragmentos: que cessários. Consegiãs rem-se vetores que Uma outra abordas do mRNA total de representa apenas 8, mento da vida da es preender a busca do 8 de o vetor sos contendo a conterão o deo recombi- ências que no plasmí- mta esse tipo de niroduz longas s espécies de gue haverá di- em etapas sub- que consistem ídos de oli- a determina- = =, tratando-se ão originadas atégia é que o sstamento com eisponíveis no de restrição, de qualquer sítio E se criem as ex- de DNA di- zgmento hete- em relação ao Euiros, necessi- entação. Para do uso de duas midades coe- =s & ou duas ex- =» vetor também = somente numa de que o vetor Ja diretamente a in vitro. Além sina (casos pou- godifica e obter o ula de DNA recombinante: diferentes estratégias 129 gene através de síntese química. Essa última abordagem só é viável no caso de polipeptídeos e foi empregada para a clonagem do gene da somatostatina, um pequeno hormônio de apenas 14 aminoácidos, tendo constituído um dos pri- meiros sucessos da Engenharia Genética”. Entretanto, um dos caminhos mais diretos para o isolamento de um de- terminado gene consiste na clonagem do que se chama de DNA complementar (CDNA). Sabe-se que os genes de eucariotos são, na sua grande maioria, “ge- nes partidos”, isto é, apresentam a sequência codificante interrompida pela presença de introns. Os introns são sequências não codificadoras, que não irão resultar em sequências da proteína que o gene codifica. Em contrapartida, o RNA mensageiro maduro é o molde que será utilizado para a síntese da pro- teína. Assim, quando é possível isolar o mRNA de uma dada proteína, a clo- nagem fica grandemente facilitada. A partir desse mRNA pode-se obter o cDNA in vitro, por ação da enzima transcritase inversa: essa enzima é capaz de sintetizar um DNA de dupla fita a partir de qualquer molécula de RNA, fi- cando o procedimento muito simplificado, quando o RNA for portador de uma seqiiência poli-A no seu terminal 3”, como é o caso dos mRNAs eucarióti- cos. A Fig. 4.6 mostra os passos necessários para a obtenção do cDNA. Quando não se pode dispor do gene isolado, a estratégia consiste na cons- trução de uma coleção de plasmídeos (ou fagos), contendo todos os genes de um determinado organismo. Para obter uma tal biblioteca genômica, ou banco genômi- co, ou genoteca, deve-se proceder à fragmentação do DNA total extraído do or- ganismo, de modo a originar uma coleção de fragmentos aleatórios. Isso pode ser conseguido por meio da fragmentação mecânica do DNA, ou por meio de uma digestão apenas parcial por uma ou mais enzimas de restrição. Em geral, utiliza-se uma enzima de restrição que reconhece uma segiência curta, como a enzima Sau3A, que reconhece uma segiiência de 4 nucleotídeos, sob condições em que não consiga digerir o DNA por completo. Nessas condições de digestão parcial, nem todas as moléculas de DNA serão cortadas em todos os sítios susce- tíveis à enzima e alcança-se portanto uma distribuição quase randômica de frag- mentos. Com essa coleção de fragmentos, pode-se então criar uma coleção de plasmídeos híbridos, representativa do genoma inteiro do organismo. O número de clones necessários para cobrir todo o genoma será diferente, conforme o tama- nho do genoma do organismo. Assim, por exemplo, utilizando lambda como ve- tor, serão necessários 1.500 clones recombinantes para construir uma genoteca de E. coli, 4.600 clones para S. cerevisize e 800.000 clones para mamíferos. Evidente- mente, o número de clones necessários vai também depender do tamanho médio dos fragmentos: quanto maior o tamanho do fragmento, menos clones serão ne- cessários. Conseguentemente, para a construção de bancos genéticos, prefe- rem-se vetores que aceitem fragmentos grandes, tais como cosmídeos ou YAC Uma outra abordagem consiste em se construir uma biblioteca de cDNA, a partir do mRNA total de uma determinada célula. A biblioteca de cDNA, entretanto, representa apenas os genes que estão se expressando naquele determinado mo- mento da vida da célula. Tendo em mãos uma biblioteca genética, pode-se em- preender a busca do gene desejado, como veremos no item 4.7. primer oligo (dT) o, que contém leotídeos [oli- Sgetizar a | .ºfita do emutiizar a enzi- inbrica. Tais interrup- E smtetizar a 2.º fita do & qualquer interrup- de DNA in vi- do genoma. e um impacto tanto necessário ja de DINA recombinante: diferentes estratégias. 