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METABOLISMO DO NITROGÊNIO
O Nitrogênio, utilizado pelas plantas, provém do N 2 atmosférico. Antes de alcançá-las, o nitrogênio deve passar por várias transformações. O N 2 é fixado em amônia (NH 4 +) por microorganismos do solo. A degradação da matéria orgânica (aa, á. orgânicos, nitrosaminas) também produz NH 4 +. O íon amônio é nitrificado em nível da rizosfera a NO 3 -. A presença de NO 3 - inibe a nodulação O N 2 atmosférico é fixado pelos nódulos de associações simbióticas. A forma preferencial é o NH 4 +,, absorvido preferencialmente em relação ao NO 3 - , especialmente em solos ácidos a nitrificação é inibida por substâncias exsudadas pelas raízes. Uma vez absorvido, dentro da planta o NO 3 -^ é reduzido a NO 2 -^ pela nitrato redutase, em seguida a NH 4 +^ pela nitrito redutase, pois ele não pode ser assimilado, na forma inorgânica. As duas etapas da redução requerem elétrons e prótons para o trabalho. A primeira reação é catalisada pela NR. Esta enzima transfere 2 elétrons do NADH (em algumas espécies NADPH). Ocorre no citoplasma, fora de qualquer organela. NR NO 3 -^ + 2 e-^ + 2 H+^ NO 2 -^ + H 2 O (NR = nitrato redutase)
A segunda reação do processo global ocorre nos cloroplastos das folhas ou plastídeos de raízes. A redução de NO 2 -^ requer 6 elétrons derivados da água pelo sistema de transporte eletr|ônico acíclico. Cerca de 20% da capacidade da CTE da fase fotoquímica são utilizados para redução de NO 3 - a NO 2 -. NiR
- NO 2 -^ + 6 e-^ + 6 H+^ NH 4 +^ + H 2 O (NiR = nitrito redutase) hν 3H 2 O + 6Fd (Fe+3) 1,5O 2 + 6H+^ + 6Fd (Fe+2)
NO 2 -^ + 6Fd (Fe+2) + 8 e-^ NH 4 +^ + 6Fd (Fe+3) + 2H 2 O
TRANSPORTE :
O transporte de NO 3 -^ é exclusivamente feito pelo xilema. O fluxo só pode ocorrer como função da transpiração e só durante o dia. Como foi visto acima a fotossíntese é importantíssima para a redução. Na planta o local predominante de redução de NO 3 -^ depende da espécie. Em Xanthium (carrapicho rasteiro) exclusivamente nas folhas. Em Pisum (ervilha) na raiz, onde há uma alta atividade da NR e nas folhas.
A importância relativa da raiz e da folha depende da capacidade da raiz de reduzir NO 3 -^ e do nível de NO 3 -^ no meio. Quanto mais nitrato no meio, maior possibilidade de saturar a raiz, ultrapassando assim sua capacidade de reduzir NO 3 - , então o excedente vai para a folha. Quanto maior a concentração de NO 3 - , mais importante é a folha para redução. A redução de NO 3 -^ é mais eficiente nas folhas.
Algumas espécies apresentam uma alta atividade da NR à noite e baixa atividade durante o dia (o café, por exemplo). Provavelmente ocorra oxidação de açúcares para formação do NADH e do complexo Fd-NADPH. O nitrito deve ser rapidamente reduzido a NH 4 +, pois é tóxico. O NH 4 + também é tóxico, e sua concentração máxima nos tecidos não pode passar de 1,0 mM, também deve ser rapidamente assimilado.
