Citogenetica teoria y practica, Manuais, Projetos, Pesquisas de Genética

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CITOGENÉTICA

Teoría y Práctica

Delia Aiassa, Beatriz Bosch,

Natalia Gentile, Fernando Mañas

y Nora Gorla

MANUAL

CITOGENÉTICA Manual Teoría y práctica Delia Aiassa Beatriz Bosch Natalia Gentile Fernando Mañas Nora Gorla Colección Manuales

Citogenética: teoría y práctica: manual / Delia Aiassa... [et.al.]. - 1a ed. - Córdoba: CEPYD, 2015. E-Book. ISBN 978-987-29502-3-

1. Citología. 2. Manual. I. Aiassa, Delia CDD 572.

Fecha de catalogación: 17/03/

Queda hecho el depósito que marca la Ley 11.723 Impreso en Argentina – Printed in Argentina Queda prohibida la reproducción total o parcial del texto de la presente obra en cualquiera de sus formas, electrónico o mecánica sin el consentimiento previo y escrito de los autores.

Imagen de tapa tomada y modificada de http://www.ferato.com/wiki/index.php/Imagen:20080519_mgb_Cromosoma_.jpg

Bibliografía de consulta 78

6 CITOGENÉTICA DE PLANTAS Cromosomas de las plantas Citogenética molecular en plantas Cromosomas B en los vegetales ACTIVIDADES DE COMPRENSIÓN Bibliografía de consulta

79 79 81 82 83 89

7 CITOGENÉTICA ANIMAL Estudios cromosómicos en animales Animales domésticos y citogenética ACTIVIDADES DE COMPRENSIÓN Bibliografía de consulta

90 90 92 94 106

8 CITOGENÉTICA HUMANA Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Especialidades médicas y diagnóstico citogenético Anomalías cromosómicas humanas Normatizaciones para los laboratorios de citogenética ACTIVIDADES DE COMPRENSIÓN Bibliografía de consulta

108 108 110 111 114 122 127

9 CITOGENÉTICA Y CÁNCER Variaciones cromosómicas y neoplasias ANALISIS CITOGENÉTICO ACTIVIDADES DE COMPRENSIÓN Bibliografía de consulta

128 128 134 141 149

10 CITOGENÉTICA APLICADA A LA DETECCIÓN DE DAÑO GENÉTICO La detección de mutágenos y carcinógenos Los ensayos de genotoxicidad ACTIVIDADES DE COMPRENSIÓN Bibliografía de consulta

150 150 157 167 170

INTRODUCCIÓN

Este manual contiene actividades básicas de apoyo para un curso de Citogenética. Al inicio de cada contenido a desarrollar se presenta una breve introducción relacionada con la temática comenzando con la definición de la ciencia y su historia.

El propósito de este material didáctico es el de presentar a los estudiantes universitarios un conjunto de actividades de comprensión que se implementaron y se mejoraron durante el proceso de enseñanza y aprendizaje de la asignatura Citogenética Básica y Aplicada (3133) de las carreras Licenciatura y profesorado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Río Cuarto, desde hace más de cinco años.

(IMAGEN TOMADA de http://es.wikipedia.org/wiki/Friedrich_Miescher)

Historia de la Citogenética

Los cromosomas fueron observados por primera vez en células de plantas por el botánico suizo Karl Wilhelm von Nägeli en 1842 e, independientemente, por el científico belga Edouard Van Beneden en nemátodos del género Ascaris. El uso de drogas basofílicas (p.ej. las anilinas) en las técnicas citológicas para observar el material nuclear fue fundamental para los descubrimientos posteriores.

