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CapÌtulo 5
Cultivo celular
Emanuele Amorim Alves Anna Christina Rosa Guimar„es
11 1. HistÛrico de desenvolvimento da tecnologia de 11 HistÛrico de desenvolvimento da tecnologia deHistÛrico de desenvolvimento da tecnologia deHistÛrico de desenvolvimento da tecnologia deHistÛrico de desenvolvimento da tecnologia de cultura de tecidoscultura de tecidoscultura de tecidoscultura de tecidoscultura de tecidos
1.1. HistÛrico da cultura de cÈlulas
O cultivo de cÈlulas se iniciou no princÌpio do sÈculo XX com Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912. Essa tÈcnica foi desenvolvida como um mÈto- do para estudar o comportamento de cÈlulas animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado. Essa tÈcnica ainda È uma importante ferramenta de pesquisa nos laboratÛrios do mundo inteiro.
Os primeiros experimentos consistiam em cultivo de tecidos fragmenta- dos mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais de onde provi- nham os tecidos. Devido a essa forma de cultivo, durante mais de 50 anos essa tÈcnica foi chamada cultivo de tecidos ñ do inglÍstissue culture ñ, sendo esse termo atualmente usado genericamente para denominar tanto o cultivo de cÈlulas quanto o de tecidos e de Ûrg„os.
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Harrison foi um pioneiro no uso de cultura de cÈlulas. Na Època, ainda havia d˙vidas da din‚mica do desenvolvimento do tecido nervoso, pois so- mente observaÁıes microscÛpicas n„o forneciam informaÁıes sobre esse pro- cesso. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir de cÈlulas nervosas. Para isso ele necessitou observar essas cÈlulas fora do organis- mo para comprovar sua teoria. Mas como seria possÌvel um tecido viver fora do organismo original? Harrison levou em consideraÁ„o as necessidades b·si- cas de uma cÈlula e desenvolveu um experimento no qual ele mimetizou tais condiÁıes. Assim, ele dissecou o tubo medular de um embri„o de sapo e o mergulhou em sua linfa fresca. Esta linfa em instantes se coagulou e, logo em seguida, Harrison selou o frasco com parafina, observando a sua preparaÁ„o ao microscÛpio todos os dias. Uma das vantagens desse experimento era a falta de necessidade de controle de temperatura, j· que os anfÌbios s„o animais cuja temperatura varia com a temperatura ambiente. Harrison teve o cuidado de manter as condiÁıes assÈpticas, e suas consideraÁıes sobre a possibilidade de se manterin vitro cÈlulas vivas por mais de uma semana foram um marco para a cultura de cÈlulas.
Com esse experimento, Harrison confirmou a sua hipÛtese, provando que as fibras nervosas s„o formadas a partir das cÈlulas nervosas. Com isso, muitos outros cientistas passaram a se interessar por esse modelo de experi- mento, introduzindo o uso de cultura de cÈlulas em suas pesquisas.
Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaÁıes obtidas nas observa- Áıes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de cÈlulas cardÌacas de embri„o de galinha para o cultivo. Seus experimentos foram muito importantes, pois com Carrel descobriu-se a necessidade da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos. Essa renovaÁ„o constante de nutrientes em cultivo permi- tiu que as cÈlulas pudessem ser cultivadas por perÌodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison.
Em 1951, George Gey cultivou cÈlulas de tecido tumoral humano estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada atÈ hoje em todo o mundo. O fato
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escolha do meio ideal È um caminho a se seguir para a obtenÁ„o de uma cultura que expresse uma funÁ„o especÌfica.
Apesar disso, ainda existem muitas vantagens no uso de cultura de cÈlulas como modelo experimental. O controle do ambiente, a homogeneidade da amostra, quando comparada ao uso de animais em experimentos, e a economia s„o as principais vantagens dessa tÈcnica. Atualmente, com a implementaÁ„o das Comissıes de …tica de Uso de Animais em Pesquisa (CEUA), a cultura de cÈlulas È o principal modelo alternativo para a substitui- Á„o dos animais em experimentos de pesquisa.