ENZIMAS A nitrato redutase (NR) é uma enzima grande, com pelo menos 4 subunidades. O seu peso molecular varia de 500.000 a 600.000 Da, enquanto que a maioria das enzimas têm PM·em torno de 100.000 Da. O controle do processo global da redução ocorre por dois mecanismos principais, em nível de NR. O primeiro é por retroinibição, no qual o produto NH 4 +^ desacopla as subunidades da enzima. Por outro lado o substrato NO 3 - induz o reacoplamento. O segundo mecanismo de controle envolve a ação de cianeto. O CN- ocorre naturalmente nas células, em quantidades mínimas e por isso não alcança níveis tóxicos. Se houver acúmulo de aminoácidos não utilizados na célula, ocorre a formação de nitrosaminas. As nitrosaminas combinam-se
Se a GDH não é importante na assimilação, onde está a sua importância·? Nos processos de senescência de órgãos como as folhas ou de germinação e desenvolvimento da plântula, onde ocorre hidrólise de reservas e compostos orgânicos. Como a GDH funciona nas duas direções, sintetizando ou hidrolisando glutamato, sua função nesses processos é quebrar o glutamato em α-cetoglutarato, liberando o NH 4 +^ , incorporado em glutamina pela GS. A glutamina formada pela degradação de proteínas vai para a reserva da semente. Durante o processo germinativo, esta reserva protéica é hidrolisada por várias enzimas até glutamato, quebrado em α- cetoglutarato e NH 4 +. O NH 4 +^ servirá também como fonte de N para o desenvolvimento da plântula.
GDH GS Proteína GLU αKG + NH 4 +^ GLN
INTERAÇÃO ENTRE FOTOSSÍNTESE E METABOLISMO DO
NITROGÊNIO
O processo fotossintético envolve não apenas a assimilação e metabolismo de carbono, mas também de nitrogênio. Neste processo estão envolvidos o citoplasma, o cloroplasto e as mitocôndrias. O poder redutor gerado pelo transporte de elétrons na fase fotoquímica da fotossíntese (nos cloroplastos) é utilizado para reduzir NO 3 -^ a NO 2 -^ (no citoplasma), para transformar NO 2 -^ a NH 4 +^ e produzir glutamina e glutamato (nos cloroplastos). Para formar glutamato são necessários esqueletos de carbono, especificamente o oxoglutarato (2-OG), também denominado de α-
cetoglutarato (α-KG) proveniente do Ciclo de Krebs, nas mitocôndrias.
É importante notar que cerca de 20% da capacidade da cadeia de transporte eletrônico da fase fotoquímica são utilizados para transformar NO 3 - em NH 4 +. Além disso, nos cloroplastos são produzidos muitos aminoácidos, a maioria dependente das reações fotoquímicas. Para todos esses processos são necessários ATP ou poder redutor (ferredoxina reduzida, NADPH ou thióis de membrana reduzidos). Outro aspecto importante é o papel regulatório da fixação de CO 2. Nas plantas superiores o NO 3 -^ não pode ser assimilado se o Ciclo de Calvin não estiver operante ou se não houver uma fonte de carboidrato disponível. Nos tecidos fotossintetizantes das C 3 , ocorre uma competição direta entre a fixação de CO 2 e redução de NO 3 - , exceto em condições de luz saturantes, pois nestas condições a capacidade do transporte eletrônico excede e muito as necessidades para fixação de CO 2. Mas nas C 4 , o NO 3 -^ é sempre reduzido no mesofilo. Não compete diretamente com o Ciclo de Calvin, pois este ocorre somente na bainha vascular.
Raghavendra, 1998.
são incluídas três tipos básicos de associação simbiótica, de acordo com o microorganismo e com a planta. No primeiro grupo está a associação das Leguminosas o Rhizobium , além do Bradyrhizobium e Azorhizobium. São bactérias gram-negativas, que vivem saprofiticamente no solo, enquanto não formam associação com as plantas. O Rhizobium forma associação quase exclusivamente com leguminosas, sendo a única exceção conhecida a Parasponia , uma árvore tropical. Ex.: R. japonicum , que nodula predominantemente com soja e R. phaseolae que predomina em feijão. Entre as nativas brasileiras há muitas leguminosas que podem formar associação com Rhizobium , entre elas o jacarandá-da-baia ( Dalbergia nigra ), a bracatinga ( Mimosa scabrella ), o amendoim ( Arachis hypogaea ), o maricá ( Mimosa bimucronata ), o tachi branco ( Tachigalia alba ), a Andira spp., a embira-de-sapo ( Lonchocarpus muehlbergianus ) e o angico-do-cerrado ( Anadenantera falcata ). O principal local para formação de nódulos são as raízes, mas pode haver nodulação também no caule, como no caso da simbiose entre a leguminosa aquática do gênero Aeschynomene e B radyrhizobium. No segundo grupo estão plantas não leguminosas que formam associação com actinomicetes (bactérias filamentosas). Nesta categoria, há associações externas e internas, sendo que nessas últimas pode haver formação de nódulos. Na simbiose externa podemos citar a associação de Azobacter com cana-de-açúcar e Spirillum com milho_._ As bactérias se concentram, formando uma mucilagem que encapa a raiz. Existem variedades de cana-de-açúcar e milho (além de sorgo, arroz, batata-doce) que estabelecem associação com bactérias endofíticas, que vivem nos espaços intercelulares (da raiz, caule e folhas) e nos tecidos vasculares (xilema). Não formam nódulo, e não há nenhuma outra modificação anatômica. Entre as bactérias endofíticas podemos citar a Acetobacter diazotrophicus que forma associação com a cana, com a grama Cameron e a batata-doce; o Herbaspirillum ssp que forma associação com milho, sorgo e arroz e o Azospirillum lipoferum com Poaceae. Estas bactérias são endofíticas obrigatórias e são transmitidas por sementes ou por propagação vegetativa. Outra associação endofítica importante é a simbiose da bactéria Frankia com as angiospermas Casuarina , Coenothus e Alnus, entre outras.
