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Aula Prática n.º 3
Cultura de microrganismos – necessidades nutritivas. Meios de cultura: composição,
preparação, armazenamento, utilização. Técnicas de sementeira.
CULTURA DE MICRORGANISMOS - MEIOS DE CULTURA
Conhecer as características gerais dos meios de cultura relativamente a composição. Conhecer as condições de incubação dos meios de cultura. Compreender a grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos. Compreender a utilidade do exame cultural. Conhecer a classificação geral dos meios de cultura. Conhecer e caracterizar meios de cultura comuns no laboratório. Saber escolher meios de cultura consoante os objectivos pretendidos. Conhecer as técnicas de preparação de meios de cultura desidratados. TEXTO DE APOIO: Meios de cultura: composição, preparação e uso. Preparação de alguns meios de cultura. MEIOS DE CULTURA INTRODUÇÃO O estudo microscópico das características morfológicas (dimensão, forma e tipo de associação) e das características de coloração é, geralmente, insuficiente para a obtenção de uma identificação satisfatória do agente patogénico. Assim, para conhecer as propriedades, fisiológicas e bioquímicas é necessário cultivar as células microbianas no laboratório. A cultura de microrganismos consiste no crescimento de populações microbianas em meios de cultura laboratoriais. Uma cultura que tem apenas um tipo de microrganismo é conhecida por cultura pura , uma cultura que tem mais do que um tipo de microrganismo é uma cultura mista. A cultura de microrganismos consiste num passo rotineiro do exame microbiológico, sendo feito simultaneamente com o exame microscópico ou imediatamente depois. Com a cultura de microrganismos pretende-se: Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em número reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a identificação. Procurar isolar os tipos de microrganismos existentes numa população microbiana mista. Diferenciar entre grupos de microrganismos através da aparência macroscópica das colónias e das reacções bioquímicas com o meio. Caracterizar e identificar os microrganismos através das características das suas colónias, em um ou mais meios de cultura, e pelas suas
capacidades de produzirem alterações químicas em diferentes meios de cultura. Quantificar microrganismos. Analisar substâncias de ocorrência natural. CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS MEIOS DE CULTURA Para a cultura de microrganismos é necessário existirem meios de cultura apropriados que simulem ou até melhorem as condições naturais do ambiente em que se desenvolvem. Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratório. A sobrevivência e o crescimento dos microrganismos depende de um adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente físico favorável. No entanto, há uma grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e por isso é que só compreendendo as suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de microrganismos no laboratório. Composição dos meios de cultura Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e proporções correctas para a manutenção e multiplicação dos microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substâncias de baixo peso molecular que são, frequentemente, derivadas da degradação enzimática de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensáveis ao organismo em causa devem estar sob forma assimilável. As necessidades nutricionais dos microrganismos são satisfeitas no laboratório através da variedade de meios de cultura existentes. Os microrganismos têm necessidades nutricionais variáveis de acordo com a espécie, no entanto, há determinadas substâncias cuja necessidade é comum a todos. Constituintes essenciais ou básicos Água A água é um componente importante e sempre presente em altas quantidades. Todas as células requerem água no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular. A água utilizada nos meios de cultura deve ser destilada, pois a água de consumo contém minerais que podem reagir com os constituintes do meio formando precipitados, além de substâncias antisépticas (ex. cloro) que podem interferir com o crescimento microbiano. Fonte de energia As actividades metabólicas das células só podem ocorrer se houver energia disponível na célula. Os microrganismos podem ser divididos em duas categorias de acordo com a sua fonte de energia:
