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Tema 1: ACTUALITZACIÓ DE CONFORMACIÓ
DE PROTEÏNES
Conformación: posición de muchos átomos entre ellos. Dimecres 01/10/ Átomos cercanos: estructura secundaria. Átomos lejanos: estructura terciaria. Estructura molecular de las proteínas: Una proteína es una secuencia de aminoácidos, que son los que le otorgan sus propiedades. Características aminoácidos:
- (^) Polaridad: tenemos dos tipos:
- Polares, que son hidrofilicos.
- Apolares, que son hidrofobicos. Estos se dividen en dos:
- Alifáticos: cadenas hidrocarbonadas largas.
- Aromáticos: tienen anillos.
- (^) Carga: positivo, negativo o neutro.
- Tendencia a adoptar una cierta estructura secundaria:
- Hélice α (ala, leu…)
- Hoja β (Val, ile…) Métodos de estudio de la estructura que adoptan los aminoácidos:
- Cristalografía (en cristal): Rayos x o bien sincrotón.
- Resonancia magnética nuclear (RMN): nos permite ver la estructura de la proteína en secuencias de aminoácidos pequeños (hasta 200 residuos). No necesitamos cristal como en el método anterior.
- Volumen: el aa más grande que encontramos es el triptófano y el más pequeño la glicina. El volumen tenemos que tener-lo en cuenta al momento de hacer modificaciones en una secuencia, porque no podremos poner un triptófano donde teníamos una glicina porque no va a caber. Para hacer sustituciones también tenemos que observar la afinidad con el agua i la carga.
- (^) Reactividad: depende de los grupos de cargas libres que presente el aa. El más reactivo es la cys y lo siguen la His y la Arg.
- Frecuencia: cantidad de un aa en una proteína.
- Poco frecuentes: trp (porque es muy grande. Suelen ir bien para la estabilización del centro de la proteína); cys (es muy reactivo); met (aa iniciador y reactivo); his (reactivo).
- Muy frecuentes: leu y ala (porque adoptan la posición hélice α, la más freciente). Podemos representar la frecuencia en una gráfica –frecuencia vs nº de codones-, ya que se sigue una regresión muy buena. El único aa que se sale de la recta es la Arg.
Proteínas:
- Tamaño:
- Proteínas monopeptídica (1 sola cadena), en general entre 20-80KDa. !!!media de peso molecular por aa=115Da!!! Si tienen menos de 20 es peligroso porque no tienen suficiente superficie para ser reconocidas, transportadas y reguladas. Y si tienen más de 80 es peligroso porque el riesgo a equivocarse y tener que destruirlas es mayor.
- Si son más grandes de 80 KDa, estructura cuaternaria.
- Excepciones:
c. Señales de localización intracelular/extracelular. d. (^) Señales de vida media: viene a ser la regularidad, que funcionen cuando toca. Indican vida media corta: i. Señal varshavsky: aa grandes en la zona N-terminal. Suelen tener funciones reguladoras. ii. (^) Parches hidrofóbicos: indican degradación por proteasas. iii. Ubiquitinación: solo en eucariotas. Señal para que la proteína sea degradada al proteaosomes. iv. Secuencias PEST: prolina glutamico serina tronina. e. Modificaciones post-traduccionals (PTMs): derivaciones específicas de secuencia. Pueden ser sencillas (una fosforilación) o complejas (glucosidaciones). El número estimado de PTMs es entre 150-200 modificaciones (suelen ser covalentes y reversibles). Para estudiar los PTMs se clonan en microorganismos o se extraen de tejidos. En procariotas las modificaciones son menos frecuentes que en eucariotas. f. Alosterismo: moduladores que pueden ser + o – (ATP, ADP…) g. Interacción: las diferentes interacciones pueden provocar distintas reacciones. Interacción proteína-proteína, proteína-hormona, proteína-lípido…, interaccionan y se produce un cambio de función o se inicia una función.