Nesse tipo de associação ocorre formação de nódulos nas raízes, a exemplo do que ocorre entre leguminosas e o Rhizobium. O terceiro tipo de associação é que ocorre entre as cianobactérias e briófitas, pteridófitas, cicadáceas e angiospermas. O local na planta onde ocorre a associação é dependente do grupo. Nas briófitas e pterodófitas a bactéria se desenvolve na cavidade das folhinhas. Nas Cycadaceae a bactéria se desenvolve na parte externa das raizes colaróides. Nas angiospermas a associação é interna e se estabelece em tecidos glandulares, como glândulas secretórias na base de pecíolos. A cianobactéria Nostoc é notável pela facilidade de formar associação com vários grupos de plantas. Entre os exemplos podemos citar a associação da Nostoc com a briófita Antheros ; com a pterodófita aquática Azolla ; com as cicadáceas Cycas e Macrozamia e com a angiosperma Gunnera. A Anabaena também pode se associar à Azolla. A simbiose entre Azolla com as cianobactérias é especialmente importante em cultivo de arroz alagado, como fonte de nitrogênio. A Nostoc também forma associação com fungos, compondo os líquens.
FORMAÇÃO DO NÓDULO NA SIMBIOSE RHIZOBIUM -LEGUMINOSA Para o estabelecimento da simbiose é necessário que ocorra ativação de vários genes, específicos. Os genes da bactéria envolvidos no processo são denominados de genes de nodulação (nod) e os da planta são denominados de nodulinos (Nod). Abaixo estão sumarizados todos os passos para a formação do nódulo:
1. As raízes normalmente exsudam substâncias, como flavonóides e betaínas que atraem o Rhizobium para a rizosfera (quimiotactismo positivo). Em resposta a estas substâncias é induzida a expressão do gene NodD que por sua vez induz a expressão de outros genes nod. Estes codificam enzimas de síntese de mensageiros secundários, denominadas coletivamente de Fatores NOD (fatores de nodulação). Os fatores NOD conhecidos atualmente são lipo-oligossacarídeos, que são responsáveis, entre outras coisas, pelo
passam a fixar N 2. Ocupam quase todo o espaço da célula e passa e a estrutura interia passa a ser denominada de bacteróide.
Fonte: Taiz & Zeiger, 2004.
BIOQUÍMICA DA FIXAÇÃO DO N 2
O N 2 atmosférico penetra nas raízes e se difunde até os nódulos. No bacteróide, a nitrogenase (Nase) transforma o N 2 em NH 4 +. Para que esta reação ocorra são necessários 8 elétrons e 16 Mg-ATP. A nitrogenase possui 2 subunidades Fe-proteína e Fe-Mo-proteína, ambas capazes de transportar elétrons.
Fonte: Taiz & Zeiger, 2004.
Durante a reação de redução do N 2 , a nitrogenase é auxiliada por uma molécula transportadora de elétrons, a ferredoxina. A reação ocorre da seguinte maneira:
- A ferredoxina, na sua forma reduzida, transfere um elétron para a unidade Fe-proteína da nitrogenase.
