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PROCESSO DE FERMENTAÇÃO COM CASCA DE ARROZ
Tipologia: Resumos
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Eduarda Soares (135086) Larissa Soria (129417) Victoria Luiza Gunther (127247) Rio Grande 2023
Determinação de atividade enzimática de celulases produzidas por Rhizopus oryzae em fermentação em estado sólido com casca e farelo de arroz, avaliando diferentes teores de umidade.
2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 MICRO-ORGANISMO E INÓCULO O micro-organismo selecionado para o experimento foi o Rhizopus oryzae. O inóculo foi preparado seguindo as especificações do ágar batata dextrose e foi cultivado em uma garrafa de Roux. Após a inoculação, a garrafa foi mantida na posição horizontal e incubada por um período de 24 h. Após essa etapa, 50 mL de água peptonada 0,1% foram adicionados e uma raspagem foi realizada utilizando uma alça esterilizada. O conteúdo resultante foi transferido para um frasco Erlenmeyer estéril de 500 mL. Sendo a concentração da solução de esporos estimada por enumeração em Câmara de Neubauer através da equação 1. Células mL
Células contadas x 10 3 x FD Área x Profundidade (1) Onde: FD (Fator de diluição) = 1; Área = 0,04 mm^2 ; Profundidade = 0,1 mm. 2.2 MEIO DE CULTIVO E FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO A fermentação em estado sólido é um bioprocesso amplamente utilizado na produção de celulose a partir de biomassas lignocelulósicas, essas que possuem como características estruturais, químicas, biológicas e maior resistência a ação química e enzimática (CASTRO, 2010). O teor de umidade desempenha um papel crucial nesse processo, afetando a atividade enzimática, a taxa de fermentação e a qualidade do produto final. Estudos recentes têm
A determinação de atividade enzimática da celulase foi realizada pela técnica de DNS. Para isso, foram adicionados 0,5 mL de tampão Na-citrato (pH 4,8 e 0,05 M) em 2 mL do extrato enzimático e, em banho termostatizado a 50 °C, foi adicionado 0,5 mL de carboximetilcelulose e homogeneizado manualmente. A reação foi mantida a 50 °C por 30 min para a catálise do substrato pela enzima à açúcares redutores. Em 1 mL da solução da reação enzimática, em temperatura ambiente, foi adicionado 1 mL de DNS e manteve-se por 5 min em banho termostatizado a 100 °C. Após, foi resfriado em banho de gelo e adicionado 8 mL de água destilada. A solução foi lida em espectrofotômetro a 540 nm. Para determinação da curva padrão de concentração de glicose em (g/L), foi lido no espectrofotômetro os valores da concentração da glicose, assim obtendo os valores de transmitância, aplicando na Equação 2 obtivemos as absorbâncias e assim uma equação da reta da curva padrão de concentração de glicose por valores de absorbâncias. |¿| 2 −log ( T % ) Equação da reta: Y =0,8911 x (^) (3) Onde: Y= absorbância; X=concentração (g/L).
Para o cálculo da atividade enzimática, foram usadas para calcular a absorbância média (Absm) a Equação 4: Absm = (2 - log (media T%)) (4) Assim, a absorbância corrigida das amostras, foi calculada corrigindo com os valores do branco DNS Equação 5: y = Absm – Branco (DNS)
Os valores de extração enzimática corrigido, será diminuído pela absorbância do branco da amostra corrigida como mostra a Equação 6:
y = Absm corrigida – Branco corrigido
Para se obter a concentração de glicose para calcular a atividade enzimática substuimos os valores obtidos de absorbância da extração enzimática corrigida na equação da reta, assim teremos as concentrações para substituir na Equação 7 e fator de diluição vai ser obtido pela Equação 8:
Cglicose x FD x FC
mamostra
Onde: FD: fator de diluição; MM: massa molar; t: tempo de reação; FC: fator de conversão.
A fim de calcular a atividade enzimática por grama de substrato (AE), foi usado a Equação 9.
mamostra
A contagem da solução de esporos foi realizada em câmara de Neubauer e a média das contagens em cada quadrante pode ser observada na Tabela 2. Tabela 2 - Média das contagens de esporos de Rhizopus oryzae em câmara de Neubauer.
Figura 1 - Curva padrão de concentração de glicose (g/L) 3.3 ATIVIDADE ENZIMÁTICA Para o cálculo da atividade enzimática, as amostras foram lidas em duplicatas no espectrofotômetro, obtendo as leituras apresentadas na Tabela 3 e 4 para os grupos 1 e 2, respectivamente. As leituras feitas em transmitância, foram usadas para calcular a absorbância média aplicando na Equação 4. As massas de amostras coletadas foram de m 1 = 5,17 g e m 2 = 5,34 g para os grupos 1 e 2, respectivamente. Foi feita leitura de branco para descontar a influência da coloração do DNS (Branco (DNS) e um branco para descontar a influência da cor da reação (Branco (Reação). Tabela 3 – Leituras das amostras do grupo 1 Leitura %T 1 %T 2 Absm Amostra 53,3 51 0,
Branco (Reação) 98,2 98,2 0, Branco (DNS) 98,4 - 0, Tabela 4 – Leituras das amostras do grupo 2 Leitura %T 1 %T 2 Absm Amostra (A) 52,3 51,5 0, Branco (Reação) 98,6 98,3 0, Branco (DNS) 98,4 - 0, Assim, aplicando os valores obtidos nas equações obtivemos os seguintes resultados como apresentado na Tabela 5: Tabela 5 - Resultados da atividade enzimática U/g Amostras Abs - Abs do branco Conc. De glicose g/L Atividade enzimática U/ml Ativ. Enzimática U/g Grupo 1 0,274 0,308 0,085 0, Grupo 2 0,277 0,311 0,086 0, Os resultados de concentração enzimática foram obtidos através da Equação 2, a atividade enzimática foi calculada pela equação obtendo os resultados demonstrados na Tabela 5. A fim de calcular a atividade enzimática por grama de substrato (AE), foi usado a Equação 7, onde obteve-se a atividade enzimática da celulase de 0,42 U g-1^ quando o R. oryzae foi cultivado em 50:50 % (sólidos: umidade) e 0,43 U g-1, quando cultivado em 40: % (sólido umidade).
4. CONCLUSÃO A atividade enzimática da celulase produzida por Rhizopus oryzae em fermentação em estado sólido foi de 0,42 U g-1^ quando cultivado em 50:50 % (sólidos: umidade) (grupo 1) e 0,43 U g-1, quando cultivado em 40:60 % (sólido umidade). O nível de umidade desempenha papéis muito importantes no processo de fermentação, como a dissolução homogênea dos
Engineering aspects of solid state fermentation. Enzyme and Microbial Techonology , v. 7, p. 258-265, 1985. SILVA, I. C., OLIVEIRA, J. R., ANDRADE, L. R., RAMOS, L. P., & KRIEGER, N. Solid- state fermentation for cellulase production using agricultural residues: mixture design, kinetics, and thermal stability. Biotechnology for Biofuels , 10(1), 127, 2017.