1.2.1. CÈlulas prim·rias, cÈlulas estabelecidas e cÈlulas transformadas Uma cultura prim·ria È estabelecida a partir do crescimento de cÈlulas oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregaÁ„o mec‚nica ou enzim·tica. As cÈlulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagrega- Á„o e aderirem ‡ garrafa formar„o a primeira monocamada de cÈlulas daquele tecido. Essas cÈlulas possuem as caracterÌsticas do tecido de origem, podem crescer em cultura por um determinado perÌodo de tempo e s„o denominadas cÈlulas prim·rias. Essa forma de cultivo È a mais utilizada para estudar o comportamento de determinada cÈlula in vitro devido ‡ presenÁa de suas caracterÌsticas genotÌpicas e fenotÌpicas. As cÈlulas prim·rias que conseguem manter suas caracterÌsticas originais possuem um tempo de vida curto. No organismo, a morte celular È um mecanismo para renovaÁ„o tecidual. Essa morte È programada e n„o causa danos. Esse processo È denominado apoptose. Na apoptose, a cÈlula n„o È rompida, ela simplesmente se ìautodigereî, formando botıes apoptÛticos que s„o degradados. ¿ medida que a cultura È repicada, as cÈlulas com uma maior capacida- de de proliferaÁ„o ir„o predominar na garrafa de cultivo em detrimento das cÈlulas que n„o se adaptaram bem ao cultivo ou que, devido a traumas do processo de desagregaÁ„o, n„o possuem uma taxa normal de proliferaÁ„o.
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Essas cÈlulas ainda n„o perderam as caracterÌsticas do tecido de origem, mas possuem alta proliferaÁ„o. Esse tipo de cÈlula È chamado linhagem celular contÌnua, e È muito utilizado em pesquisa, pois pode ser mantido em cultura por um grande perÌodo de tempo (quando comparado ‡s cÈlulas prim·rias) e ainda guarda grande parte das caracterÌsticas do tecido original. Muitas linha- gens celulares contÌnuas podem ser propagadas sem perder suas caracterÌsticas por atÈ oitenta passagens, alÈm de serem euploides, ou seja, possuem um n˙mero de cromossomos m˙ltiplo do n˙mero original da espÈcie. Essas cÈlulas s„o muito utilizadas em pesquisa e na produÁ„o de vacinas, como È o caso da linhagem MRC-5, oriunda de tecido de pulm„o de feto humano e utilizada na produÁ„o da vacina de rubÈola.
No momento em que as caracterÌsticas genÈticas das cÈlulas s„o modifi- cadas, elas deixam de ser semelhantes morfologica e geneticamente ao tecido original e s„o ent„o chamadas cÈlulas transformadas. Tais cÈlulas podem ser transformadas em cultura utilizando-se subst‚ncias quÌmicas, vÌrus ou agentes fÌsicos como a luz ultravioleta.
A transformaÁ„o celular È uma alteraÁ„o genÈtica que permite mutaÁıes em genes respons·veis pelo controle do ciclo celular (proto-oncogenes e genes supressores de tumor). A mutaÁ„o pode resultar de uma superexpress„o de proto-oncogenes ou da inativaÁ„o de genes supressores de tumor. O principal reflexo dessa mutaÁ„o È a presenÁa da telomerase ativa. Durante a divis„o, a cÈlula perde um pedaÁo da porÁ„o final de seus cromossomos ñ o telÙmero. Esse processo È um tipo de controle para que a cÈlula, ao ìchecar î se h· possibilidade de divis„o (check point), realize apoptose ao perceber que seu DNA est· danificado a ponto de alterar alguma transcriÁ„o. A telomerase repıe o telÙmero perdido permitindo que a cÈlula se divida indefinidamente sem que perca um pedaÁo de seu DNA codante. A proliferaÁ„o exacerbada est· diretamente ligada ao processo de transformaÁ„o.
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carga medeia a produÁ„o de proteÌnas de ades„o e proteoglicanos que ir„o iniciar o processo de ades„o da cÈlula ‡ superfÌcie da garrafa. … a matriz extracelular que interage com a carga negativa da garrafa e, ent„o, as cÈlulas se ligam ‡ matriz por receptores especÌficos. Nas cÈlulas epiteliais ainda h· a interaÁ„o cÈlula ñ cÈlula mediada por molÈculas de ades„o cÈlula ñ cÈlula (CAMs) e pelas caderinas (dependentes de Ca+2).
Quando em cultura, as cÈlulas aderentes se espalham por todo o fundo da garrafa formando o que È chamado monocamada celular.
As cÈlulas n„o aderentes podem ser cultivadas em suspens„o no meio e s„o derivadas de tecidos que n„o necessitam de ancoragem para proliferar e sobreviver. Essa capacidade est· restrita ‡s cÈlulas hematopoiÈticas, ‡s linhagens transformadas ou ‡s cÈlulas de tecido tumoral.
