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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA
DEPARTAMENTO ESTUDOS BÁSICOS E INSTRUMENTAIS - DEBI
RELATÓRIO TÉCNICO FINAL - INICIAÇÃO CIENTÍFICA
PROJETO: PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA E BIOLÓGICA DA FLORA
DA MICRORREGIÃO DE ITAPETINGA-BA
SUBPROJETO : ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS DE TALISIA ESCULENTA
(PITOMBA)
Bolsista CNPq: REBECA BASTOS SILVA Período do Relatório: 01/08/2008 a 31/07/ Orientador: Prof. Dr. RONAN BATISTA
ITAPETINGA – BA
JULHO DE 2009
Título : ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS DE TALISIA ESCULENTA (PITOMBA).
Por: Rebeca Bastos Silva
Relatório apresentado à Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia como parte das exigências do Programa Institucional de Bolsa de Iniciação Científica (PIBIC).
ITAPETINGA – BA
JULHO DE 2009
1. RESUMO
Este trabalho objetivou um novo estudo fitoquímico da planta Talisia esculenta (Pitomba), uma espécie da família Sapindaceae encontrada na microrregião de Itapetinga-BA, buscando-se avaliar as atividades biológicas dos extratos, frações e compostos químicos isolados desta planta. Os extratos utilizados nesta pesquisa foram decorrentes de processos preliminares de extração das partes aéreas de T. esculenta obtidos por percolação [extrato etanólico ( EETE )] , e por partição [extrato de acetato de etila ( EAETE )], realizados pela bolsista anterior deste subprojeto. O presente relatório descreve o fracionamento do Extrato Acetato de Etila ( EAETE ) e relata um novo tratamento e fracionamento cromatográfico do EETE , sendo que tal extrato foi previamente decerado (Extrato Etanólico Decerado, EED ) e então submetido à Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG), originando as frações hexânica ( EEDFH ), diclorometânica ( EEDFD ), acetato de etila ( EEDFAE ) e metanólica ( EEDFM ), sendo o EEDFD e o EEDFAE submetidos a sucessivas etapas de cromatografia em coluna de sílica-gel. Ao final, originaram-se frações que, ao serem analisadas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), corresponderam a substâncias puras que foram, por sua vez, encaminhadas às análises espectrométricas rotineiras, a fim de se elucidar suas estruturas. Os extratos brutos hexânico ( EHTE ), clorofórmico ( ECTE) , acetato de etila ( EAETE ) e etanólico ( EETE ) de T. esculenta , obtidos em trabalho anterior, não apresentaram citotoxidade frente à Artemia salina e, até a concentração máxima de 1000 μg/mL, mostraram-se inativos em ensaios in vitro contra Staphylococcus aureus , Escherichia coli e Candida albicans , revelando não possuírem, também, atividade antimicrobiana promissora.
2. APROVAÇÃO DO ORIENTADOR
Projeto: PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA E BIOLÓGICA DA FLORA DA MICRO-REGIÃO DE ITAPETINGA-BA.
Discente: REBECA BASTOS SILVA
RELATÓRIO APROVADO.
Prof. Dr. RONAN BATISTA
- Orientador -
“Prospecção fitoquímica e biológica da flora da microrregião de Itapetinga-BA” visando o estudo fitoquímico e biológico de espécies vegetais ocorrentes na região, a fim de contribuir com o conhecimento desta biodiversidade regional e com sua futura exploração sustentável. A espécie T. esculenta (Sapindaceae) é uma planta facilmente encontrada nas imediações do município de Itapetinga. Por ser uma espécie ainda sem nenhum estudo fitoquímico descrito na literatura, tornou-se oportuna para ser investigada. Em relatório anterior (2007-2008), esta espécie foi estudada por uma discente do curso de Engenharia de Alimentos, mas os resultados não foram conclusivos nem promissores, uma vez que os constituintes químicos isolados naquela oportunidade foram, em sua maior parte, constituídos por ácidos graxos e gorduras. O objetivo desse subprojeto é a continuação do estudo fitoquímico de T. esculenta , através de uma nova abordagem fitoquímica com a avaliação de novas atividades biológicas de seus extratos, frações e compostos químicos isolados.
