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Ácido desoxirribonucleico de cinetoplasto. mRNA: RNA mensageiro. mTOR: Mammalian target of rapamycin (alvo da rapamicina em mamíferos).
Tipologia: Exercícios
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INFECTADOS PELO Trypanosoma cruzi.
INFECTADOS PELO Trypanosoma cruzi.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Imunologia e Parasitologia. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida de Souza Coorientador: Prof. Dr. Claudio Vieira da Silva
As minhas filhas Maria Julia, Vitória Sophia e Isabella, e a minha esposa pelo tempo que deixamos de estar juntas... À minha mãe Vilma, pelos ensinamentos dos valores da vida... À minha irmã Priscylla pelo companheirismo e amizade... Dedico
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida de Souza e ao meu coorientador Prof. Dr. Claudio Vieira da Silva pela confiança, pelo constante incentivo ao crescimento profissional e pelas inúmeras possibilidades oferecidas. À doutoranda Rebecca Tavares e Silva Brígido pela constante ajuda e apoio em todo trabalho, sem você não seria possível desenvolver esse trabalho. A todos aqueles que estiveram comigo no laboratório, meus amigos, minha família LATRI, pela agradável convivência e aprendizagem diária. Ao querido Marlus, meu amigo e mestre, pelos ensinamentos e paciência. A todos os laboratórios da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) que cooperaram com o desenvolvimento do projeto por meio de troca de materiais e do uso de equipamentos, e aos seus alunos e funcionários. Agradeço aos colegas, professores do Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia. Agradeço às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia Aplicadas do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia pela paciência e constante ajuda. Ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado para o desenvolvimento deste estudo. E, acima de tudo, a Deus por me iluminar e dar força para lidar com as dificuldades.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..................................................................Vlll
3.7 A INFECÇÃO DE T. cruzi EM MIOBLASTO INDUZ O AUMENTO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE TFEB, DISFERLINA, E ASM NOS TEMPOS POSTERIORES DA CINÉTICA DE INVASÃO. ............................................... 42 3.8 A INIBIÇÃO DA MTOR PROMOVE A DIMINUIÇÃO DA TAXA DE INFECÇÃO EM MIOBLASTOS ....................................................................... 43 3.9 TRATAMENTO COM RAPAMICINA ALTERA A EXPRESSÃO GÊNICA DE ANEXINA A2, TFEB E ASM DURANTE A INFECÇÃO DE MIOBLASTO. ..... 44 4 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 47 5 CONCLUSÕES ................................................................................................... 52 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53
μg: Micrograma μL: Microlitro μM: Micromolar ASM: enzima esfingomielinase ácida AXNA1: Anexina- A AXNA2: Anexina-A C2C12: Células musculares Ca2+: Molécula de Cálcio CO 2 : Gás Dióxido de Carbono CT: Cycle Threshold- Ciclo limiar de quantificação DC: Doença de Chagas DMEM: Meio Eagle Modificado por Dulbecco DNA: Ácido desoxirribonucleico dNTP: Desoxirribonucleotídeos Fosfatados dUTP: Desoxinucleotídeo EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético F-actina: Filamentos de actina Fw: Forward primer g: G-force Gal-1: Galectina- Gal-3: Galectina- GAPDH: Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)- 1 - piperazineethanesulfonic acid) kDNA: Ácido desoxirribonucleico de cinetoplasto mRNA: RNA mensageiro mTOR: Mammalian target of rapamycin (alvo da rapamicina em mamíferos) ng: Nanograma nM: Nanomolar
PBS: Solução salina tamponada com fosfatos pH 7, PCR: Reação em cadeia da polimerase qPCR: PCR quantitativo em tempo real R^2 : Coeficiente de regressão linear RT-qPCR: Reação de transcrição reversa, seguida da PCR Rw: Reverse primer SFB: Soro fetal bovino TFEB: Fator de transcrição EB TM: Temperatura de Melting VERO: BLAST: ΔΔCt: μM: GAPDH: AE:
Fibroblastos de rim de macaco verde da África Basic Local Alignment Search Tool Metodo Delta, Delta Ct Microlitro Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase Amastigotas Extracelular
Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, one of the most neglected tropical diseases. It is estimated that about 11 million people worldwide are infected with T. cruzi, about 6 million to 7 million people are estimated to be infected worldwide. During the molecules invasion process of the parasite and host interact allowing the signal transduction and modulation gene expression in response to invasion. The diversity of proteins and pathways triggered to repair wounded plasma membrane turned our attention to investigate the impact of T. cruzi infection in gene expression of Dysferlin, ASM, TFEB, Galectin 1 and 3, Annexin 1 and 2, by murine myoblasts. Thus we analyzed the expression of genes by quantifying the relative and parasitic load by real-time PCR. We conclude that our study found increased Dysferlin gene expression, ASM and TFEB during the invasion, kinetics for two hours by T. cruzi Y strain in myoblasts. Moreover treatment with Rapamycin inhibited mTOR signaling pathway, decreased cellular internalization and negatively regulating the expression of TFEB, ASM and Annexin A2 in myoblasts treated and infected as compared to myoblasts untreated with Rapamycin and infected. Our results show that during cell invasion by T. cruzi , host cell gene expression is modulated in response to the damage generated by the parasite.
