Microscopia de Força Atômica (AFM) e sua Aplicação no Estudo de Hialuronato de Sódio (HA), Manuais, Projetos, Pesquisas de Química Industrial

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ – UFPR

VISUALIZAÇÃO DA MICROESTRUTURA DO

ÁCIDO HIALURÔNICO POR AFM

RICARDO PADILHA VIANNA FILHO

1. INTRODUÇÃO

1. Microscopia de força atômica (AFM)

O AFM, ou microscópio de força atômica, ou ainda, SFM (Scanning Force Microscope), foi inventado por Binning, Quate e Gerber, após observação que a ponta do STM exerce forças sobre a superfície da amostra na mesma ordem das forças interatômicas, ou seja, o AFM usa interação entre as forças sonda-amostra para traçar o mapa da superfície [3]. O microscópio de força atômica pode ser operado de diversos modos. Entretanto, seu princípio fundamental é a medida das deflexões de um suporte em cuja extremidade livre está montada a sonda. Estas deflexões são causadas pelas forças que agem entre a sonda e a amostra. Os modos de fazer as imagens, também chamados modos de varredura ou de operação, referem-se fundamentalmente à distância mantida entre a sonda (ponteira) e a amostra, no momento da varredura, e às formas de movimentar a ponteira sobre a superfície a ser estudada. Estes modos de fazer imagens podem ser classificados em dois tipos: modo contato e modo não-contato, dependendo das forças líquidas entre a ponteira e a amostra. Quando o aparelho é operado na região atrativa, o método chama-se não-contato. Nesta região, o cantilever de AFM se enverga na direção da amostra. A operação na região repulsiva chama-se contato e o cantilever se dobra, afastando-se da amostra. No modo de não-contato ele é atraído pelas forças de capilaridade da camada de contaminação ou pelas forças de van der Waals, quando a amostra é limpa. No modo de contato, a deflexão do cantilever é na direção oposta à da amostra. Na fig.1 estão representadas as duas regiões que determinam os modos de operação do AFM, onde, a área abaixo da linha de força nula, as forças são atrativas e acima da linha do zero, as forças são repulsivas. Os efeitos de uma variedade de forças atuando entre ponta-amostra podem ser analisados, essas forças incluem as forças atrativas de van der Waals, forças magnéticas, e forças Coulombianas, de média para grandes distâncias, tipicamente ≥ 100 Å [2]. Em resumo, quando a ponteira se aproxima da amostra, é primeiramente atraída pela superfície, devido a uma ampla gama de forças atrativas existentes na região, como as forças de van der Waals. Esta atração aumenta até que, quando a ponteira aproxima-se muito da amostra, os átomos de ambas estão tão próximos que seus orbitais eletrônicos começam a se repelir. Esta repulsão eletrostática enfraquece a força atrativa à medida que a distância diminui. A força anula-se quando a distância entre os átomos é da

AFM incluem imagens de circuitos integrados, componentes ópticos e de raio- x, elementos armazenados em meios de comunicação e outras superfícies críticas. Para a microeletrônica o STM foi e é de grande importância, pois foi possível a caracterização de defeitos, inclusive pontuais em estruturas [1].

Àcido Hialurônico (HA)

O hialuronato de sódio, será referido neste estudo como acido hialurônico (HA). O HA é um polissacarídeo linear aniônico, composto de unidades dissacarídeas repetitivas formadas por N-acetil-D-glucosamina e ácido glucurônico, com um peso molecular entre 10^4 e 10 7.

Este polímero é o constituinte básico de numerosos tecidos no organismo. Também pode ser encontrado em compartimentos como cordão umbilical, corpos vítreos, pele e fluido sinovial. A alta viscosidade das soluções de HA e a importante função deste polímero no fluido sinovial bem como em muitas aplicações médicas tem estimulado os estudos das interações moleculares em HA [11]. O primeiro método aplicado a extração industrial para isolamento e purificação em grau farmacêutico, cordões umbilicais e cristas de galo eram

congelados para destruir as membranas celulares, e HA era extraído com água e precipitado em solventes orgânicos [12]. O ácido hialurônico é produzido atualmente por biotecnologia onde é secretado no meio como exopolissacarídeo. No método o polissacarídeo é produzido por fermentação de Streptococcus spp. Desta forma o uso de solventes de risco e contaminações são evitados [13]. A conformação do HA em solução foi proposta como sendo uma estrutura ordenada incorporando acima de 5 ligações de hidrogênio por unidade dissacarídica.Onde uma simples hélice tipo fita é formada. Em lados alternados da simples hélice de HA, domínios hidrofóbicos de 8 a 9 unidades de CH alongam-se através de 3 unidades vizinhas de açúcar. Isso ajuda a explicar a habilidade do HA de interagir com lipídeos e membranas e sugere que isso possa interagir com ele mesmo na água. Os domínios hidrofóbicos foram postulados como promotores na formação de rede e agregação lateral [10].