4. REVISÃO DA LITERATURA
A espécie T. esculenta , também conhecida como “pitomba” ou “pitombeira”, não tem grandes exigências quanto ao solo. Originária da parte ocidental da Amazônia habita as matas de terra firme ao redor de Manaus (AM), assim como as capoeiras ralas do Amazonas, Pará, Maranhão, Ceará, Paraíba, Bahia, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Pernambuco e a mata pluvial do Paraná [6]. É também adaptada aos cerrados e cerradões de Mato Grosso e Goiás, e é encontrada por quase todo o Brasil em estado nativo, silvestre ou em cultivo. Árvores de 5-15m de altura (raramente arbustos), muito frondosas, florescem durante os meses de agosto-outubro e a maturação dos frutos ocorre a partir daí, sendo mais pronunciada nos meses de janeiro-março, dependendo da região. Foram encontrados poucos trabalhos na literatura que descrevessem estudos relacionados com a espécie T. esculenta. Segundo Guarim-Neto e colaboradores [6], o chá das sementes é utilizado para amenizar os problemas de desidratação. Por outro lado, o chá das folhas é indicado para as “dores de cadeira” e para os problemas renais. Em 1999, a bioquímica Maria Lígia Macedo extraiu uma lectina da semente do fruto da pitomba que reduziu em 60% o crescimento de duas espécies de fungos ( Fusarium oxysporum que ataca folhas de cana-de-açúcar, e Colletotrichum lindemuthianum causador da antracnose), e matou quase a totalidade dos besouros que danificam tanto as plantas quanto grãos armazenados. Suspeita-se que essa proteína impeça o crescimento desses organismos ao se combinar com outra molécula chamada quitina, principal componente da parede celular dos fungos. Ao reagir com a quitina, causaria alterações que inviabilizariam o crescimento das hifas. No caso dos insetos, parece inibir a ação de enzimas digestivas que contêm açúcar em sua composição e se ligar a uma estrutura conhecida como peritrófica, que recobre internamente o intestino desses insetos e é rica em quitina, causando um desequilíbrio na absorção de nutrientes [7].
5. METODOLOGIA APLICADA
5.1. Extrato acetato de etila obtido em trabalho anterior (EAETE) [11]
O Extrato de acetato de etila da T. esculenta (EAETE ) de massa igual a 0,9956 g foi submetido à Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG), para o preparo da mesma foi utilizado diclorometano e sílica comum. Utilizando-se como eluentes, diclorometano, acetato de etila, álcool metílico e respectivas misturas dos mesmos. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 1. Foram coletadas 140 frações em frascos de vidro previamente pesados. Realizou-se a pesagem de cada uma das frações coletadas após dois dias decorridos, para que todos os eluentes evaporassem, a fim de obter-se o peso real da amostra de cada fração.
Tabela 1 – Frações obtidas da CCSG do EAETE com seus respectivos eluentes
Frações Eluente Volume 1 - 10 Diclorometano 200 ml 11 - 27 Diclorometano - Acetato de etila (50:50) 200 ml 28 - 53 Acetato de etila 200 ml 54 - 67 Acetato de etila – Álcool metílico (95:05) 200 ml 68 - 77 Acetato de etila – Álcool metílico (90:10) 200 ml 78 - 93 Acetato de etila – Álcool metílico (80:10) 200 ml 94 - 112 Acetato de etila – Álcool metílico (50:50) 200 ml 113 - 140 Álcool metílico 350 ml
As frações coletadas na cromatografia em coluna da fração EAETE foram analisadas por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), a fim de que fosse possível o agrupamento das frações semelhantes. A eluição cromatográfica possibilita que a composição das frações possa ser comparada através da migração diferencial dos componentes químicos sobre uma camada delgada de adsorvente retido (sílica-gel) sobre uma superfície plana (placa). A revelação das placas foi feita pela nebulização de uma solução de sulfato cérico a 4% em água, preparada conforme metodologia descrita na literatura [12], seguida de aquecimento em placa aquecedora.