Key words: T. cruzi Y strain, gene expression, myoblasts, membrane repair, cell infection
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vida. A forma replicativa no hospedeiro invertebrado é a epimastigota (Figura 1 B), com aproximadamente 20 μm de comprimento, se caracteriza por sua forma alongada (fusiforme), cinetoplasto discóide disposto anteriormente ao núcleo e com o flagelo livre surgindo da região anterior. A amastigota é uma forma replicativa (intracelular) e infectiva (extracelular), no hospedeiro vertebrado (Figura 1 A), são células com aproximadamente 2 a 5 m de diâmetro, com formato arredondado e flagelo bem curto. Os tripomastigotas (Figura 1 C) são formas infectantes, tanto para o hospedeiro vertebrado como para o hospedeiro invertebrado. Esta forma evolutiva é não replicativa, medindo aproximadamente 25 μm de comprimento, alongada com cinetoplasto arrendondado, posterior ao núcleo e flagelo, que percorre externamente toda extensão de seu corpo (BRENER, 1973; SOUZA, DE, 1984, 1999; TEIXEIRA et al., 2011). O desenvolvimento de um estágio a outro é um processo complexo, envolvendo mudanças estruturais, antigênicas e fisiológicas, estando estas alterações sob comando de genes específicos (SANTOS, DOS et al., 2009; ARAÚJO et al., 2009; PEREIRA; NAVARRO, 2013).
Figura 1: Formas evolutivas do Trypanosoma cruzi. (A) Amastigostas, (B) Epimastigotas e (C) Tripomastigotas. Figura : Paula Brigído.
O parasita pode ser transmitido vetorialmente, congenitamente, em acidentes laboratoriais, transfusão sanguínea, transplante de órgãos e mais recentemente descrito, por via oral (CEVALLOS; HERNÁNDEZ, 2014; MARTINS-MELO et al., 2014). Levando em consideração a transmissão vetorial, o ciclo (Figura 2) inicia-se quando o inseto vetor suga o sangue do hospedeiro contendo formas
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tripomastigotas sanguíneas, que se modificam em formas epimastigotas no sistema digestório do inseto, onde se multiplicam intensamente, migram para a parte posterior do trato digestório do inseto e se transformam em formas tripomastigotas metacíclicos. Quando o inseto pica um novo vertebrado transmite essas formas infectantes pelas fezes e urina depositadas no local da picada. Posteriormente, estas formas evolutivas penetram pela pele lesada ou pelas mucosas, invadem células de vários tecidos e se transformam em amastigotas. Essas irão se multiplicar e se diferenciar em tripomastigotas que serão liberados, após o rompimento da célula hospedeira. As formas tripomastigotas liberadas migram para corrente sanguínea podendo invadir outras células ou serem sugados novamente pelo inseto vetor (ANDREWS et al., 1990; KOLLIEN; SCHAUB, 2000; HERNÁNDEZ-OSORIO et al., 2010; SOUZA, DE et al., 2010). Uma alternativa de sub-ciclo pode ocorrer envolvendo formas amastigotas procedentes da lise prematura das células infectadas, chamadas amastigotas intracelulares (HUDSON et al., 1984; CARVALHO; SOUZA, 1986) ou formas amastigotas extracelulares decorrentes de diferenciação extracelular de tripomastigotas (ALVES; MORTARA, 2009).