Fonte: Fotos cedidas pelo Setor de Cultura de CÈlulas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sa˙de (INCQS), Fiocruz.
Figura 1. Linhagem MA 104 (rim de macaco-verde africano). Linhagem aderente.
Figura 2. Linhagem MM (monocÌtica leucÍmica humana). Li- nhagem n„o aderente.
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- BiosseguranÁa aplicada a laboratÛrios2. BiosseguranÁa aplicada a laboratÛrios2. BiosseguranÁa aplicada a laboratÛrios 2. BiosseguranÁa aplicada a laboratÛrios2. BiosseguranÁa aplicada a laboratÛrios de cultivo celularde cultivo celularde cultivo celularde cultivo celularde cultivo celular
Como em qualquer atividade laboratorial, antes do inÌcio do cultivo celular, deve-se planejar o trabalho a ser realizado de modo a execut·-lo com seguranÁa.
Deve ser preparado um procedimento com as especificaÁıes das ativida- des realizadas e todo pessoal deve ser orientado sobre os possÌveis riscos e para a necessidade de seguir as especificaÁıes de cada rotina de trabalho, os procedimentos de biosseguranÁa e pr·ticas de seguranÁa.
H·, pelo menos, 24 casos documentados de infecÁ„o em funcion·rios de laboratÛrio que manipulam culturas de cÈlulas prim·rias (por exemplo, cÈlulas de macacoRhesus) nos ˙ltimos 30 anos.
Embora um n˙mero limitado de infecÁıes adquiridas em laboratÛrios tenha sido relatado como resultado da manipulaÁ„o de cÈlulas humanas e de outros primatas, h· um risco significativamente maior em adquirir uma infecÁ„o pelo HIV ou pelo HBV por meio da exposiÁ„o ao sangue humano e a outros lÌquidos corporais.
Os riscos potenciais associados ‡s cÈlulas e tecidos humanos incluem os patÛgenos do sangue HBV e HIV, bem como agentes presentes nos tecidos humanos, comoMycobacterium tuberculosis, que pode estar presente nos tecidos pulmonares.
Outros riscos potenciais aos trabalhadores s„o representados pelo uso de cÈlulas transformadas por agentes virais, como o SV-40, assim como as cÈlulas que carregam material genÈtico viral. As cÈlulas humanas tumorogÍnicas tambÈm podem oferecer riscos potenciais como resultado de uma autoinoculaÁ„o.
AlÈm do risco biolÛgico, um laboratÛrio de cultivo celular possui os riscos:
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As diversas ·reas devem estar funcionalmente distribuÌdas, facilitando o deslocamento de pessoal e o fluxo de materiais, com a menor circulaÁ„o possÌvel nas ·reas de manipulaÁ„o assÈptica das culturas.
A ·rea destinada a manipulaÁıes, onde se localizam as cabines de fluxo, deve ser preferencialmente fechada e muito limpa. Deve-se trabalhar com avental limpo, exclusivo para uso nessa sala.
A superfÌcie das bancadas deve ser imperme·vel ‡ ·gua e resistente a ·cidos, ·lcalis, solventes org‚nicos e a calor moderado. As instalaÁıes devem ser desenhadas de modo a permitir espaÁos entre as bancadas, equipamentos e cabines, que devem permitir f·cil limpeza.
Os equipamentos necess·rios tambÈm dependem das finalidades do laboratÛrio. Em geral, o laboratÛrio necessita de:
- estufa incubadora com atmosfera de CO 2 ;
- autoclave;
- deionizador de ·gua;
- estufa para secagem de material;
- cabine de seguranÁa biolÛgica (c‚mara de fluxo de ar laminar estÈril);
- medidor de pH;
- balanÁa analÌtica;
- geladeira;
- freezer;
- microscÛpio invertido;
- agitador magnÈtico;
- centrÌfuga refrigerada;
- banho-maria;
- bomba de v·cuo.
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Para trabalhos com culturas de cÈlulas, in˙meros instrumentos s„o neces- s·rios, tais como: c‚mara para contagem, pipetador autom·tico, micropipetas, estante para tubos, alÈm de uma variedade de vidrarias e reagentes necess·rios para preparo de meios de cultura e soluÁıes.
