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Scientia Chromatographica 2015; 7(2):125- Instituto Internacional de Cromatografia http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015. ISSN 1984-
PREPARO DE AMOSTRAS
Scientia Chromatographica 2015; 7(2) 125 Resumo As análises toxicológicas forenses caracterizam-se pela investigação de compostos de interesse forense, em especial drogas de abuso, em diversas matrizes biológicas. As características particulares de cada matriz determinam quais técnicas de preparo de amostra são requeridas, ainda, cada qual possui a esta associadas vantagens e limitações, que devem ser observadas pelo analista. São aspectos fundamentais a consideração do intervalo de concentração do analito na amostra, a janela de detecção, a complexidade e o conhecimento de como se dá a distribuição da droga pesquisada na matriz. Já as técnicas de preparo de amostra a serem utilizadas devem ser escolhidas também com base em sua capacidade de pré-concentração do analito, além da disponibilidade de materiais específicos, tempo e custo. O presente artigo visa delinear as principais matrizes biológicas utilizadas em Toxicologia Forense assim como as técnicas, clássicas e recentes, empregadas no preparo dessas amostras. Palavras-chave: toxicologia forense, amostras biológicas, matrizes alternativas, preparo de amostra. Dayanne Cristiane Mozaner Bordin^1 Fernanda F. da Silva Souza Monedeiro^2 Eduardo Geraldo de Campos^2 Marcela Nogueira Rabelo Alves^1 Laís Helena Picolo Bueno^2 Bruno Spinosa de Martinis2* (^1) Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (^2) Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, 14050-140, Brasil *[email protected] Recebido: 18 Ago 2015 Aceito: 08 Set 2015
Técnicas de preparo de amostras biológicas com
interesse forense
Bordin DCM et al. Amostras biológicas com interesse forense
1. Introdução
A Toxicologia Forense, área da toxicologia que se aplica a propósitos legais, apresenta como objetivo principal fornecer respostas às questões que surgem durante investigações criminais. Utiliza como ferramenta as análises toxicológicas, que são requisitadas com a finalidade de se detectar a presença de substâncias exógenas, determinar sua concentração, e, por fim, relacioná-las aos seus efeitos tóxicos no organismo, a fim de se estabelecer se houve ou não a intoxicação que recai sob suspeita. Os resultados gerados por essas análises devem ser inequívocos, e o laudo irrefutável[1]. Técnicas de preparo de amostra aplicadas às análises forenses têm sido amplamente discutidas na literatura. Samanidou et al. (2011) avaliou as diversas técnicas disponíveis em função dos analitos de interesse em Toxicologia Forense. Contudo, é interessante também a discussão incluindo aspectos acerca das principais matrizes biológicas empregadas na área[2]. Diversas amostras biológicas podem ser utilizadas para realização destas análises, dentre elas sangue, urina, cabelo, saliva, suor, mecônio, entre outras. A escolha da matriz depende de uma gama de fatores que se relacionam com a natureza, integridade da amostra submetida à análise, tipo de investigação ( antemortem e postmortem ), facilidade de coleta, e, as considerações analíticas e de ensaio juntamente com a interpretação dos resultados. Desafios específicos podem surgir dependendo da matriz escolhida, como por exemplo, nos casos postmortem as alterações que as amostras sofrem nos processos de autólise, redistribuição e putrefação podem conferir dificuldades adicionais no uso dessas amostras[1,3]. O sangue e a urina são as matrizes convencionais mais prevalentes e utilizadas para realização das análises toxicológicas. No entanto, nas últimas décadas as matrizes biológicas alternativas ou não convencionais têm apresentado relevante importância na toxicologia, principalmente devido às suas vantagens quando comparadas com as amostras convencionais, considerando que possuem características interessantes em relação à estabilidade dos analitos, método de coleta facilitado e maior janela de detecção[3,4]. Os avanços nas áreas de preparo de amostra e as técnicas analíticas modernas foram cruciais para o desenvolvimento das análises toxicológicas forenses, pois possibilitaram a detecção de drogas e seus metabólitos em baixas concentrações em amostras extremamente complexas. As técnicas mais utilizadas são a cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) e a cromatografia em fase líquida acoplada à espectrometria de massas, ou in tandem (LC-MS, LC-MS/MS). Estas técnicas são comumente escolhidas por apresentarem maior sensibilidade, compatibilidade com as concentrações dos compostos de interesse encontradas nas diversas amostras biológicas, e por permitirem a confirmação da presença dos analitos também pela análise do espectro de massas[4-7]. Contudo, toda técnica analítica, por mais seletiva e sensível que seja apresenta limitações, as quais podem ser reduzidas com um preparo de amostra eficiente. O preparo da amostra caracteriza-se pelo processo que visa isolar o analito de interesse a partir da matriz, minimizando e eliminando os interferentes (endógenos e exógenos), além de propiciar a concentração da substância, sendo um processo geralmente indispensável para o emprego de técnicas de detecção e quantificação de substâncias de interesse forense[8-9].
