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Introdução
Algumas espécies de insetos são consideradas pragas importantes na agricultura brasileira, como as lepidopteras: Spodoptera frugiperda, Anticarsia gemmatalis e Plutella xylostella. Outros podem ser vetores de doenças como a dengue, febre-amarela e filariose, como os mosquitos Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus. O uso inadequado dos chamados inseticidas químicos para o controle de muitos destes insetos vem causando nos últimos anos um desequilíbrio nos ecossistemas por poluírem o meio ambiente, atuarem sobre os inimigos naturais e promoverem o surgimento de populações de insetos resistentes. Neste sentidom os agentes biológicos surgem como uma alternativa importante e mais segura para o controle de pragas. Muitas bactérias são vistas como um problema na industria de alimentos, por produzir toxinas e apresentar esporos altamente resistente a processos de higienização. Porém algumas bactéiras, em especial as formadoras de esporos, produzem moléculas importantes (solventes, antibióticos, enzima e inseticidas), e devido a sua especificidade serão bem adaptadas ao controle biológico. As bactérias formadoras de esporos pertencem em sua maioria a família Bacillaceae , incluindo cinco gêneros: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum e Sporosarcina. São também essas bactérias formadoras de esporos as de maior potencial para o controle biológico, pelas mesmas características que lhes conferem resistência as condições adversas ambientais e de processamento industrial. Em conjunto com o desenvolvimento da agrigultura nos últimos trinta anos ocorreu também a intensificação do uso de pesticidas químicos, devido ao grande aumento do ataque de insetos, estima-se que os mesmo representa em torno de 30% das perdas em colheitas e na estocagem. Com esse aumento surgiram os problemas de toxidez, devido as resíduos que permanescem na área aplicada e ao seu uso indiscriminado. O uso intenso de agrotóxicos pode levar a degradação dos recursos naturais, em alguns casos de forma irreversível, levando a desequilíbrios biológicos e ecológicos, entre eles a contaminação dos lençóis freáticos e é claro do próprio solo. Outro problema paralelo é a capacidade das pragas em se adaptarem aos pesticas, tornando-os resistentes, o que obriga a utiliza de novos produtos, cada vez mais tóxicos e prejudiciais ao meio ambiente. Visando uma alternativa para esse problema que surgiram outras formas de combate a pragas, como o uso de feromonios e entomopatogenos. Os entomopatogenos (agentes capazes de provocar doenças em insetos) serão o foco deste estudo, neles estão incluidos especilamente vírus, bactérias e fungos. A vantagem destes agentes entomopatogenicos e que elas são quase sempre específicos e apresenta baixa ou nenhuma toxidez aos vertebrados e insetos benéficos, ocorrendo naturalmente nos campos cultivados, sendo uma alternativa natural, preservando assim o meio-ambiente. São vários os microorganismos patogênicos a insetos ou que produzem material tóxico para eles. Podem ser divididos em três grupos, com base em sua ecologia. O primeiro grupo, uma vez introduzido numa população alvo será reciclado naturalmente, gerando um grau de controle permanente naquela população. O segundo grupo logo desaparece do ambiente ao qual foi aplicado e que devera ser aplicado repetitidamente. O terceiro grupo pode ser comportar de ambas as formas dependendo da combinação da linhagem do patogeno com a espécie de praga visada e também do ambiente.
A manipulação genética dos patogenos promove novas linhagens potencialmente mais ativas e a descoberta de novas espécies, induzem a perspectivas ainda mais promissoras na área. Paralelamente, o desenvolvimento de novos métodos de preservação de microorganismos favorece a manutenção de bancos desse material para futuras pesquisas e melhoramentos.