As salas devem ser sinalizadas com sÌmbolo universal de risco biolÛgico, com acesso restrito ‡ equipe tÈcnica de apoio.
2.3. Limpeza, desinfecÁ„o e esterilizaÁ„o
A superfÌcie da ·rea de trabalho deve sempre ser limpa, utilizando-se ·lcool a 70% (v/v), uma vez por dia ou apÛs cada atividade. O ·lcool etÌlico a 70% (v/v) È um excelente desinfetante por sua aÁ„o de limpeza ou deter- gente, sendo eficaz tambÈm na reduÁ„o da flora bacteriana da pele. Suas propriedades desidratante e desnaturante de proteÌnas podem ser respons·veis por sua aÁ„o antimicrobiana.
A ·gua sanit·ria comercial (2% a 5% de cloro) È, tambÈm, um bom desinfetante quando diluÌda de 5 a 10 vezes, por ser um agente oxidante e agir sobre os constituintes da membrana, levando os microrganismos ‡ morte.
Todo material aquecido no banho-maria, como meios de cultura e solu- Áıes, deve ter processo prÈvio de assepsia antes de sua introduÁ„o na cabine de seguranÁa biolÛgica. Deve-se, ao retirar o material do banho-maria, remover o excesso de umidade com auxÌlio de uma gaze e posterior limpeza com ·lcool 70% (v/v).
Antes de se iniciarem os procedimentos, a c‚mara interna do fluxo deve ser limpa com gaze embebida em ·lcool etÌlico 70% (v/v). O fluxo de ar, assim como a l‚mpada de ultravioleta devem ser ligados trinta minutos antes do uso. Todo material deve ser limpo com ·lcool etÌlico a 70% (v/v) antes de ser introduzido na c‚mara. ApÛs o tÈrmino dos procedimentos, deve-se realizar a limpeza da c‚mara interna, removendo possÌveis sujidades. Manter o intervalo
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nutritivos ·gar caseÌna de soja (trypticase soy agar-TSA) e ·gar sabouraud 4% de glicose (Sab4).
O laboratÛrio deve possuir um programa rotineiro adequado de contro- le de insetos e roedores. Todas as ·reas que permitam ventilaÁ„o dever„o conter barreiras fÌsicas para impedir a passagem de insetos ou outros animais.
- TÈcnicas/conceitos para cultivo celular3. TÈcnicas/conceitos para cultivo celular3. TÈcnicas/conceitos para cultivo celular 3. TÈcnicas/conceitos para cultivo celular3. TÈcnicas/conceitos para cultivo celular
3.1. Lavagem e preparo do material para cultura de cÈlulas
A vidraria utilizada para cultura de cÈlulas deve ser exclusiva e processa- da separadamente das demais.
A vidraria deve ser lavada imergindo-a em ·gua com detergente neutro a 5%, durante 12 horas, e enxaguando-a 3 a 4 vezes em ·gua comum, e 2 a 3 vezes em ·gua destilada. O material limpo deve apresentar uma pelÌcula unifor- me de lÌquido nas paredes apÛs o ˙ltimo enx·gue. Caso n„o haja a formaÁ„o desta pelÌcula, o material dever· ser submetido a novo processo de lavagem, pois significa que h· traÁos de gordura ou qualquer sujidade no material.
Frascos muitos sujos, com resÌduos aderidos, devem ser lavados com soluÁ„o sulfocrÙmica (soluÁ„o de bicromato de pot·ssio a 3% em ·cido sulf˙- rico concentrado1:9), que requer muito cuidado no uso devido ‡ presenÁa do cromo IV (Cr+4). Muitos materiais necessitam de uma lavagem prÈvia, sob agitaÁ„o durante 5 a 10 minutos, em soluÁ„o detergente.
A secagem do material deve ocorrer em estufa de secagem a 120∞C, por aproximadamente 6 horas. O material limpo e seco n„o deve conter qualquer tipo de resÌduo, mancha, coloraÁ„o e/ou opacidade; caso contr·rio, o material deve ser submetido a um novo processo de lavagem.
A montagem e embalo podem ser realizados com envelopes e/ou bol- sas prÛprios para esterilizaÁ„o, ou ainda material do tipo ìn„o tecidoî. Deve ser evitado o uso de papel Kraft por gerar aerossÛis.