2. Principais matrizes biológicas empregadas
nas análises toxicológicas forenses
Com o desenvolvimento de novas tecnologias na extração de analitos, a utilização de uma variedade de amostras biológicas tornou-se ainda mais acessível e possível. Dentre as matrizes biológicas amplamente utilizadas estão urina, sangue, cabelo, fluido oral, suor, humor vítreo e mecônio. Cada uma destas matrizes será abordada em termos de sua composição, forma como o analito é incorporado e sua utilidade no âmbito das análises forenses, com base nas informações que é capaz de fornecer.
Bordin DCM et al. Amostras biológicas com interesse forense Para a pesquisa de metabólitos conjugados, reações de clivagem hidrolítica são demandadas anteriormente ao processo de extração e nestas podem ser empregadas enzimas, ácidos ou bases. Já a etapa de precipitação proteica envolve a adição de agentes precipitantes, tais como sais, ácidos ou, mais comumente, solventes orgânicos como metanol, acetona ou acetonitrila, geralmente em volumes ao menos duas vezes maior do que da amostra tratada. Neste processo é possível que ocorra baixa recuperação dos analitos devido também aos fenômenos de adsorção e oclusão do composto-alvo, neste caso o analito poderá se encontrar no precipitado. A adição de tampão não só colabora para a obtenção do analito em sua forma apolar nesta amostra, possibilitando sua posterior extração com solvente orgânico, como também contribui para diminuição da viscosidade do meio[1,23]. Com relação à coleta do sangue postmortem requer-se consideração dos fenômenos de redistribuição, os quais participam a distribuição de drogas de órgãos que atuam como reservatórios, o movimento do sangue e outros processos provenientes das alterações cadavéricas[24-26]. O sangue periférico é menos suscetível à redistribuição postmortem de substâncias dos tecidos em que se concentram drogas, dessa forma, avaliar o local de onde o sangue foi coletado é de extrema importância para interpretação dos resultados das análises toxicológicas. O sangue periférico é geralmente obtido da veia femoral, enquanto que o sangue central pode ser coletado das artérias subclávias ou diretamente do coração[27]. No sangue postmortem a atividade de microorganismos, em especial as espécies Escherichia coli e Candida albicans são responsáveis pela formação endógena do etanol, na qual a glicose é o substrato, que, no entanto só é mais significativa nos estágios mais avançados de decomposição[28-30].