necessários em quantidades ínfimas (micronutrientes), sendo usados como cofactores e activadores de enzimas. Factores de Crescimento: São substâncias essenciais para o metabolismo bacteriano, pois são componentes celulares ou precursores desses componentes que não podem ser sintetizados pelos microrganismos (aminoácidos, purinas, pirimidinas e vitaminas). Os microrganismos que não conseguem sintetizar esses componentes dentro da célula necessitam de uma fonte externa. As vitaminas são substâncias orgânicas que contribuem para o crescimento celular e são essenciais, em pequenas concentrações, para as actividades celulares. São também fontes de coenzimas que são necessárias para a formação de sistemas enzimáticos activos. São factores de crescimento o sangue (factores x e v e soro), aminoácidos, extracto de leveduras, líquido ascítico, etc. A acção de algumas destas substâncias reside na sua capacidade de adsorver substâncias tóxicas do meio exterior. Substâncias Inibidoras: Incluem corantes, antibacterianos, sais biliares, NaCl, alteração do pH, etc. Indicadores de pH: Indicam se o microrganismo é ou não capaz de utilizar o substrato alterando o pH e originando mudanças de cor do meio de cultura. Substâncias solidificantes (inertes): São aquelas que conferem consistência ao meio. Utilizam-se o agar ou gelose, a gelatina e o gel de sílica. Condições de incubação dos meios de cultura Para que haja crescimento microbiano é necessário que um meio de cultura forneça nutrientes, mas também é preciso que forneça um ambiente físico adequado a cada microrganismo. A temperatura, o pH e a atmosfera gasosa são três dos mais importantes factores físicos que influenciam o crescimento e sobrevivência dos microrganismos. Temperatura O crescimento microbiano depende directamente de como a temperatura afecta as membranas, os ribossomas e outros componentes e as enzimas celulares. Com o aumento da temperatura, a actividade enzimática aumenta até ao ponto em que ocorre desnaturação irreversível da estrutura proteica das enzimas. Geralmente, temperaturas da ordem dos 70º C destroem a maioria das enzimas essenciais e causam morte celular.
Por outro lado, à medida que a temperatura baixa ocorre inactivação das enzimas e o metabolismo celular diminui gradualmente levando consequentemente à inibição do crescimento celular (aos 0º C as reacções bioquímicas cessam na maior parte das células). Cada microrganismo requer um intervalo de temperatura limitado de acordo com a sensibilidade dos seus sistemas enzimáticos ao calor. Assim, para cada espécie temos a considerar:
- Temperatura mínima de crescimento: é a temperatura mais baixa à qual o crescimento ainda ocorre. Abaixo desta temperatura a actividade enzimática é inibida e as células ficam metabolicamente inactivas de modo que o crescimento pára.
- Temperatura máxima de crescimento: é a temperatura mais alta à qual o crescimento ainda ocorre. Acima desta temperatura a maior parte das enzimas é destruída e o organismo morre.
- Temperatura óptima de crescimento: é a temperatura à qual a taxa de reprodução é máxima, o microrganismo cresce mais rapidamente; no entanto, não é necessariamente a temperatura óptima ou ideal para as outras actividades enzimáticas da célula. A temperatura óptima para uma espécie microbiana não fica no meio do intervalo de temperatura, é mais próxima do limite superior. A temperatura óptima de um determinado microrganismo está correlacionada com a temperatura do seu habitat normal. Os microrganismos podem ser classificados em três grandes grupos atendendo às suas exigências de temperatura: Psicrófilos Crescem abaixo dos 20º C, sendo a sua temperatura óptima de 15º C ou mais baixa. Uma das características deste grupo é o facto de crescerem entre os 0 e os 10º C, o que permite, por exemplo, que possam crescer em alimentos armazenados no frigorífico. Alguns crescem a temperaturas inferiores a 0º C e por isso em alimentos congelados. Mesófilos Crescem entre os 20 e os 45º C. Têm capacidade para crescer à temperatura do corpo humano (37º C) e assim neste grupo inclui-se a grande maioria dos microrganismos patogénicos. Termófilos Crescem a temperaturas superiores a 45º C, sendo o óptimo entre os 50 e os 60º C. Algumas bactérias são capazes de sobreviver à fervura, mesmo que não sejam capazes de crescer (termodúricos). Muitos dos formadores de esporos suportam a ebulição durante 15 minutos devido aos seus resistentes endósporos. pH O crescimento e sobrevivência dos microrganismos é muito influenciado pelo pH do meio ambiente e cada espécie tem a capacidade de crescer dentro de um intervalo (mínimo, óptimo e máximo) específico de pH. O pH óptimo para o crescimento microbiano, para o qual é máxima a multiplicação, é aproximadamente no meio do intervalo de pH onde o crescimento ocorre.