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A esterilizaÁ„o da vidraria em geral È realizada por autoclavaÁ„o sob press„o a 121∞C por 20 minutos. Outros materiais podem ser esterilizados por mais tempo se necess·rio. Toda vidraria estÈril tambÈm deve ser mantida livre de poeira em arm·rios bem fechados. Pipetas graduadas e tubos de centrÌfuga s„o preferencialmente descart·veis.
3.2. ManutenÁ„o das culturas: propagaÁ„o e criopreservaÁ„o
3.2.1. PropagaÁ„o celular Para manter as cÈlulas em cultura È necess·rio utilizar tÈcnicas b·sicas que evitem a morte celular dentro da garrafa de cultivo. As cÈlulas normalmen- te possuem inibiÁ„o por contato e, quando em uma garrafa de cultivo, se a quantidade de cÈlulas exceder um n˙mero tal que impossibilite o crescimento normal da monocamada, as cÈlulas se inibir„o e haver· morte. Assim, È extre- mamente importante que se retire quantidades de cÈlulas periodicamente da garrafa de modo a manter a populaÁ„o sempre com um n˙mero ideal.
O processo de renovaÁ„o de cÈlulas de uma garrafa para outra È chama- do passagem. O n˙mero de passagens se refere ao n˙mero de vezes que essa cultura foi subcultivada. Muitas linhagens contÌnuas s„o capazes de manter as caracterÌsticas iniciais do tecido original com algumas passagens, enquanto as cÈlulas transformadas n„o mantÍm as caracterÌsticas originais e s„o capazes de permanecer em cultura por um grande n˙mero passagens (chegando atÈ virtual- mente ao infinito n˙mero de passagens).
Para as cÈlulas n„o aderentes, o procedimento de passagem se assemelha a uma diluiÁ„o e basta retirar cÈlulas da garrafa de cultivo, adicionando novo meio ao seu lugar. Isso ocorre porque estas cÈlulas se encontram em suspens„o no meio, sendo possÌvel retir·-las sem que seja necess·rio um procedimento especÌfico.
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Figura 3. Ades„o celular medida por proteÌnas de ades„o.
Os mÈtodos de dissociaÁ„o celular s„o classificados em mec‚nicos ou enzim·ticos. No mec‚nico ocorre a desagregaÁ„o da monocamada fisicamente com a ajuda dorubber policeman, um dispositivo semelhante a um rodo estÈril que retira as cÈlulas do fundo da garrafa de cultivo. Na desagregaÁ„o enzim·tica ocorre a digest„o das proteÌnas de ades„o por proteases especÌficas ou n„o.
A dissociaÁ„o de tecidos envolve a dissociaÁ„o da matriz e a quebra dos contatos cÈlula ñ cÈlula, sem comprometer a membrana ou danificar a superfÌcie celular.
A dissociaÁ„o mec‚nica È utilizada principalmente para cÈlulas macrof·gicas devido ‡ sua ades„o diferenciada. Esse mÈtodo consiste na retirada das cÈlulas por meio de agentes fÌsicos, o que È muito danoso para as culturas.
A dissociaÁ„o enzim·tica È uma das principais aplicaÁıes das enzimas na cultura de cÈlulas. Proteases s„o necess·rias para romper a matriz extracelular e, assim, obter cÈlulas individualizadas com a finalidade de transferir as culturas para um novo substrato. A enzima proteolÌtica inespecÌfica mais utilizada È a tripsina, que hidrolisa cadeias polipeptÌdicas nos radicais lisil-arginil formando
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terminaÁıes de clivagem, Èster e amida. Essa reaÁ„o desestrutura a matriz, impossibilitando a ligaÁ„o dos receptores da superfÌcie celular, ligados ao citoesqueleto e ‡ matriz, obrigando as cÈlulas a rearrajarem seu citoesqueleto. Devido ‡ inespecificidade da enzima, n„o se deve deixar a cÈlula muito tempo em sua presenÁa, para n„o haver lise celular.
3.2.2. Congelamento Na natureza È muito comum que os indivÌduos se adaptem cada vez mais ao meio ambiente por meio de mutaÁıes genÈticas. Esse procedimento evolutivo descrito por Darwin ocorre em todos os seres vivos e n„o seria diferente pensar que tambÈm ocorreria em cÈlulas cultivadas.
A partir do momento em que uma cÈlula se encontra em uma cultura prim·ria ocorrem adaptaÁıes para o seu estabelecimento como uma linhagem.