2.3. Fluido oral
O fluido oral é uma mistura de células da mucosa bucal, restos de alimentos e saliva, secretada pelas glândulas presentes na mucosa bucal[31]. Um indivíduo saudável, geralmente produz de 500 a 1500 mL de fluido por dia[32]. As drogas são transferidas do sangue para a saliva por ultrafiltração ou difusão passiva, podendo ser detectadas nesta matriz na forma não-metabolizada. Porém, esta incorporação de drogas na saliva é restringida para moléculas de alto peso molecular, drogas ionizadas ou ligadas a proteínas plasmáticas[33-34]. Uma das principais aplicações dessa matriz é sua utilização no monitoramento de condutores no trânsito e na verificação de uso de drogas em ambiente de trabalho[35,36]. As drogas no fluido oral são pesquisadas para exposições mais recentes, dependendo de sua natureza, as substâncias podem ser detectadas até cerca de 2 dias passados da exposição, como é o caso da maconha e anfetaminas. Drogas de caráter básico tendem a ser detectadas em concentrações superiores em comparação com aquelas de caráter ácido[37]. A coleta do fluido oral caracteriza-se por ser de fácil realização no local da abordagem, além de não exigir profissional especializado. A desvantagem, no entanto, é a possibilidade de contaminação por drogas utilizadas por via oral, e o restrito número de estudos que avaliam a interferência dos coletores, adulterantes e exposição passiva[38-42]. Além disso, a coleta é um processo simples, não-invasivo e pode ser monitorado. Pode ser realizada com dispositivos disponíveis comercialmente, como Omni-Sal®, OraSure® e Salivette®, sendo este último constituído de um tubo coletor com tampa, algodão e um orifício em sua base. Quando o algodão é inserido na boca do indivíduo, o fluido oral é absorvido pelo algodão[35]. O desenvolvimento científico tornou as técnicas de extração mais sensíveis e, além disso, o avanço nos procedimentos de preparo de amostras possibilitou a análise de várias drogas de interesse forense no fluido oral, como a cocaína[43], as anfetaminas[44], os opióides[43,45], os canabinóides[46], os benzodiazepínicos[47]^ e o etanol[48]. A coleta de fluido oral é uma ótima alternativa ao teste realizado com o etilômetro, uma vez que permite a identificação simultânea de álcool e outras drogas de
Amostras biológicas com interesse forense Bordin DCM et al. abuso, além de permitir que a amostra seja armazenada e reanalisada, caso haja requisição judicial[49-50]. Existem testes de imunoensaio para drogas de abuso, que podem ser realizados na saliva no local da abordagem. Estes produtos são de fácil utilização e por serem rápidos, os resultados são obtidos em apenas 1 ou 2 minutos. Um resultado positivo no teste de triagem indica o uso de substância psicoativa, o que pode ser confirmado por técnicas mais sensíveis[51].
2.4. Suor
A análise de suor tornou-se uma possibilidade útil em Toxicologia Clínica e Forense, utilizada como matriz biológica alternativa para o monitoramento do uso de drogas[52-54]. O suor é composto por 99% de solução aquosa hipertônica, e outros constituintes como lactato, albumina, gama globulina, ureia, íons de amônio, enzimas e compostos orgânicos[55-57]. Em média, o volume de suor excretado por dia em indivíduos saudáveis varia entre 300 a 700 mL. O pH encontra-se em 5,8[58,59]. As glândulas sudoríparas são amplamente distribuídas através da pele, e são classificadas em dois tipos: apócrinas e écrinas. As glândulas apócrinas são maiores e estão localizados principalmente nas axilas, púbis e mamas. E as glândulas écrinas são mais numerosas e estão presentes nas palmas das mãos, nas plantas dos pés, na face e no peito. A pele também é banhada por secreção sebácea composta de lipídios como colesterol (75%), triglicerídeos e ácidos graxos (20%)[60,61]. As drogas são incorporadas no suor por difusão passiva e migração transdérmica. As características físico-químicas das drogas como massa molecular, pKa, grau de ligação às proteínas plasmáticas e lipofilicidade e o pH influenciam essa incorporação. Maiores concentrações de drogas são encontradas no suor quando comparadas a outras matrizes biológicas alternativas devido à composição dessa matriz[52,55,60]. A coleta do suor é simples, não invasiva, não constrangedora, com menor risco de adulteração e de modo contínuo fornecendo uma ampla janela de detecção (de até 14 dias). Apresenta poucos interferentes exigindo menos etapas no procedimento analítico e no preparo de amostra. As espécies predominantes encontradas no suor são as próprias substâncias utilizadas, ao invés de seus metabólitos[62]. Dentre as desvantagens no uso dessa matriz incluem-se a falta de informações sobre a relação dose-resposta, a quantidade limitada de amostra e a literatura sobre uso dessa matriz é limitada. Além disso, as concentrações encontradas dos analitos são relativamente baixas, exigindo técnicas analíticas com alta sensibilidade e seletividade[60,63]. Para coleta, são utilizados dispositivos próprios para detecção de drogas no suor, aprovados pelo FDA ( Federal Drug Administration) dos Estados Unidos, os “ patches” , constituídos basicamente de material absorvente coberto por camada adesiva, disponíveis comercialmente como PharmChek®[61]. Dentre as drogas de abuso já estudadas e detectadas no suor incluem-se o etanol, as anfetaminas, o fenobarbital, a cocaína, a heroína, a morfina, a fenciclidina, o Ácido Gama Hidroxibutírico (GHB) e a metadona. Ensaios imunoenzimáticos e radioimunoensaios estão descritos na literatura como métodos de triagem para avaliar a presença de drogas em suor. Exames confirmatórios indicados e utilizados são principalmente aqueles empregando as técnicas de GC-MS e LC-MS[2,65].