envolvem a utilização de oxigénio (usam processos fermentativos ou respiração anaeróbia). Nestes organismos a presença de oxigénio atmosférico leva à formação de metabolitos tóxicos como o peróxido de hidrogénio e o radical superóxido (O 2 - ), visto que não possuem as enzimas dismutase do superóxido (converte o ião superóxido em peróxido de hidrogénio) e catálase e/ou peroxidases (convertem o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio). Por conseguinte pequenas quantidades de oxigénio atmosférico são letais para estes microrganismos. No laboratório, utilizam-se jarras de anaerobiose em que o oxigénio é removido retirando-se o ar ou por reacção química. Anaeróbios aerotolerantes (ex. bactérias lácticas) São aqueles que não beneficiam do oxigénio, pois são organismos que utilizam, exclusivamente, processos metabólicos anaeróbios (fermentação). Crescem igualmente bem na presença de oxigénio, pois produzem catálase e/ou superóxido dismutase (ao contrário dos anaeróbios). Aeróbios ou anaeróbios facultativos (ex. Escherichia coli , Saccharomyces cerevisiae ): São aqueles que crescem em presença ou em ausência de oxigénio. No entanto, crescem melhor em presença do que em ausência de oxigénio, não sendo dependentes do oxigénio atmosférico. Usam preferencialmente o oxigénio para a respiração aeróbia, mas num meio pobre em oxigénio utilizam processos bioenergéticos como a fermentação ou a respiração celular anaeróbia, utilizando compostos como nitratos ou sulfatos como aceitadores finais de electrões. Procedimentos para determinar as necessidades de oxigénio: As necessidades de oxigénio podem ser determinadas inoculando-se o microrganismo em questão num tubo de ensaio contendo o meio sólido fundido, agitando-se o tubo para dispersar os microrganismos através do meio e por fim deixando solidificar o meio para assegurar que as células fiquem dispersas. Após incubação, o microrganismo vai crescer na parte do meio que contém a concentração apropriada de oxigénio, mostrando quais as suas necessidades: aeróbios estritos: apresentam crescimento à superfície. anaeróbios estritos: o crescimento é limitado ao fundo do tubo. anaeróbios facultativos: apresentam crescimento através de todo o meio, mas predominando na parte superior do tubo. anaeróbios aerotolerantes: apresentam crescimento uniforme através de todo o tubo. microaerófilos: crescem numa zona ligeiramente abaixo da superfície. CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Composição Química
Quimicamente definidos ou sintéticos São constituídos por quantidades conhecidas de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas quimicamente puras e bem definidas, ou seja, a sua composição química é conhecida. Estes meios são, geralmente, usados na cultura de microrganismos autotróficos, como as algas, ou de microrganismos heterotróficos pouco exigentes. Podem ser usados para determinar as necessidades nutricionais precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um constituinte a este tipo de meios permite verificar se esse constituinte é essencial ou não para o crescimento de um determinado microrganismo. Quimicamente complexos ou artificiais Resultam da adição de substâncias naturais de composição química mal definida a um meio sintético, ou seja, a composição química exacta não se conhece. São usados para simular e até melhorar o ambiente natural dos microrganismos a ser estudados. São usados por rotina na cultura de microrganismos São compostos por um número limitado de substâncias complexas, extractos de plantas ou animais, cujas composições químicas exactas não são conhecidas: extracto de carne, peptonas (proteínas parcialmente degradadas por enzimas como os hidrolisados de caseína do leite e os hidrolisados de proteínas de soja), extracto de leveduras, sangue, soro, leite, extracto de solo, etc. Todos estes produtos adicionados ao meio de cultura estimulam a crescimento da maior parte dos microrganismos heterotróficos. Estado Físico Líquidos ou caldos São aqueles que não têm agente solidificante. Não permitem distinguir os diferentes tipos de microrganismos pelo aspecto morfológico porque não há formação de colónias organizadas. São usados para o estudo da morfologia bacteriana, para aumentar o número de microrganismos e para várias provas bioquímicas (ex. provas fermentativas). Sólidos Obtêm-se a partir dos meios de cultura líquidos após adição de uma substância solidificante em determinada quantidade. Os meios sólidos têm a vantagem de apresentar uma superfície endurecida onde os microrganismos podem crescer, formando colónias. Cada colónia é um aglomerado de células visível macroscopicamente que teve origem a partir da multiplicação de uma só célula e que representa o crescimento de uma só estirpe de microrganismos. Estes meios permitem observar a morfologia das colónias, isolar culturas puras, conservar e armazenar estirpes bacterianas e observar reacções bioquímicas específicas.