Aunque la citogenética como disciplina, ha existido desde el 1800, muchos consideran que tuvo su comienzo oficial en 1956 cuando los investigadores Tjio y Levan sugirieron por primera vez que podría haber 46 cromosomas en la especie humana en lugar de los 48 que se creyeron por 30 años. Pero, no fue sólo este conocimiento, sino la manera en que se pudieron ver y contar los cromosomas que se convirtió en el acontecimiento primordial en la citogenética. Lo fue porque, por primera vez, los investigadores habían podido ver los cromosomas como algo diferente a una masa de líneas vermiformes. Hasta se le dio un nombre al milagro: «el milagro hipotónico». En realidad, según Kimberly Hayes, no comenzó siendo un milagro. Comenzó con un error, cuando un auxiliar en el laboratorio del Dr. T. C. Hsu, un citogenetista de renombre mundial, volcó por error una solución salina sobre una muestra provocando que las células, increíblemente y de forma imprevista, se separasen y los cromosomas se hicieran visibles. El descubrimiento realizado por Tjio y Levan (1956) permitió una efectiva separación de los cromosomas y su adhesión al portaobjeto en un único plano óptico.

En esa época el protocolo de Tjio y Levan (colchicina, choque hipotónico, fijación con ácido acético y etanol y coloración con azul de Unna) para poder observar las células en división fue utilizado por los médicos Jérôme Lejeune y Marta Gauthier en París (Francia). Lo notable del caso es que, con este método, lograron obtener metafases increíblemente claras, con cromosomas largos y libres de distorsión mecánica dado que todo el procedimiento se realizaba dentro del tubo de cultivo, lo que evitaba cualquier perturbación celular o producción de artefactos indeseables y, lo cual era sumamente importante, impedir la mezcla de cromosomas provenientes de células vecinas asegurando un recuento e identificación precisos de los cromosomas de cada metafase. Al alcanzar este punto de perfeccionamiento tecnológico, Lejeune dedicó considerable tiempo a establecer con singular precisión el

cariotipo humano de varones y mujeres. Sus inequívocas y admirables imágenes cariológicas lo impulsaron a intentar la identificación de cada par cromosómico. En particular, no existían dudas sobre los pares 1, 2, 3, 9, 16 y el Y, pero la clasificación de los miembros de los pares 4-5, 6-12 inclusive el X, 13-15, 17-18, 19-20 y 21-22, resultaba muchísimo más problemática. No obstante, Lejeune manifestó que "aunque era algo ilusoria la tarea de identificar esos grupos de cromosomas valía la pena esforzarse en diferenciarlos", aconsejando observar detenidamente pequeñas variaciones morfológicas orientadoras.

CARIOTIPO: Cariotipo: Del griego karyon , núcleo y tipos , huella Levitsky (1924) fue el primero en dar una definición a cariotipo como el aspecto fenotípico de los cromosomas somáticos, en contraste con su contenido de genes. Este concepto siguió siendo estudiado con los trabajos de Darlington (1939) y White (1973a y b). El término se utiliza actualmente para el conjunto completo de cromosomas en una especie, un organismo o una célula.

Darlington C.D. 1939. Evolution of genetic systems. Cambridge University Press. 2nd ed, revised and enlarged,

1958. Oliver & Boyd, Edinburgh. Levitsky G.A. 1924. The material basis of heredity. State Publication Office of the Ukraine, Kiev. [in Russian] White M.J.D. 1973a. Animal cytology and evolution. 3rd ed, Cambridge University Press. White M.J.D. 1973b. The chromosomes. 6th ed, Chapman & Hall, London.

La minuciosa y exacta clasificación usada por Lejeune fue reiteradamente rebatida por muchos autores de aquella época. Es absolutamente sorprendente, en el contexto actual, la extensa polémica (122 páginas) que originó una de las presentaciones de Lejeune controvertida particularmente por Klaus Patau, el descubridor de la trisomía 13. Durante la mencionada presentación, Lejeune expuso un nuevo método para identificar en particular cada par del grupo 6-12 cuyos pares carecían de marcadores cromosómicos especiales (a excepción del par Nº 9 que porta una constricción secundaria muy clara) empleando la longitud relativa y el índice centromérico. Lejeune empleó una técnica fotográfica de desenfoque de los puntos obtenidos pensando que las áreas de mayor concentración de dichos puntos representaban las localizaciones medias correspondientes a cada par inclusive el X. Aunque algunos de los fundamentos matemáticos que Patau empleó para oponerse a los puntos de vista de Lejeune eran en parte ciertos, debe señalarse que sus errores de apreciación se originaron principalmente por el empleo de cromosomas sumamente acortados debido al uso de dosis elevadas de colcemid (una colchicina sintética sumamente activa), lo cual le impedía detectar pequeñas variaciones morfológicas existentes entre los distintos pares cromosómicos. Era claro que en ese tiempo dos "escuelas citogenéticas" (la francesa y la anglosajona) se oponían generando encendidas polémicas.

pulmón. ¿Cuál es la probable relación entre una temprana mutación en p53 y el desarrollo de cáncer de pulmón?