5.1.1. Fracionamento cromatográfico da fração AE-B coletada da CCSG do EAETE O agrupamento denominado AE-B (frações 29-35) da CCSG do EAETE , foi submetido à coluna cromatográfica flash para melhor separação de suas substâncias, a massa de tal amostra foi de 53,1 mg. Foram obtidas 22 frações de tal coluna, sendo acetato de etila e metanol em diferentes proporções os eluentes utilizados. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 2. As amostras foram analisadas por CCD.
Tabela 2 – Frações obtidas do agrupamento AE-B da CCSG do EAETE com seus respectivos eluentes.
Frações Eluente Volume 1-9 Acetato de etila – metanol (99:01) 200 ml 10-16 Acetato de etila – metanol (95:05) 100 ml 17-22 Acetato de etila – metanol (90:10) 100 ml
Tabela 3 - Frações obtidas da CCSG do EEDFD com seus respectivos eluentes.
Frações Eluente Volume 1-8 Hexano 100 ml 9 – 22 Hexano - Acetato de etila (99:01) 200 ml 23 – 40 Hexano – Acetato de etila (98:02) 200 ml 41 – 60 Hexano – Acetato de etila (95:05) 300 ml 61 – 70 Hexano – Acetato de etila (90:10) 200 ml 71 – 75 Acetato de etila 100 ml 76 – 80 Álcool metílico 100 ml
5.2.3. Fracionamento cromatográfico da fração 62-67 do EEDFD As amostras de números 62, 63, 64, 65, 66,67, por apresentarem um perfil parecido quando aplicadas nas plaquinhas, foram agrupadas em um único frasco, sendo a massa dessa junção igual a 55 mg. Tal amostra ( Figura 1 ) foi então fracionada por CCSG, utilizando em seu preparo hexano e sílica flash. Os eluentes utilizados foram hexano, acetato de etila, e misturas destes de polaridade crescente. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 4. Foram coletadas 37 frações em frascos de vidro previamente pesados e identificados. E Procedeu- se com a análise de tais amostras por CCD.
Figura 1 – Plaquinha após revelação em sulfato cérico da fração 62-67.
Tabela 4. Frações obtidas da CCSG do EEDFD , fração 62-67 com seus respectivos eluentes.
Frações Eluente Volume 1 Hexano 50 ml 2 – 3 Hexano - Acetato de etila (98:02) 50 ml 4 – 7 Hexano – Acetato de etila (95:05) 150 ml 8 – 10 Hexano – Acetato de etila (90:10) 100 ml 11 – 14 Hexano – Acetato de etila (88:12) 100 ml 15 – 21 Hexano - Acetato de etila (85:15) 50 ml 22 - 31 Hexano – Acetato de etila (80:20) 100 ml 32 – 35 Hexano – Acetato de etila (50:50) 50 ml 36 - 37 Acetato de etila 20 ml
5.2.4. Fracionamento cromatográfico da fração nº 72 do EEDFD Por análise em CCD das frações do EEDFD , foi observado que a fração nº 72 (0,1567 g) apresentava, por CCD, manchas interessantes e de fácil separação (Figura 2), sendo tal fração então submetida a um novo fracionamento em CCSG flash. Os eluentes utilizados em tal processo foram misturas de hexano e acetato de etila em proporções gradativamente mais polares. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 5. Foram coletadas 40 frações em frascos de vidro previamente pesados. E procedeu-se com o agrupamento e identificação dos mesmos por CCD.
Foram coletadas 80 frações em frascos de vidro previamente pesados e identificados. E Procedeu-se com a análise de tais amostras por CCD.
Tabela 6 - Frações obtidas da CCSG do EEDFAE com seus respectivos eluentes. Frações Eluente Volume 1-9 Hexano 250 ml 8 – 10 Hexano - Acetato de etila (90:10) 100 ml 11 – 17 Hexano – Acetato de etila (80:20) 100 ml 18 – 24 Hexano – Acetato de etila (70:30) 100 ml 25 – 31 Hexano – Acetato de etila (50:50) 100 ml 32 – 35 Hexano - Acetato de etila (30:70) 100 ml 36 – 42 Acetato de etila 100 ml 43 – 60 Acetato de etila – Álcool metílico (50:50)
200 ml
61 – 70 Álcool metílico 100 ml
5.3. Ensaios biológicos
5.3.1. Avaliação da atividade citotóxica contra Artemia salina Foi realizado o bioensaio de toxidade em A. salina com quatro amostras de extratos brutos de T. esculenta : extratos de hexano ( EHTE) , clorofórmio ( ECTE) , acetato de etila (EAETE) e etanol (EETE). O teste de atividade citotóxica contra A. salina é um ensaio preliminar, e um resultado positivo nesse teste indica uma atividade potencialmente antitumoral e/ou tripanossomicida do extrato [13]. A atividade citotóxica é medida através do número indivíduos mortos e vivos de A. salina , a uma determinada concentração de extrato.