Simples ou básicos São os meios que apenas possuem os nutrientes básicos ou essenciais, por isso só crescem microrganismos pouco exigentes que tenham grande capacidade de síntese. Como são meios pobres em nutrientes são insuficientes para suportar o crescimento de microrganismos mais exigentes. Exemplos: Água Peptonada : contém água, peptonas e cloreto de sódio. Ricos ou enriquecidos A partir dos meios básicos, por adição de outros nutrientes, produzem-se todo o tipo de meios complexos e ricos. Estes meios são usados para a cultura de microrganismos exigentes que têm necessidades nutricionais altamente elaboradas e específicas. Estes microrganismos não crescem ou crescem com dificuldade em meios básicos e por isso requerem a adição de factores de crescimento (são substâncias essenciais para o seu metabolismo, mas que eles não são capazes de sintetizar). Nestes meios pode haver também capacidade de adsorção de substâncias tóxicas. Estes meios permitem o crescimento generalizado de todos os microrganismos da amostra. Assim, utilizam-se quando se quer quantificar os microrganismos de uma amostra ou se pretende fazer crescer todos os microrganismos que existam num produto que em princípio deveria estar estéril (ex. sangue), já que qualquer crescimento é sinal de patogenicidade. Um meio rico contém uma grande variedade de substâncias orgânicas como: extracto de carne, extracto de levedura, sangue, soro, líquido ascítico, infusão de coração e cérebro, etc. Exemplos: Agar Sangue : é composto por 5 a 10% de sangue desfibrinado, animal ou humano, o que vai enriquecer o meio em nutrientes. O sangue só é adicionado ao meio liquefeito quando a temperatura se encontra entre 45-48º C, para que os glóbulos vermelhos fiquem intactos. Agar Chocolate : é também composto por sangue, mas este é adicionado ao meio quando a sua temperatura é de 80º C. É utilizado para o crescimento de microrganismos exigentes como os do género Neisseria. Brain-Heart infusion : é um meio muito rico que contém infusão de cérebro e coração de vitela. É utilizado para microrganismos exigentes como os do género Streptococcus e Neisseria. Selectivos (sólidos) ou de enriquecimento (líquidos)
Além dos nutrientes necessários para o crescimento de todos os microrganismos, estes meios específicos contêm um ou mais compostos químicos que são essenciais devido à sua especificidade funcional. Estes meios são usados para isolar grupos específicos de microrganismos, pois seleccionam um determinado microrganismo de um produto polimicrobiano (expectoração, fezes, saliva, etc.). No entanto, é preciso ter em conta que não há meios de cultura 100% selectivos, podendo crescer eventualmente outros microrganismos. São meios que permitem o crescimento de um tipo de microrganismos em detrimento de outro ou de outros, pois são formulados para suprimir o crescimento dos microrganismos que não interessam ao fim em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar. Assim, o favorecimento de um tipo de microrganismo pode dever-se a uma acção inibidora sobre os restantes (condiciona o crescimento de uns) ou à acção estimuladora do microrganismo pretendido (mais raro) ou ambas, ou seja, inibe o crescimento de um tipo de microrganismos enquanto aumenta o crescimento de outro. Os meios líquidos com inibidores do crescimento microbiano não permitem uma selecção tão precisa como nos meios sólidos, há é um enriquecimento do conteúdo microbiano do meio. Estes caldos estimulam o crescimento de um microrganismo específico, que se torna assim a espécie dominante porque se sobrepõe aos seus competidores. Permitem aumentar a concentração de microrganismos que estão em minoria no ambiente. Os agentes de selecção podem ser produtos químicos, corantes (eosina, verde de malaquita, azul de metileno, violeta cristal, verde brilhante, etc.), antimicrobianos, sais minerais (tetrationato de sódio, nitrato de