2.5. Cabelo
O cabelo é uma matriz biológica complexa composta de 65% a 95% de proteína queratina, de 15 a 35% de água, de 1 a 9% de por lipídios e ainda por uma pequena parcela de minerais. Os fios capilares têm origem no conjunto de células hermeticamente ligadas inseridas num centro germinativo denominado matriz, que está localizada na base do folículo capilar, a aproximadamente 3 a 5 mm abaixo da superfície da epiderme. Os folículos capilares localizam-se no interior da pele do couro cabeludo e são circundados por vasos capilares arteriais, assim como glândulas sudoríparas[66].
Amostras biológicas com interesse forense Bordin DCM et al. substâncias. Os principais analitos já detectados nessa matriz são: nicotina, álcool, pesticidas organofosforados e organoclorados, medicamentos, cocaína, opiáceos, anfetaminas, metanfetaminas, ecstasy e maconha[80-82]. O mecônio consiste na primeira excreção do recém-nascido, a sua formação inicia-se a partir do segundo trimestre de gestação (por volta da 12ª semana) e acumulando-se no intestino do feto até o momento do parto, podendo ser excretado em até cinco dias após o nascimento. É uma matriz extremamente complexa, apresenta consistência pegajosa, coloração verde escura a negra e não possui o odor característico, geralmente presente nas fezes. É composto por água, células epiteliais descamadas do trato gastrointestinal e da pele, ácido e sais biliares, entre outros[83-85]. As drogas utilizadas pela mãe durante a gestação são incorporadas no mecônio por dois mecanismos distintos. O primeiro consiste na difusão passiva através dos vasos sanguíneos da placenta para o feto, e os fatores que influenciam esse mecanismo são a massa molecular, o grau de ionização, o grau de ligação a proteínas plasmáticas materna e/ou fetal e a lipofilicidade das drogas e o fluxo sanguíneo para a placenta. O segundo mecanismo trata-se da incorporação das substâncias por deglutição do líquido amniótico: nesse mecanismo as substâncias excretadas pelo feto no líquido amniótico via urinária ou biliar são deglutidas novamente e acumulando-se no intestino e sendo eliminadas após o nascimento através do mecônio. A incorporação e o acúmulo de substâncias nessa matriz são resultantes do consumo, metabolismo e eliminação materna, transferência placentária e metabolismo fetal, fatores estes que tornam o mecônio uma ótima matriz para verificar exposição fetal com ampla janela de detecção gestacional[84,80]. As vantagens do uso do mecônio são a disponibilidade da amostra, coleta fácil e não invasiva, e a capacidade de fornecer informações preservadas sobre a exposição fetal à substâncias a partir do primeiro trimestre de gravidez[85,82]. As desvantagens dessa matriz são a complexidade e heterogeneidade da amostra, o que exige etapas adicionais de preparo, purificação e concentração dos analitos, aumentando o tempo e o custo das análises. No entanto, apesar da sua complexidade, com esta matriz já foram realizados trabalhos pioneiros e empregadas técnicas de preparo de amostra mais inovadoras, como o uso das ponteiras DPX ( Disposable Pipette Tips Extraction ), que auxiliaram na redução de processos envolvidos no seu preparo e permitiram uma análise rápida e sem interferentes dessa amostra[86,87,103]. Métodos de triagem imunoenzimáticos podem ser aplicados a esta matriz, requerendo técnicas de instrumentação analítica para confirmação dos resultados[85].