- A Fe-proteína, então reduzida, doa o elétron recebido para a MoFe- proteína.
- A Mo-Fe-proteína acumula os elétrons. Após 8 transferências, essa unidade terá acumulado 8 elétrons e, então, fará a redução do N 2 à NH 3.
- Para cada elétron transferido da Fe-proteína para a MoFe-proteína são consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molécula de N 2 são necessários 8 elétrons e, portanto, 16 ATPs.
Os ATPs necessários para reação da Nase são produzidos por fosforilação oxidativa no bacteróide. A CTE do bacteróide possui uma citocromo-oxidase terminal muito eficiente, que funciona em baixas concentrações de O 2 (0,01-0,1 μM). Os principais substratos para geração de ATP e poder redutor (ferredoxina reduzida) para fixação de N 2 são hexoses e
O NH 4 +^ produzido pelo bacteróide é transportado para o citoplasma da célula infectada, aonde será convertido em glutamina pelo sistema GS/GOGAT. Dependendo da espécie, a glutamina pode ser convertida em asparagina ou em purinas, cuja quebra resultará na formação de ureídeos (alantoína ou ácido alantóico).
TRANSPORTE
O transporte de compostos nitrogenados ocorre principalmente pelo xilema. Os compostos nitrogenados de transporte são:
- Ureídeos : alantoina (ALN) e ácido alantóico (ALC). São os principais nas leguminosas tropicais (tribo Phaseolae): soja, feijão e Vigna. A asparagina pode ser transportada, em menor grau.
- Asparagina : nas leguminosas temperadas, como ervilha, Vicia e Lupinus. Transportam em menor grau glutamina.
- Glutamina : nas gramíneas como o milho, a cana-de-açúcar e o trigo. Provavelmente também transportem um pouco de asparagina.
O transporte via floema pode ocorrer, quando os compostos passam lateralmente do xilema para o floema. Este transporte é seletivo. a) NO 3 - : não passa para o floema e não é produzido pelo nódulo. b) Ureídeos: passam com facilidade. ALN > ALC. c) aminoácidos (aa): a passagem depende da acidez: básicos (arginina)>neutros (GLN; ASN) > ácidos (á.glutâmico; á.aspártico)
Os aminoácidos básicos e ácidos quase não ocorrem no xilema, pois não são compostos de transporte. O transporte no floema é importante para órgãos que não transpiram.
Além de fixar N 2 , outra característica importante da nitrogenase é a
sua capacidade de catalisar outras reações (tabela 1). Esta propriedade será importante no rendimento da enzima. A energia livre de Gibbs (ΔGo’) para a reação de conversão de N 2 em NH 3 global é de cerca de -200 kJ.mol-1. Apesar da reação ser realmente exotérmica, requer uma alta energia de ativação, por causa da ligação tripla do nitrogênio molecular. No processo de fixação biológico, a nitrogenase utiliza cerca de 12g de carbono orgânico para cada grama de N 2 fixado. Mas apesar do custo energético, o processo biológico é muito mais eficiente do que o industrial, pois o primeiro ocorre em temperatura ambiente e pressão atmosférica normal, enquanto que o segundo processo requer temperaturas tão altas quanto 400-650oC e pressões de 150-400 atm. Tabela 1: Reações catalisadas pela nitrogenase (Fonte: Kerbauy, 2004)
Durante o processo de fixação, cerca de 60 a 75% da sua atividade é utilizada efetivamente na redução do N 2 a NH 4 +^ e 25% a 30% na formação de H 2. A produção do H 2 é inevitável e faz parte do processo, consumindo assim parte dos elétrons que poderiam ser utilizadas na fixação de N 2. Algumas estirpes de microorganismos possuem hidrogenase: que recicla e-^ o H 2 , sendo portanto mais eficientes no processo de fixação. As estirpes são denominadas de Leg- Rhiz Hup+, que aproveita H 2 e Leg- Rhiz Hup-, que não aproveita H 2.
PROCESSO GLOBAL DE FIXAÇÃO DE N 2 NO NÓDULO
Cordeiro 2004
BIBLIOGRAFIA
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