2. La Mitosis

a) ¿Cuál es el significado biológico de la Mitosis?

b) ¿En qué etapa de la mitosis, los cromosomas comienzan a volverse visibles en el microscopio?

c) ¿Cuál es la alteración más frecuente que puede ocurrir en la división mitótica?

3. La Meiosis

a) ¿Cuál es el significado biológico de la Meiosis?

b) ¿Cuáles son las diferencias entre la segregación de cromosomas meiótica y mitótica?

c) ¿Cuáles son los modelos de organización de los cromosomas en la meiosis?

4. Teoría cromosómica de la herencia

a) ¿Cuáles son los postulados de la Teoría cromosómica de la herencia? ¿quién fue el científico que la enuncia? ¿en qué año?

b) ¿Cuáles son los aportes de las investigaciones de Walter Sutton en 1902?

c) ¿Cómo se hereda el material genético? Patrones de herencia clásicos y no clásicos.

Bibliografía de consulta:

1. Brown T. 2008. Genomas. 3ª edición. Editorial Médica Panamericana.
2. Griffith A., W. Gelbart, J. Miller y R. Lewontin 2000. Genética Moderna. McGraw-Hill- Interamericana.Griffiths A., Wessler S., Lewontin R., Carroll S. 2008. Genética 9ª edición en español. Editorial McGraw-Hill.
3. Griffiths A., S. Wessler, R. Lewontin y S. Carroll. 2008. Genética 9ª edición en español. Editorial McGraw-Hill. Pierce B. 2005. Genética. Un enfoque Conceptual. 2ª edición en español. Editorial Médica Panamericana.
4. Klug W., M. Cummings y C. Spencer. 2006. Conceptos de Genética. 8ª edición. Editorial Pearson-Prentice Hall.

En la morfología cromosómica dos estructuras son funcionalmente muy importantes: los telómeros y los centrómeros:

Los telómeros cumplen importantes funciones en la replicación del cromosoma y mantenimiento de la proliferación celular, ayudan a prevenir la proliferación ilimitada, están formados por 100 a 1.000 repeticiones de una simple secuencia que contiene grupos de residuos G (en los seres humanos AGGGTT), cada división celular los telómeros se acortan 50 a 100 nucleótidos, la enzima telomerasa mantiene la longitud de los mismos. Los centrómeros dirigen el movimiento de los cromosomas durante las divisiones celulares. Están “incrustados” en la heterocromatina, están formados por secuencias de ADN satélite (ricas en AT) repetidas miles de veces. Las proteínas se unen en los mismos para formar el cinetocoro formando el sitio de unión a los microtúbulos del huso celular.

Mecanismos de determinación sexual y cromosomas sexuales En la naturaleza encontramos al menos dos mecanismos de determinación sexual:

• Determinación genética del sexo (GSD- sigla de “Genetic Sex Determination”)
• Determinación ambiental del sexo (ESD- sigla de “Environmental Sex Determination”)

La determinación genética del sexo es el mecanismo por el cual uno o varios genes ubicados en cromosomas sexuales o no, determinan que el embrión se desarrolle como macho o hembra. En la determinación ambiental, el ambiente tiene una enorme influencia en la determinación del sexo, principalmente dependiente de la temperatura. En algunos reptiles, como todos los cocodrilos, la mayoría de las tortugas y algunos lagartos, la determinación del sexo se consigue de acuerdo con la temperatura de incubación de los huevos durante un período crítico en el desarrollo embrionario.

Determinación genética del sexo En la determinación genética pueden encontrarse heterogamia, arrenotoquia (haplo-diplodía) o determinación polifactorial (poligénica).