3. OBJETIVOS

• Obtenção de imagem de moléculas de hialuronato de sódio com e sem adição de Ca++^ em célula líquida.
• Obtenção de imagem de moléculas de hialuronato de sódio com e sem adição de Ca++^ depositado sobre mica em taping mode.
• Plotagem da curva de força para o sistema.
• Interpretação dos resultados obtidos.

4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Devido a microscopia de força atômica ter a capacidade de resolver imagens de superfícies em líquidos, esta técnica tornou-se uma importante ferramenta para estudar amostras biológicas. Recentemente observou-se montagem de proteínas em condições fisiológicas em resolução nano métrica. Como demonstrado em sólidos sob vácuo e líquido, a AFM também tornou possível a medida de amostras com acerácea de sub angstrom. O tamanho de amostras biológicas nativas medidas pela AFM em solução aquosa varia significativamente e pode diferir entre valores dependendo do método utilizado. Por exemplo, o tamanho medido por uma simples membrana varia de 5.1 nm a 11 nm. A medida para filamentos de actina, toxinas da cólera, bicamadas lipídicas e microtubulos exibem uma similar variabilidade. Anormalidades de tamanhos para superfícies macias já foram estudadas e atribuídas a propriedades mecânicas da amostra. Foi demonstrado que interações eletrostáticas entre a ponta do AFM e a amostra influenciam a medida do tamanho de estruturas biológicas adsorvidas em um suporte sólido [6]. Um obstáculo para obter imagens de biopolímeros é o desenvolvimento de altas forças adesivas que “colam” a ponta na superfície, e causam danos ou deslocamentos moleculares durante a varredura. A adesão pode resultar da condensação capilar ou fragmentos coletados pela ponta. Recentemente métodos confiáveis tem sido desenvolvidos para imagens de AFM de polissacarídeos: estes incluem modos ac não contato, tapping ou dc contato tem permitido imagens da estrutura helicoidal de polissacarídeos [7]. As primeiras aplicações da AFM em estudos de biopolímeros eram cercadas de problemas de amostras danificadas e imagens irreprodutíveis. A maioria destes problemas aconteciam porque as amostras a serem imageadas eram depositadas sobre substratos como grafite ou mica e então imageadas no ar. Sob estas condições, exceto a baixa umidade relativa, a superfície da amostra e a ponta são recobertas com uma fina camada de água. Como a ponta e a superfície da amostra são aproximadas quase até se tocarem estas camadas de água coalescem resultando em uma alta força adesiva que cola efetivamente a ponta e a superfície juntas. Quando a superfície e o cantilever

especialmente quando o único ambiente onde ele pode ser encontrado é na superfície das células [9].

5. METODOLOGIA

O ácido hialurônico será solubilizado em água deionizada sob agitação constante, com concentração final de 1μg/mL, formando a solução 1. Novamente outra porção de ácido hialuronico será solubilizado em solução de CaCl 2 0,0001M, com concentração final de 1μg/mL, formando a

solução 2. Então, 10 μL de cada solução serão depositados sobre superfície de mica, lavadas e secas em temperatura de 22ºC. As imagens serão obtidas em microscópio Shimadszu SPM – 9500J3, em modo dinâmico.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] C. Bay, “Scanning Tunneling Microscopy and its Application”, Springer Series in Surface Sciences 32, Feb 1995.

[2] Esaki, L., “Highlights in Condensed Matter Physics and Future Prospets”, Series B: Physics 285, 1992 ASI Science Forum.

[3] Fukui, M., “Técnicas de Microscopia de Tunelamento de Elétrons (MTE) e Microscopia de Força Atômica (MFA) aplicadas ao estudo de superfícies de grafite e diamante”, BAE/22623, T/UNICAMP, Apr 1992.

[4] Morris, V. J., Mackie, R. A., Wilde, P. J., Kirby, A. R. (2000) Lebensm.-Wiss. u.-Technol 34, 3-10.

[5] Funami, T., Hiroe, M., Noda, S., Asai, I., Ikeda, S., Nishinari, K., (2007) Food Hydrocolloids 21, 617–629.

[6] Muller, D. J., Engel, A., (1997) Biophysical Journal 73, 1633-1644.

[7] Morris, V. J., Gunning, A.P., Kirby, A.R., Round, A., Waldron, K., (1997) International Journal of Biological Macromolecules 21, 61-66.

[8] Ikeda, S., Funami, T., Zhang, G., (2005) Carbohydrate Polymers 62, 192-196.

[9] Spagnoli, C., Korniakov, A., Ulman, A., Balazs, E. A., Lyubchenko, Y., Cowman, M., (2005) Carbohydrate Research 340, 929–941.

[10] Krause, W., Bellomo, E., Colby, R., (2000) Biomacromolecules 2, 65-69.

[11] Maleki, A., Kjoniksen, A., Nystrom, B., (2007) Polymer Bulletin 59, 217-226.

[12] Lapcık, L. Jr., Lapcık, L. (1998). Chemical Reviews 98, 2663- 2681

[13] Huang, W., Chen, S., Chen, T. (2007). Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, IN PRESS.