2.7. Humor vítreo
O humor vítreo é o líquido gelatinoso contido no interior do olho, constituído basicamente por água (cerca de 99%), além de sais e pequena porcentagem de proteína (cerca de 0,2%), especialmente colágeno. Neste fluido são ausentes as esterases, responsáveis pela rápida degradação de substâncias como a cocaína, heroína e 6-acetimorfina. As drogas e toxinas chegariam ao humor vítreo através da passagem pela barreira sangue-retina, por meio de transporte ativo e passivo. Nesta matriz a presença da droga original é predominante em relação aos metabólitos[88-90]. Trata-se de uma matriz de grande interesse nas análises toxicológicas postmortem. Sua importância reside na grande estabilidade diante dos processos de putrefação, uma vez que se encontra alocada no interior da câmara ocular, em ambiente consideravelmente estéril e protegido de traumas, disponível em casos de estado de putrefação ou carbonização parcial do corpo[91-92]. A coleta do humor vítreo pode ser feita por meio de punctura no canto lateral do olho. O volume coletado desta amostra é pequeno, em torno de 2 mL, o que limita o número de ensaios a serem realizados, além disso, drogas com alta afinidade proteica dificilmente são encontradas nesta matriz, é o caso do delta-9-THC e seus metabólitos[93].
Bordin DCM et al. Amostras biológicas com interesse forense Por possuir alto percentual de água, o humor vítreo não requer etapas mais elaboradas de preparo de amostra, sendo uma matriz que apresenta, com relação às técnicas instrumentais, baixo ruído e reduzido efeito de matriz. Considerando os problemas relacionados à formação endógena ao sangue postmortem, o humor vítreo é uma matriz extremamente útil em exames de alcoolemia, considerando a distribuição eficiente do etanol neste fluido, de forma que as concentrações relativas encontradas no sangue periférico e as encontradas no humor vítreo chegam a valores próximos a 1, demonstrando correlação adequada[90,93].
3. Principais técnicas de preparo de amostra
na toxicologia forense
O preparo de amostra é parte crucial do procedimento analítico, pois reduz os interferentes que podem comprometer a seletividade e sensibilidade ao analito de interesse na matriz biológica. Nas análises toxicológicas forenses o aperfeiçoamento de métodos tradicionais para extração de drogas de abuso em amostras biológicas é de extrema importância para otimização da análise. O processo, na maioria das vezes é intensivo, equivalendo a até 80% do tempo total da análise e sujeito a erros em geral. As técnicas de preparo de amostras exigem condições mínimas para serem aplicadas, dentre elas, a perda mínima de amostra com remoção eficaz de interferentes, a alta recuperação do analito, baixos tempo de análise e custo. Atualmente, uma ampla variedade de métodos de preparo de amostras está disponível e muitos desses métodos têm sido empregados em análises toxicológicas de drogas e/ou metabólitos nas amostras biológicas com interesse forense[8,94-96]^ (Tabela 1).
3.1. Precipitação proteica
A precipitação proteica é uma técnica de preparo de amostra simples e rápida. Consiste na desnaturação de proteínas (perda de estrutura terciária) presentes na matriz por adição de agentes precipitantes (ácido ou base fortes, temperatura, ou solventes orgânicos, como acetonitrila, metanol). Após adição do agente a amostra é submetida a agitação e centrifugação, possibilitando a separação do precipitado proteico e o sobrenadante, utilizado para análise toxicológica. Nesse processo não ocorre a extração ou pré-concentração da amostra, consistindo na separação da ligação do analito em questão (droga, metabólito ou biomarcador) com a proteína. Apesar das vantagens citadas, trata-se de um processo realizado manualmente, o que pode aumentar o tempo de preparo para um grande número de amostras[97].
3.2. Extração Líquido-Líquido (Liquid-liquid
extraction, LLE)
A LLE é um dos primeiros métodos de preparo de amostras e baseia-se na partição da amostra entre duas fases imiscíveis (orgânica e aquosa). A eficiência da extração depende da afinidade do analito investigado pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações. O processo envolve a adição do solvente extrator seguida de agitação mecânica para promover o máximo de contato entre as fases orgânica e aquosa. Posteriormente, a mistura é submetida à centrifugação para otimizar a separação entre as fases e então a fase de interesse é recolhida para análise. Atualmente, métodos mais eficientes na extração e concentração dos analitos estão disponíveis. Contudo, devido à sua rapidez, simplicidade e grande número de solventes extratores existente, a LLE ainda é amplamente aplicada em análises toxicológicas. Um dos principais problemas associados a esta técnica analítica é a geração de resíduos de solventes, muitas vezes mais tóxicos do que o próprio analito de interesse, e que pode afetar tanto o analista pela exposição durante o processo, como o meio ambiente pela dificuldade no descarte do mesmo[98,99].