potássio, telurito de potássio, cloreto de sódio, etc.), sais biliares, asparagina (promove o crescimento), etc. Exemplos: Agar Sabouraud : favorece o crescimento dos fungos, pois tem um pH baixo (5,6) e uma alta concentração de glicose, além disso o crescimento bacteriano está inibido devido à presença de um antibacteriano no meio. Meio de Löwenstein-Jensen e Meio de Middlebrook : são meios com glicerol e verde de malaquita (corante) que inibem outras bactérias permitindo isolar o Mycobacterium tuberculosis. O primeiro meio contém asparagina que é um favorecedor do crescimento desta espécie bacteriana. Caldo Verde Brilhante : condiciona o crescimento de cocos Gram positivo e favorece o crescimento de bacilos Gram negativo, principalmente da família Enterobacteriaceae devido à presença de sais biliares e do corante verde brilhante. Caldo de Tetrationato e Caldo de Selenito : o tetrationato e o selenito de sódio são substâncias inibidoras de bactérias intestinais e de muitos cocos Gram positivo. Estes meios são utilizados no isolamento de Salmonella e de Shigella a partir de produtos (água, alimentos, fezes, urina, etc.) onde a concentração destes patogénicos é baixa em relação ao resto da população normal.
Gram positivo). É um meio diferencial, pois tem presente o álcool manitol e um indicador de pH (vermelho de fenol) que passa de vermelho a amarelo se o microrganismo fermentar o manitol. Agar SS : a presença de sais biliares e do corante verde brilhante tornam- o um meio selectivo, pois inibem muitas bactérias Gram positivo. É bom para o isolamento de Salmonella e Shigella. É um meio diferencial devido à presença de lactose e de um indicador de pH (vermelho neutro) que permite distinguir os microrganismos fermentadores da lactose (colónias rosa) dos não fermentadores (colónias da cor do meio). Agar EMB ( Eosine Methylene Blue ) ou Meio de Levine : é um meio selectivo, pois é parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo devido ao azul de metileno, e por conseguinte o crescimento dos Gram negativo é mais abundante. É um meio diferencial, pois a presença de lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactérias fermentadoras das não fermentadoras da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose levam à baixa de pH, de modo que as colónias aparecem com aspecto verde metalizado. Os que não fermentam a lactose produzem colónias incolores, mas devido à sua transparência aparecem com a cor do meio, ou seja, púrpura. Este meio permite identificar os Gram negativo patogénicos através da caracterização visual, porque eles raramente fermentam a lactose. Meios de transporte São meios estáveis que não permitem que os microrganismos se desenvolvam, mas mantendo a viabilidade de todos os microrganismos da amostra sem alterarem as suas concentrações. São usados para armazenamento temporário de amostras para serem transportadas para o laboratório, nas mesmas condições em que se encontravam no momento da colheita. Meios de manutenção Permitem manter as culturas durante algum tempo, pois os microrganismos vão crescendo, mas lentamente. PREPARAÇÃO GERAL DE MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS Os meios de cultura desidratados são produzidos por Laboratórios comerciais, de tal modo que o nome e a composição de cada meio é praticamente semelhante para todas as marcas. São fornecidos em pó ou em grânulos e a sua preparação faz-se pela simples adição de água destilada, bidestilada ou desionizada (obtido pela acção de resinas troca- iões) em determinada proporção que se encontra expressa no rótulo da embalagem. Rehidratação
Num recipiente de vidro pesa-se cuidadosamente o pó relativo ao volume que pretendemos obter, segundo as indicações do fabricante. Esses componentes do meio vão ser agora dissolvidos em água destilada, bidestilada ou desionizada, e depois com a ajuda do calor aquece-se até dissolução completa.