31 que se conheçam as sequências (-20bp são suficientes), que ladeiam a seguên- cia de DNA de interesse, para poder primeiramente proceder à síntese quími- ca destes oligonucleotídeos, que irão então servir como iniciadores do processo de polimerização (primers). O primer é necessário porque a DNA-polimerase requer uma pequena região de DNA de dupla fita para inici- ar a síntesc da fita-filha: a grande vantagem é que, quando se utilizam dois primers, só será sintetizada pela DNA -polimerase a região de DNA compre- endida ent?e eles. Em outras palavras, os primers irão limitar a síntese a uma região específica do DNA, o que levará à amplificação apenas desta sequência (Fig. 4.7). O procedimento é bastante simples: uma preparação de DNA, que pode consistir do genoma inteiro do organismo, é primeiramente desnaturada por tratamento térmico, em presença dos dois primers complementares às se- quências que ladeiam a sequência de interesse, em ambas às fitas desnatura- das. Com a presença dos quatro dNTPs precursores e da DNA-polimerase bacteriana no sistema, ocorrerá a síntese da fita simples complementar ao DNA-molde, a partir da extremidade 3'OH de cada primer. Assim, cada ciclo da PCR envolve o seguinte: 1) Desnaturação térmica da dupla fita do DNA-alvo. 2) Resfriamento, para permitir o emparelhamento dos primers com as regiões complementares nas duas fitas desnaturadas do DNA. 3) Extensão dos primers, por ação da DNA-polimerase. A grande vantagem da PCR consiste na possibilidade de se repetir o ciclo inteiro por várias vezes, bastando para isto desnaturar as novas moléculas de DNA dupla fita que vão se formando, em condições de excesso de primers. O re- sultado é um crescimento exponencial da região de interesse, definida pelos dois primers: assim, repetindo-se o ciclo por 25 vezes, obtem-se uma amplificação de até 4x106 da região de interesse. Com a descoberta de DNA-polimerases termor- resistentes, a PCR pôde ser automatizada c, hoje em dia, é possível amplificar se- quências de DNA de até 30 kb, em máquinas pouco onerosas. A técnica da PCR veio revolucionar toda a área da Engenharia Genética, porque permite que se produzam ilimitadas cópias de um segmento específico do DNA, sem ter que recorrer à clonagem. Como mencionado acima, uma vez que são os dois primers que definem o segmento que se quer amplificar, não é necessário isolar este segmento para poder aplicar a PCR. Além disso, a quan- tidade de DNA necessária para começar o processo é muito pequena, sendo suficientes quantidades da ordem de lug de DNA genômico. Tampouco é ne- cessário um alto grau de pureza do DNA, podendo ser empregado diretamen- te DNA obtido a partir da lise celular. A técnica da PCR é extremamente versátil e vem, consequentemente, encontrando inúmeras aplicações, dentre as quais se destacam o diagnóstico de diversas doenças infecciosas, bem como 132 Elementos de engenharia genética DNÁ Segúência alvo original molde o Sielo 1 + primer, dNTPs e y DNA polimerase 2 cópias 3 EEE Ciclo 2 4 cópias 3 [= 3 + Es 52 TT ES ' [= Bcópas yr ET à e | 5 sam +«-———— 5 -—ESoOoO EEE Sequência alvo ES Primer — Fita nova Figura 4.7 - Arcação em cadeia da polimerase (PCR). O DNA co a ser amplificada (barra sólida) é primeiramente desnaturado por elevação da temperatura. Após a separação das 2 fras do DNA-mãe, a DNA-polimerase irá sintetizar 2 novas fitas, (nas direções indicadas pelas flechas), a partir de cada um dos primers (bar- ras não sólidas) e tomando como molde as fitas-mãe, O ciclo de aquecimento-resfriamento é repetido, até que se ob- tenha à ampificação desejada do fragmento de DNA, Deve-se notar que, embora ocorra a síntese de algumas molé- culas mais longas do que a sequência-aivo, estas irão diluir-se ao longo dos ciclos sucessivos « irão portanto predomi nar na população moléculas-filhas apenas da sequência-alvo, ou seja, da sequência contida entre os 2 primers de doenças ge: senvolvimento é técnica de alto pa os (determinação, is), a partir de a que já permitiu = nas e de plantas e lidade dos prim vizinhas à região dispõe de um óbvio que essa di as segiiências 45 — Com os da pressar qualquer leveduras, cos. Vetores apenas transíom sárias para a exp A síntese dal vários passos ms 1) Transcrlg 4) Processams tetizadas, mes atividade bio 5) Além disse não seja degs Evidentemem ausência do prode Para gara especiais, cha elementos gensme célula hospedes mas hospedeiros crever os rega representado um 