Produção
Por ser um processo de seleção natural a aplicação de bioinseticidas requer grandes quantidades do agente ativo, e para que se torne um processo viável economicamente, além de ambientalmente, sua produção deve ser relativamente simples e apresentar boas características de estocagem. Algo que caracteriza produção é o fato do microorganismo entomopatogenicos se desenvolver em meio artificial. Se ele crescer em meio artificial (in vitro) poderá ser produzido em larga escala, utilizando técnicas de fermentação. Por outro lado, se o patogeno se reproduzir apenas in vivo, faz-se necessário o hospedeiro vivo, ou um organismo alternativo para sua multiplicação, sendo necessária a utilização de métodos de criação de insetos, livres de doenças, geralmente alimentados com dieta artificial. Em torno 1950, quando se percebeu a possibilidade de se manipular microorganismos para causar epizootias em insetos susceptíveis, em velocidade próximas daquelas dos produtos químicos, sem contudo causar danos as espécies benéficas. Isso gerou um interesse comercial no desenvolvimento de produtos para controle microbiano. Primeiramente, foram as empresas de fermentação que, na procura de novos mercados, se lançaram ao estudo da produção do Bacillus Thuringiensis (Bt), que apresentava viável para crescimento in vitro. A seguir, as industrias de produtos químicos, já estabelecidas na produção e venda de inseticidas, demonstraram interesse, devido a pontencialidade que o inseticida bacteriano representava na facilidade de produção, viabilidade e eficácia para controle de insetos. Em oposição a maioria dos pesticidas químicos, o ingrediente ativo dos produtos a base de bactérias e obtido diretamente de organismos vivos, o que implica em etapas de obtenção e utilização diferentes das rotineiramente observados nos produtos químicos. Na produção industrial de produtos microbianos, há a necessidade de seleção de uma linhagem, seja ela isolada de fontes naturais como solo ou insetos, seja obtida por manipulação genética, que seja bem adaptada ao processo fermentativo e variações a fim de maximizar a produção e realizar o crescimento fermentativo sob condições econômicas. Verifica-se a estabilidade da linhagem através de varias gerações de forma a demonstrar que através de multiplicações sucessivas um inoculo inicial não revertera a um isolado menos ativo. Estudam-se as condições ótimas de produção da entidade tóxica, pois apesar de se poder contar com uma linhagem potente, existe a possibilidade das condições de fermentação alterarem drasticamente a habilidade do isolado de gerar um produto altamente tóxico. Assim, a eficiência do fermantado final depende muito da qualidade e controle do processo de produção. As etapas preliminares de otimização das condições de produção são normalmente realizadas em pequenos reatores, seguidas de etapas intermedarias. Esses reatores são construídos de forma a permitir o controle, o monitoramento e o registro as condições de trabalho bem como a retirada de amostras assepticamente. Desses testes obtem-se dados
A composição do meio de cultura para a fermentação deve constar de água, carbono e nitrogênio, para a biosíntese e energia, e traços de minerais, necessários para o crescimento de microrganismos, tais como cálcio, zinco, manganês e magnésio. O balanço adequado de sais minerais auxilia no equilibrílio do pH do caldo de fermentação, que é de extrema importancia na produção e posteriores recuperação e estabilidade de toxina ou produto final desejado. Os níveis e formas desses elementos dependem do processo de fermentação usado. Uma das chaves para o sucesso da produção e comercialização de inseticidas bacterianos tem sido desenvolvido do meio de cultura. A maioria dos meios de culturas empregados usa produtos totalmente maturais como fonte de carbono, nitrogênio e sais. O balanço entre nitrogênio e oxigênio pode ter uma grande influência sobre o ph durante a fermentação. O pH da fermentação pode ser controlado entre 5,4 e 8,4, através do balanço de nutrientes (ácidos formados a partir de carboidratos, e bases formadas a partir de fontes de proteína).
Separação de toxinas
As toxinas produzidas podem ser classificadas em endotoxinas, aquelas ligadas à
célula microbiana, e em exotoxinas, são aquelas excretadas no meio de cultura. No caso da Bt possui uma endotoxina denominada delta-endotoxina e uma exotoxina denominada de betaexotoxina. Independente da forma de separação desejada ou possível, ela envolverá etapas de purificação e concentração do caldo fermentativo, uma vez que este contém água, remanescentes do meio de cultura (sólidos e materiais dissolvidos), fragmentos celulares e os esporos e cristais. Essa separação é uma outra etapa crítica no desenvolvimento do processo produtivo, caso o desenho aplicado à separação não seja adequado.