3.3. Salting-out
Essa técnica caracteriza-se pela adição de um sal inorgânico à amostra aquosa e um solvente orgânico miscível em água, formando um sistema bifásico, com o objetivo de auxiliar na separação do solvente orgânico miscível em água, além de melhorar extrações em solventes orgânicos apolares. A eficácia desse procedimento depende das características físico-
Bordin DCM et al. Amostras biológicas com interesse forense recoberta com uma película de material apropriado, com posterior análise direta por técnicas cromatográficas de alta eficiência tais como cromatografia em fase gasosa e cromatografia em fase líquida. A fibra de SPME é introduzida no recipiente contendo a amostra, o protetor da agulha da fibra é retraído e a fibra de sílica é exposta ao meio onde ocorrerá a extração dos analitos. O revestimento polimérico da fibra atua concentrando os analitos por processos de absorção ou adsorção[107]. Vários revestimentos de fibra são disponíveis comercialmente e a escolha é determinada pelas propriedade físico-químicas dos analitos, dentre eles polidimetilsiloxano (analitos apolares), poliacrilato (analitos polares, principalmente fenóis), divinilbenzeno polidimetilsiloxano (analitos polares, principalmente aminas), polidimetilsiloxano carboxen (analitos de baixo peso molecular), carbowax-divinilbenzeno (analitos polares, principalmente álcoois) e divinilbenzeno- carboxen-polidimetilsiloxano (analitos polares e apolares)[112]. O procedimento de extração empregando a SPME pode ser realizado de duas maneiras. A primeira consiste na imersão direta da fibra na amostra mantendo-a sob agitação durante a extração do analito. E a segunda é através da utilização da técnica de headspace , na qual a amostra é aquecida e os componentes voláteis são adsorvidos na fibra. É essencial que as condições para extração em fibra de SPME sejam otimizadas tais como pH, concentração de sal (para efeito de salting-out ), o volume da amostra, tempo e velocidade de agitação da amostra, temperatura e tempo de extração. O espaço livre no frasco de amostra pode influenciar na extração da substância. Após o processo de extração, os analitos concentrados na fibra são dessorvidos termicamente através da introdução da fibra no injetor aquecido de um cromatógrafo em fase gasosa. A dessorção também pode ser realizada por cromatografia em fase líquida, utilizando o próprio solvente da fase móvel. As principais vantagens da técnica são alta sensibilidade, seletividade e precisão, possibilidade de automação e eliminação do uso de solventes. As desvantagens são os elevados custos associados à técnica, fragilidade da fibra e elevado tempo de extração[107-112].
3.8. Micro extração dispersiva líquido-líquido
(Dispersive Liquid-Liquid Microextraction,
DLLME)
A DLLME é uma técnica de extração miniaturizada desenvolvida em 2006 por Rezaee e colaboradores. Baseia-se no equilíbrio de distribuição dos analitos entre a amostra e o solvente extrator. É caracterizada por um sistema de extração ternário, no qual o solvente extrator e o solvente dispersor são rapidamente injetados na amostra aquosa com o auxílio de uma seringa, formando uma solução turva no tubo (amostra aquosa/solvente extrator/solvente dispersor) que é submetida a centrifugação, onde as partículas do solvente extrator são sedimentadas. Essa fase sedimentada é recolhida e submetida à análise toxicológica[113]. As principais vantagens da técnica são simplicidade, rapidez, baixo custo, alta recuperação, uso de volumes reduzidos de solvente orgânico e aplicável a uma ampla gama analitos. No entanto, a desvantagem dessa técnica é a dificuldade de automação, devido à necessidade de etapas de separação de fases e centrifugação[113-115]. A composição de uma matriz biológica e os diferentes processos fisiológicos de incorporação de substâncias associados encontram-se relacionados com a forma química em que o analito se apresenta e as técnicas requeridas para eliminação dos interferentes e pré-concentração deste composto, já os compostos-alvo, em grande parte drogas e toxinas, devem ser conhecidos em função de suas propriedades físico-químicas principalmente com respeito à sua polaridade, faixa de pKa, ponto de ebulição e estabilidade no meio.