En la determinación sexual por Heterogamia existen cromosomas heteromorfos, es decir los cromosomas sexuales difieren en ambos sexos. Pueden ser machos XY y por lo tanto con heterogamia masculina o hembras ZW y en ese caso existe heterogamia femenina. Los

cromosomas sexuales heteromorfos definen la determinación sexual, la cual es determinada en la concepción. También se observa heterogamia masculina en el sistema determinado por la proporción de cromosomas X respecto de la dotación de cromosomas autosómicos.

En la haplo-diploidía los machos se originan a partir de huevos no fertilizados y las hembras de huevos fertilizados. La determinación sexual puede ser ambiental (basada en la fertilización) o puede ser genotípica (basada en el nivel de ploidía u otro).

En la determinación del sexo Polifactorial el sexo se determina en el cigoto por efecto acumulado de muchos factores con efectos individuales pequeños, pudiendo influir también el ambiente. Este sistema de determinación del sexo se puede observar en peces.

Historia de los cromosomas heteromorfos En 1891 el biólogo alemán Henking observó que algunas células espermáticas de algunos himenópteros tenían 12 cromosomas mientras otras tenían 11. A este misterioso elemento nro. 12, que era diferente del resto, lo llamó “elemento X”, para destacar su naturaleza desconocida. Mc Clung amplió estos estudios a arácnidos, roedores y ortópteros y en 1902 comunicó, avalado por su discípulo Sutton, que este “cromosoma X” estaría involucrado funcionalmente en la determinación del sexo. Hasta el presente se conocen los siguientes cromosomas sexuales y mecanismos de determinación sexual con cromosomas heteromorfos (Tabla I):

Tabla I. Sistemas de determinación sexual con cromosomas heteromorfos

Cromosomas sexuales Presentes en: Sistema de determinación sexual Machos Hembras X e Y Humanos, otros mamíferos. Hemíptera. XY XX Z y W Numerosas aves, invertebrados (lepidoptera, trichoptera, crustacea, trematoda). Algunos reptiles, anfibios y peces

ZZ ZW

Balance X/Autosómicos

Diptera ( Drosophila sp .) (^) X/2A XY/2ª

3X/3A 2X/2ª

X e Y Z y W (cromosomas sexuales múltiples)

Algunos mamíferos, y reptiles (^) X 1 X 2 Y 1 Y 2 X 1 X 1 X 2 X 2 ZZZ ZZWW, ZWW, y variantes

En función de la localización de los genes en las distintas regiones de estos cromosomas se conoce la herencia Ligada al X y herencia ligada al Y.

En los Homo sapiens , el cromosoma Y determina la masculinidad. Los cariotipos Klinefelter (47,XXY y variantes) y Turner (45,X y variantes) y sus correspondientes fenotipos sexuales masculino y femenino respectivamente, permiten concluir que el cromosoma Y determina la masculinidad. En su ausencia el sexo del individuo es femenino, incluso si sólo se encuentra un cromosoma X. La presencia del cromosoma Y en los hombres con síndrome de Klinefelter es suficiente para determinar la masculinidad, aun cuando no se complete el desarrollo masculino. Igualmente, en el caso de las mujeres con síndrome de Turner, no se produce la masculinización.

En la región del cromosoma Y que determina el sexo (SRY) un producto génico: el factor de la determinación testicular (TDF) obliga al tejido indiferenciado gonadal del embrión a formar testículos. En la especie humana, se estima que también otros genes autosómicos forman parte de una cascada de expresión génica iniciada por SRY, como los genes SOX9, WT1, SF1, entre los más estudiados.

Sistema ZZ/ZW Este sistema está presente en aves, algunos insectos, algunos reptiles, algunos anfibios y peces, y al menos en una planta ( Fragaria orientalis ). En el caso de los animales las hembras son ZW heterogaméticas y los machos son ZZ homogaméticos. Los óvulos de la hembra son los que determinan el sexo. En función de la localización de los genes en las distintas regiones de estos cromosomas se habla de herencia Ligada al Z y herencia ligada al W. En algunos reptiles (ej: “serpientes”) que presentan la forma ZZ/ZW, es imposible distinguir un cromosoma sexual de cualquier otro en ambos sexos. También en este grupo se encuentran ambos sistemas XX/XY y ZZ/ZW, dependiendo de la especie.