Separação do Complexo esporo-cristal de Bt para a produção em escala-piloto
Caldo total= pH 8,4-9,
Centrifugar (centrífuga contínua de cesto)
Pesar o resíduo (cremoso)
Suspender o resíduo em solução contendo lactose (10% peso/peso), agente umectante (1%) agente dispersante (1%)
Misturar bem
Ajustar sólidos totais para 20%
Secar em atomizador (bico de aspersão centrífugo) Temperatura de entrada 125 – 150°C Temperatura de saída 75 – 100°C
Formulação
Ensaio e Formulação
Com inseticida químicos, a produção pode ser bem controlada, pois a normalização desses produtos pode ser expressa em porcentagem de ingredientes ativos, já que os mesmos são quimicamente definidos e seus efeitos bem determinados. Já os produtos de Bt poderão conter até três princípios ativos (esporos, cristal e exotoxina) necessitando de bioteste: contagem de esporos e bioensaios com insetos, para determinar a potência do produto. A contagem de esporos ou de cristais como único método, não tem relação com a atividade de toxina, uma vez que o processo de obtenção pode modificar a atividade dos componentes tóxicos. O caldo fermentativo deve ser estabilizado antes de ser utilizado, de forma a não perder a potência. Assim, a remoção de fragmentos celulares e compostos intermediários da fermentação podem “desativar” o composto tóxico, é feita através de lavagens e centrifugações sucessivas da biomassa com soluções de pH controlado (entre 7 e 8) permitindo a limpeza e estabilização das unidades tóxicas. Os bioensaios de padronização podem ser realizados segundo protocolos da Organização Mundial de Saúde (OMS) ou do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA). Com o surgimento de variedades ativas contra outros insetos, as normas de resistro estão revisadas, sendo que se observa nos rótulos atualmente as Unidades Internacionais acompanhadas da % em peso do ingrediente ativo (esporos + cristais).
Aplicação
De maneira simplificada, o efeito inseticida ocasionado por Bacillus thuringiensis inicia-se quando um inseto suscetível ingere os cristais dessa bactéria. Esses cristais são compreendidos por pró-toxinas as quais, após a ingestão, são solubilizadas pelo pH alcalino do trato intestinal do inseto. Uma vez ativos, os fragmentos de pró-toxinas se ligam em receptores específicos encontrados no epitélio do inseto. Como conseqüência disso, ocorre a deformação das células epiteliais do intestino médio. Uma vez que o funcionamento do intestino médio é interrompido, ocorre uma redução do pH do fluido intestinal do inseto conjuntamente com uma liberação de nutrientes, os quais criam condições para a germinação dos esporos e a multiplicação das células vegetativas da bactéria. O Bacillus thuringiensis então invade os tecidos larvais do inseto que eventualmente interrompe sua alimentação e morre. Devido ao processo infeccioso, o inseto se torna mais suscetível a
Saúde para campanhas de combate a mosquitos transmissores de doenças. Além disso, o produto não polui, não deixa resíduos, não se acumula no meio ambiente, não afeta os outros insetos benéficos e pode ser facilmente associado a outros métodos de controle. Ele pode ser aplicado diretamente nos focos onde os mosquitos se reproduzem, como águas estagnadas, lagoas salobras, represas, bocas de lobo, fossas e estações de tratamento de esgoto, com pulverizador manual ou motorizado, em doses que variam de 1 a 3 litros do produto comercial por hectare. O Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT) desenvolveu dois bioinseticidas capazes de combater vetores de doenças como dengue, febre amarela e malária. Os produtos apresentam uma série de vantagens em relação aos inseticidas químicos, largamente usados no combate aos mosquitos, e são resultado de uma parceria entre o IPT, a empresa Bthek - Biotecnologia, que ficou responsável pela avaliação em campo do produto, e a Embrapa. A formulação dos bioinseticidas foi feita a partir das bactérias Bacillus thurigiensis e Bacillus sphaericus, predadoras naturais e específicas de diferentes insetos. As bactérias atacam a larva dos insetos, liberando uma endotoxina que, ao ser ingerida pela larva, causa danos em seu trato gastro-intestinal, causando sua morte. "Para produzir a toxina bioativa a bactéria tem de chegar à forma esporulada. A ingestão do esporo viável pela larva também pode causar a morte da mesma", explica a pesquisadora do IPT, Maria Filomena de Andrade Rodrigues. O Bacillus thurigiensis, por exemplo, ataca as larvas do Aedes Aegypti, transmissor da dengue, que se reproduz em águas limpas e paradas.
Conclusão
Os fatores de mercado que favorecem os biopesticidas incluem: preferência crescente do consumidor por produtos sem pesticidas químicos, aumento de mercado para os produtos de cultivo orgânico, desenvolvimento de um sistema agrícola mais sustentável usando programas de manejo integrado, estabilização e harmonização de regulamentação governamental para resistro de bioinseticidas contendo microrganismos de ocorrência natural ou engenheirados, e presença de muitas companhias de grande porte no mercado de bioinseticidas.
Referências Bibliográficas
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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Tecnologia e Geociências
Departamento de Engenharia Química
Produção de Bioinseticidas