permitem a passagem dos microrganismos, ficando assim o meio esterilizado. A filtração é uma excelente maneira de reduzir a população microbiana sem ocorrer destruição directa dos microrganismos, pois o filtro simplesmente os remove. Acondicionamento Quando não se pretende usar o meio de cultura de imediato, este deve ser conservado ao abrigo da luz, a uma temperatura entre 0 e 5º C no período determinado pelo fabricante, evitando a sua desidratação. Para o utilizar faz-se a redistribuição para recipientes já esterilizados onde se irão posteriormente semear os microrganismos. Os meios sólidos para poderem ser redistribuídos tem de ser aquecidos até ficarem liquefeitos, transferidos para um banho de água a 48- 50º C para arrefecerem, e finalmente distribuídos por recipientes. Já no recipiente é preciso deixar o meio arrefecer mais para solidificar (Figura 6). Os meios sólidos no estado liquefeito podem ser colocados em tubos de ensaio (com tampa para evitar a contaminação e a desidratação do meio de cultura) ou em placas de Petri. Para se obter um tubo em rampa deixa-se arrefecer e solidificar o meio de cultura numa posição inclinada, criando assim uma rampa mais ou menos pronunciada. São usados para manter culturas puras. Por outro lado, deixando arrefecer o meio num tubo na posição vertical temos um tubo em cilindro. Estes tubos são usados, por exemplo, para estudar as necessidades em oxigénio dos microrganismos. Os meios em placa de Petri proporcionam grandes áreas de superfície para o isolamento e o estudo dos microrganismos. As placas de Petri são formadas por duas metades, uma base (que contém o meio de cultura) e uma tampa. Há placas de Petri de vários tamanhos sendo as usadas por rotina de aproximadamente 9 cm de diâmetro. Os meios líquidos são distribuídos em tubos de ensaio, balões ou frascos também devidamente rolhados. CULTURA DE MICRORGANISMOS - SEMENTEIRAS OBSERVAÇÃO E CRÍTICA DOS RESULTADOS DAS SEMENTEIRAS CARACTERÍSTICAS CULTURAIS DOS MICRORGANISMOS Conhecer procedimentos para a cultura de microrganismos. Compreender a importância das técnicas assépticas na cultura de microrganismos. Conhecer princípios e procedimentos das diversas técnicas de sementeira em placa. Executar sementeiras em diferentes meios de cultura em placa para isolamento de colónias a partir de produtos polimicrobianos. TEXTO DE APOIO:
Semear é a designação microbiológica para a introdução, num meio de cultura adequado, de um inóculo de origem biológica ou cultural. Os instrumentos usados para a execução das sementeira são:
- ansas simples ou calibradas.
- fio recto.
- pipeta Pasteur.
- vareta de Drigalsky.
- zaragatoa.
- outros Os meios de cultura sólidos podem ser distribuídos de forma variada de acordo com o que se pretende: em balões tipo Erlermeyer ou outros, tubos em rampa, em cilindro e em placas de Petri. Os meios de cultura líquidos (caldos) são habitualmente distribuídos em balões ou tubos. A passagem de bactérias de um meio de cultura para outro é chamada repicagem. Técnicas de sementeira. Meios sólidos: Em picada. Em estria. Esgotamento. Em toalha. “Shake.” Meios líquidos: Dispersão. O isolamento bacteriano pode ser obtido através de processos: mecânicos - técnica de sementeira por esgotamento. biológicos - utilização de meios de cultura selectivos. Incubação em estufa a 36 - 37º C Observação do crescimento bacteriano. Em meios sólidos: O crescimento traduz-se pelo aparecimento de colónias , isto é, aglomerados de células resultantes da multiplicação bacteriana a partir de um único ancestral. Nessas colónias devem ser averiguadas as seguintes características, principalmente quando observadas em placas de Petri:
- tamanho – ponta de alfinete, pequeno, médio e grande.
- cor/pigmentação – diversificadas.
- forma - circular, irregular, rizóide e em toalha.