CÈlulas em cultura por longos perÌodos acabam perdendo suas caracte- rÌsticas fenotÌpicas, pois apÛs v·rias divisıes, h· grande probabilidade de ocor- rerem alteraÁıes demasiadas em seu DNA.
Manter cÈlulas congeladas significa atrasar, em anos, quaisquer altera- Áıes que poderiam ocorrer quando em cultura. Tais alteraÁıes s„o dispens·veis para os laboratÛrios de cultura de cÈlulas e os grandes bancos mundiais forne- cedores de linhagens.
As cÈlulas em cultura geralmente s„o congeladas em nitrogÍnio lÌquido em uma temperatura de -196∫C. Nessa temperatura, todas as reaÁıes bioquÌ- micas nas cÈlulas ficam paralisadas impedindo qualquer alteraÁ„o na cultura criopreservada.
O procedimento mais utilizado no congelamento celular È o lento. Nesse processo h· diminuiÁ„o da temperatura, vagarosamente acarretando a solidificaÁ„o da ·gua que se encontra no meio de cultura. Isso aumenta a concentraÁ„o de soluto fora da cÈlula e faz com que a ·gua saia atravÈs do processo de osmose. A saÌda da ·gua da cÈlula faz com que ela murche.
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do meio de congelamento. AlÈm disso, suas hidroxilas s„o capazes de se ligar aos oxigÍnios do grupo fosfato dos fosfolipÌdeos de membrana, estabilizando- a no momento do congelamento.
O DMSO È uma molÈcula sem carga real, mas que possui um momento dipolar. Sua aÁ„o est· relacionada ‡ interaÁ„o da molÈcula com as membranas fosfolipÌdicas e com o ambiente externo ‡ membrana. Assim, durante um congelamento, a molÈcula impede fases de transmiss„o dos lipÌdeos de mem- brana que chegam a promover a fus„o de v·rias membranas.
Tanto o DMSO quanto o glicerol s„o tÛxicos para as cÈlulas e devem ser utilizados somente no momento do congelamento, sendo indispens·vel a sua retirada do meio apÛs o descongelamento da cultura.
3.2.3. Descongelamento celular O descongelamento geralmente ocorre de forma r·pida. Simplesmente retira-se a ampola do tanque de nitrogÍnio lÌquido e coloca-se ela em ·gua a 37 ∫C imediatamente.
Figura 5. Esquema de descongelamento lento.
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Apesar de todo o cuidado durante o congelamento, o processo de criopreservaÁ„o È danoso para as cÈlulas e, portanto, apÛs o seu congelamento as cÈlulas devem ser colocadas em meio de cultivo com uma concentraÁ„o de 20% de soro fetal bovino. As cÈlulas aderentes devem ser lavadas apÛs 24 horas de ades„o para a retirada de cÈlulas mortas.
Os procedimentos de congelamento e descongelamento s„o os mesmos para as cÈlulas aderentes e para as n„o aderentes.
3.3. QuantificaÁ„o celular
Quando se trabalha com experimentos que necessitam do uso de cÈlu- las em cultura È necess·ria a avaliaÁ„o constante das cÈlulas. Umas das formas de se avaliar o crescimento celular È utilizando-se mÈtodos de quantificaÁ„o celular. Quantificar uma cultura significa dizer quantas cÈlulas se encontram em determinada garrafa de cultivo.
A quantificaÁ„o È utilizada para definir a viabilidade celular, as condiÁıes de crescimento e o inÌcio de experimentos nos quais o n˙mero de cÈlulas utilizado deve ser preciso.
Existem duas maneiras de se quantificar cÈlulas em cultura. Na forma direta, conta-se diretamente o n˙mero de cÈlulas presente na garrafa de culti- vo; a forma indireta È feita por meio da quantificaÁ„o de determinadas estrutu- ras celulares, como proteÌnas, ou pela mediÁ„o do metabolismo celular.
Como forma de quantificaÁ„o direta, o mÈtodo mais utilizado È a conta- gem em c‚mara de Neubauer. No mÈtodo indireto existem muitas tÈcnicas baseadas no metabolismo celular ou atÈ mesmo na dosagem de macromolÈculas presentes na cÈlula, como as proteÌnas ou o DNA.
Para a contagem em c‚mara de Neubauer, as cÈlulas devem estar total- mente individualizadas. Para cÈlulas aderentes, È necess·rio fazer uma tripsinizaÁ„o prÈvia, o que n„o È feito no caso de cÈlulas n„o aderentes.