El gen DMTR1 del cromosoma Z estaría involucrado en la determinación sexual de las aves. Las aves Gallus gallus tienen dos copias del gen DNRT1 que está localizado en el cromosoma Z. En mamíferos está localizado en el cromosoma 9 y también es necesario para el desarrollo testicular aún en presencia del gen SRY.

En la Figura 3 se observa la escasa diferencia de tamaño entre los cromosomas Z y W comparados con los cromosomas sexuales de la figura 2.

Fig. 3. Cromosomas sexuales de tres especies de serpientes. IMAGEN TOMADA de PNAS (2006).

Sistema determinado por la proporción de cromosomas X respecto de la dotación de cromosomas autosómicos

En algunos dípteros, como en Drosophila, que posee cromosoma Y, la determinación del sexo cromosómico está dada por los cromosomas sexuales y además por los cromosomas autosómicos. El nemátodo Caenorhabditis elegans (Figura 4) también presenta este tipo de determinación cromosómica del sexo, aunque carece de cromosoma Y.

Fig. 4. Caenorhabditis elegans IMAGEN TOMADA de http://cims.nyu.edu/~binliu/hobbies.html

Este sistema fue descubierto en 1906 por E Wilson en el insecto Protenor , las hembras son 2n= 14 y homogaméticas, los machos son 2n= 13 y producen gametas con 6 y 7 cromosomas. La fecundación por un espermatozoide que lleva el cromosoma X da descendencia femenina. Y la fecundación por un espermatozoide sin cromosoma X da lugar a descendencia masculina.

Al igual que en el sistema XY el sexo de la descendencia es determinado por el macho. Este aporta un cromosoma X para las hembras y ninguno para los machos.

Todos los Himenópteros son haplodiploides esto es, los machos son haploides y las hembras diploides. Los machos se desarrollan a partir de huevos sin fecundar , y tienen sólo una copia de cada cromosoma; las hembras se desarrollan de huevos fecundados y tienen dos copias de cada cromosoma. El himenóptero Apis mellifera (Figura 5 ) tiene 32 cromosomas. La descendencia de una reina, que nacen de óvulos fecundados, son las obreras con 32 cromosomas. La que nace de óvulos sin fecundar, son los zánganos con 16 cromosomas. Fig. 5. Apis mellifera IMAGEN TOMADA de http://www.duke.edu/~jspippen/hymenoptera/apis.htm

Determinación Ambiental del sexo. Además de la temperatura como factor ambiental más difundido en la determinación del sexo, existen otros factores predisponentes que se observan en invertebrados. Los invertebrados presentan una alta diversidad de mecanismos de determinación del sexo, incluyendo tanto determinación genética del sexo (GSD) como determinación ambiental del sexo (ESD) que se presentan en la Tabla III.

Tabla III: Mecanismos de determinación sexual ambiental descriptos para invertebrados (Modificada de Cook 2002). Factores predisponentes

HEMBRAS MACHOS Ejemplos Temperatura Alta^ Baja^ Diptera^ (Aedes stimulans) Nivel de nutrición de la madre

Alto Bajo Nematoda Fotoperiodo Corto largo Largo Crustacea, Amphipoda Disponibilidad de pareja

Por omisión Si hay hembras presentes

Echiuroidea

En síntesis, como se ilustra en la Figura 6, los vertebrados exhiben una extraordinaria variabilidad en los sistemas de constitución cromosómica y de determinación sexual.

Fig. 6. Sistemas de determinación cromosómica del sexo y de determinación sexual (Dr. Yoichi Matsuda, Nagoya University, Japón). IMAGEN TOMADA de http://www.bio.nagoya-u.ac.jp/gcoe/english/member/matsuday.html

En marsupiales al igual que los mamíferos placentarios el sistema de determinación sexual más extendido es XX/XY, las aves tienen un sistema ZZ/ZW, los reptiles y anfibios tienen diferentes sistemas, incluyendo la determinación sexual dependiente de la temperatura, y los sistemas XX/XY y ZZ/ZW que difieren en su origen de las aves y de los mamíferos placentarios. Los mapas génicos comparativos entre Homo sapiens y Gallus gallus revelan