5.3.2. Avaliação da atividade antimicrobiana contra bactérias e levedura Amostras dos extratos hexânico ( EHTE) , clorofórmico ( ECTE) , acetato de etila ( EAETE ) e etanólico ( EETE ) foram submetidos à avaliação da atividade antimicrobiana contra as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli , e contra a levedura Candida albicans , utilizando-se o método de diluição in vitro para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Os métodos de diluição in vitro detectam possíveis atividades antimicrobianas de compostos, utilizando métodos celulares sem alvo específico. O ensaio para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) é obtida através da macrodiluição que consiste em se preparar diluições sucessivas do antimicrobiano a ser testado, em meios de cultura sólidos ou líquidos, semear a bactéria ou fungo em estudo e após incubação verificar a menor concentração (maior diluição) do antimicrobiano que inibiu o crescimento do microrganismo. Determina-se a CIM, como sendo a menor concentração que inibe o crescimento do microrganismo. Este método apresenta a vantagem de ser quantitativo, podendo ser usado, tanto para amostras hidrossolúveis, como lipossolúveis [14].
(CCS
Figura 4 – Fracionamento cromatográfico do Extrato Etanólico de T. Esculenta (EETE).
6.2. Ensaios Biológicos
6.2.1. Avaliação da atividade citotóxica em Artemia salina O bioensaio com A. salina foi realizado com os extratos de hexano, clorofórmio, acetato de etila e etanol. Quanto maior o número relativo de mortos em uma dada concentração de extrato, maior a atividade citotóxica do mesmo. Os extratos brutos foram testados nas concentrações de 125, 250 e 500 μg/mL. O ensaio foi realizado em triplicata. As Tabelas 7, 8, 9, 10 mostram as quantidades de indivíduos vivos e mortos após o tratamento com uma determinada concentração dos extratos de T. esculenta analisados. Os valores da concentração letal para 50% dos indivíduos
EEDFH 0,1458 g
EEDFAE 2,0 g
EEDFD 0,7045 g
EEDFM 18,1105 g
DD-A 14,7 mg
DD-B 9,6 mg
DD-DB 2,7 mg
DD-E 31,1 mg
DD-C 30,0 mg
DD-DA 3,6 mg
DAC-A 3,7 mg
DAC-B 9,3 mg DAC-C 1 2,1 mg DAC-C 2 8,7 mg
EED 19,658 g
EETE 20,21 g (Deceração com Metanol)
(CCSG)
(CCSG) (CCSG)
(CL 50 ) de cada extrato foram obtidos com auxílio do software estatístico SAEG que contém o delineamento conhecido como “PROBITO”, capaz de calcular a CL 50 destes tipos de dados.
Tabela 7 – Quantidades de indivíduos vivos e mortos após tratamento com o extrato de acetato de etila.
Repetição
125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml Mortas Vivas Mortas Vivas Mortas Vivas CL 50 1 1 33 0 49 2 39 2 1 50 1 38 1 40 Ø 3 0 39 1 43 2 47
Tabela 8 – Quantidades de indivíduos vivos e mortos após tratamento com o extrato etanólico.
Repetição
125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml Mortas Vivas Mortas Vivas Mortas Vivas CL 50 1 1 56 4 30 0 24 2 0 27 0 36 6 22 3966, 3 1 31 1 15 3 27
Tabela 9 – Quantidades de indivíduos vivos e mortos após tratamento com o extrato hexânico.
Repetição
125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml Mortas Vivas Mortas Vivas Mortas Vivas CL 50 1 0 22 0 49 3 44 2 0 38 3 38 14 64 15981, 3 1 26 20 12 0 38