Figura 2: Representação esquemática do ciclo de vida do protozoário flagelado Trypanosoma cruzi****. Figura : Paula Brígido
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citoesqueleto de actina e exocitose de lisossomos (MACHADO et al., 2000; MARTINELLI et al., 2006; MARTINS et al., 2011; MAEDA et al., 2012). ANDREWS, (2002) destaca a importância dos rearranjos do citoesqueleto de actina cortical da célula hospedeira para o recrutamento e fusão dos lisossomos no sítio de invasão do parasita. Devemos levar em consideração que os lissosomos não são apenas organelas de degradação e geração de lixo intracelular, eles também são grandes responsáveis pelo reparo da membrana celular, por meio da exocitose lisossômica desencadeada por Ca+2. Assim, quando membranas celulares sofrem danos, os lisossomos, são recrutados para se fundir ao revestimento da célula, reparando a lesão (REDDY et al., 2001; JAISWAL et al., 2002; GULBINS; KOLESNICK, 2003b; DEFOUR et al., 2014; SCHEFFER et al., 2014). Um estudo complementa a participação do lisossomo durante a invasão do parasita, os autores destacam que a fusão gradual dos lisossomos com o vacúolo parasitóforo evita o escape do parasita da célula hospedeira e promove sua permanência intracelular (ANDRADE; ANDREWS, 2004). Recentemente tem sido demonstrado que a resposta dos lisossomos para os sinais fisiológicos são regulados pelo fator de transcrição EB ( TFEB ). TFEB é um gene regulador mestre da biogênese lisossômica e da autofagia, conduz à geração de novos lisossomos, induz a ancoragem, a fusão de lisossomos com a membrana plasmática e o aumento do número de autofagossomos em uma variedade de tipos de células (SARDIELLO et al., 2009; SETTEMBRE et al., 2011; SETTEMBRE; BALLABIO, 2011). Alguns pesquisadores descobriram que TFEB interage com o alvo da rapamicina de mamíferos (mTOR), uma quinase localizada nos lisossomos que se associa a TFEB e funciona como um mecanismo de controle lisossomal e participa do processo de biogênese de lisossomos (Figura 3 B). (ZONCU et al., 2011; CORTEZ et al., 2015). Diversos trabalhos demonstram a atividade de TFEB como fundamental para o estabelecimento do parasita na célula hospedeira por meio de funções como exocitose de lisossomo (fagossomo e extracelular), reparo de membrana e autofagossomo (SARDIELLO et al., 2009; SETTEMBRE; BALLABIO, 2011; SPAMPANATO et al., 2013). Recentemente outros trabalhos revelaram que durante a invasão celular pelo parasita, a célula promove a exocitose dos lisossomos liberarando a enzima lisossomal esfingomielinase ácida (ASM) (KOVAL; PAGANO, 1991; FERNANDES;
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CORTEZ; FLANNERY; TAM; MORTARA, R. A.; et al., 2011). A ASM cliva a foscoricolina da esfingomielina, um abundante esfingolipídeo presente na parte externa da membrana plasmática e induz à formação de outra molécula da membrana, a Ceramida (Figura 3 C). A Ceramida é responsável por remover a região lesionada e reparar a membrana (HOLOPAINEN et al., 2000; GULBINS; KOLESNICK, 2003a; BLITTERSWIJK, VAN et al., 2003; GRASSMÉ et al., 2007; TRAJKOVIC et al., 2008), esse processo facilita a invasão do parasita. Células musculares são particularmente especialistas no processo de reparo de membrana durante a lesão da membrana plasmática. Durante o ciclo de vida de músculo estriado, o processo de reparação da membrana é essencial para a manutenção da integridade celular (GLOVER; BROWN, 2007). A degeneração de células do músculo pode levar à necrose do tecido, devido à substituição do músculo pelos tecidos fibroso e adiposo (HAN et al., 2007). Uma proteína que vem sendo associada à reparação da membrana de células musculares é a Disferlina (HAN et al., 2007). A Disferlina é uma proteína ancorada a membrana que está envolvida no reparo da membrana, sua ausência ou expressão reduzida está envolvida em doenças neuromusculares como a Miopatia de Miyoshi (MATSUDA et al., 2015). Em um papel direto a Disferlina pode permitir a sobrevida de uma célula lesionada, o influxo de Ca+2^ por meio de uma ruptura da membrana plasmática desencadeia a fusão de membranas mediada por disferlina selando a lesão (Figura 3 D) (BANSAL et al., 2003; LENNON et al., 2003a; MCNEIL; KIRCHHAUSEN, 2005; GLOVER; BROWN, 2007).