Amostras biológicas com interesse forense Bordin DCM et al. Tabela 1. Aplicações das técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense. Amostra Analitos Técnica de extração Limite de detecção Técnica de análise Referência Humor vítreo Opioides, anfetaminas, cocaína e metabólitos Extração em fase sólida com cartucho Trace B® 335 (fase mista) 1-2 ng/mL GC-MS [92] Heroína, morfina e 6- acetilmorfina LLE (acetato de etila: clorofórmio:hexano (7:2:1, v/v/v)) 10-50 ng/mL GC-MS [116] Codeína, morfina, e 6-monoacetilmofina DPX (Fase reversa) 3 ng/mL GC-NPD [117] Cocaína e metabólitos DPX (Fase catiônica) 10 ng/mL GC-MS [118] Sangue Cocaína, delta-9-tetrahidrocanabinol, anfetaminas, e os respectivos metabólitos Extração em fase sólida com cartucho Bond Elut Certify® (fase mista) 5 ng/mL GC-MS [30] Canabinóides sintéticos LLE (clorobutano:isopropanol (90:10, v/v))
0,5-5 ng/mL (limite de quantificação) LC-MS/MS [119] Opioides, cocaína, benzodiazepínicos e metabólitos DLLME (100 μL clorofórmio e 250 μL de metanol) 0,05-2 ng/mL LC-MS/MS [120] Poluentes industriais (orgânicos voláteis) Headspace 0,01-0,05 ng/mL GC-MS [121] Δ9-THC and 11-Nor-Δ9-THC DPX (Fase reversa) 0,01-0,05 ng/mL GC-MS [122] Cabelo Cocaína, cocaetileno e benzoilecgonina Extração em fase sólida com cartucho Phenomenex Strata Screen C 0,1-0,03 ng/mg (limite de quantificação) GC-MS [123] Anfetaminas, cetamina, cocaína, cocaetileno e THC HS-SPME com fibra PDMS (100 μm) 0,01-0,012 ng/mg GC-MS [124] THC, canabinol, canabidiol LLE (iso-octano)/HS-SPME com fibra PDMS (100 μm) 0,012-0,016 ng/mg GC-MS [125] Anfetaminas, opioides, cocaína e metabólitos SPE com cartucho OASIS HCX/ SPME com fibra PDMS (100 μm) 0,2 ng/mg GC-MS [126] Benzodiazepínicos e metabólitos LLE (diclorometano:éter etílico (90:10, v/v)) 0,001-0,02 ng/mg LC-MS/MS [127] Fluido oral Opioides, anfetaminas, cocaína, benzodiazepínicos e metabólitos LLE (acetato de etila:heptano (4:1, v/v)) 0,13-7,1 ng/mL LC-MS/MS [128] THC, canabinol, canabidiol SPME com fibra PDMS (100 μm) 0,5-2 ng/mL GC-MS [129] Opioides, cocaína e metabólitos, anfetaminas SPE automatizada com cartucho OASIS® HLB 0,5-2 ng/mL LC-MS [130] Canabinoides sintéticos LLE (hexano:acetato de etila (99:1, v/v)) 0,015-0,9 ng/mL LC-MS/MS [131] Catinonas sintéticas e piperazinas SPE com cartucho Stracta X 0,025-0,1 ng/mL LC-MS/MS [132]
Amostras biológicas com interesse forense Bordin DCM et al. seleção de métodos de preparo de amostra adequados para resolução de problemas analíticos. Para tanto, é necessário o conhecimento básico dos princípios químicos e operacionais das mais variadas técnicas disponíveis e suas principais aplicações, assim como exige uma constante otimização destas técnicas, a fim de se aprimorar as etapas de extração e análise. Além disso, as propriedades dos compostos de interesse e as características das matrizes biológicas devem ser cuidadosamente avaliadas antes que uma técnica seja adotada para o processamento das amostras. Todos esses fatores são extremamente importantes uma vez que interferem no desempenho das análises e, portanto, direcionam a produção dos diagnósticos que podem contribuir para a elucidação de questões de interesse legal.
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