Conformación:
Paradoja Levinthal:
El enlace peptídico tiene carácter medio planar (no puede girar entre C). Tiene dos ángulos de torsión alrededor del C alfa, aunque depende de sus interacciones (Van der Waals…) para determinar el giro – si chocan no pueden girar-.
Levinthal quiso cuantificar el número de conformaciones que podría adoptar una proteína. Partiendo del hecho que existen tres conformaciones: alfa, beta y rc (random coin) –ahora se conocen más, pero cuando se hizo la paradoja solo se tenia conciencia de 3-, y dos ángulos: phi i psi dedujo: 32n^ = 10 n^ (aproximadamente). 10 n^ es una subestimación porque en realidad hay más ángulos. Un enlace covalente sencillo puede adoptar 10 13 conformaciones/segundo, aunque es una sobreestimación porque para afirmar esto solo tenemos en cuenta la cadena principal, y no nos fijamos en las cadenas laterales. El movimiento está limitado por “choques estéricos” las cadenas laterales y otros enlaces chocan y limitan el movimiento del enlace. Un ejemplo típico de choque es el que se da entre el oxigeno carbonílico y el hidrogeno amida. Incluso con esos errores: Formula: . Si n=100 (proteína pequeña). Donde t es el tiempo que tarda una proteína en probar todas sus conformaciones Es imposible que una proteína tarde tanto en probar todas las conformaciones antes de elegir una, por lo tanto, existen unas vías de plegamiento que dirigen el plegamiento hacia AGº menor (más estable) para adoptar la estructura nativa (la que es funcional). Vías de plegamiento:
Niveles de estructuración: Dilluns 06/10/
- Estructura primaria. Secuencia de aa.
- Estructura secundaria: alfa, beta, loop o turn.
vuelta hace 5,4 A i 3,6 residuos por vuelta. Formada por L-aa, si fueran D-aa tendríamos la imagen especular y la encontraríamos a la segunda mitad del diagrama de Ramachandran. Cada “i”, i+4 se forma un puente de hidrogeno, es decir que veremos puentes entre el residuo 1 y 4, entre el 4 y el 8…. La distancia de Van Der Vals interna es optima (no choca nada y no sobra espacio para el agua). Las cadenas laterales quedan radicales (hacia afuera), esto nos da dos ventajas:
- No obra tanta repulsión de cargas.
- Evita interacciones estéricas (choques). Las proteínas hélix alfa suelen tener 3 vueltas (hay de menos y de más, pero es una mediana). Son cortas porque así es más fácil empaquetarlas. Si deben travesar membrana son de 5 vueltas. Hay una excepción que es de 17 vueltas. A veces podemos encontrar moléculas amfipáticas, tienen una parte toda hidrofóbica y otra parte toda hidrofílica. Es una estructura que favorece mucho el plegamiento. No obstante es más común en hojas beta.
- Hoja beta: más o menos constituye el 20% de las estructuras secundarias. Tenemos dos tipos, la paralela (del N-terminal al C-terminal + algo para hacer el giro y de N-terminal a C-terminal de nuevo) y la antiparalela (del N-terminal al C-terminal + giro + del C-terminal al N-terminal). Los puentes intercatenarios, es decir entre distintas cadenas (no obstante, no implica que sean distintas secuencias). Las hojas beta normalmente están formadas por una mediana de 6 cadenas y cada cadena por una mediana de 6 residuos, esto minimiza al máximo la repulsión de cargas. La antiparalela es más frecuente porque tiene los puentes de hidrogeno rectos. Las cadenas laterales se encuentran en forma alternada, primero una hacia afuera del plano (residuo hidrofílico) y después otra hacia adentro (residuo hidrofóbico), esto favorece mucho su empaquetamiento. Entre dos cadenas
laterales tenemos 7 A. Esta distancia evita choques y minimiza la repulsión de cargas. La molécula puede ser amfipática, significa que tenemos dos regiones la polar y la apolar, esto lo conseguimos según como ponemos los residuos.
- Irregulares:
- Loops o lazos: suelen ser el 15% de las estructuras secundarias. Sirven para conectar estructuras secundarias y pueden estar conectando también proteínas multidominio. Tienen aa polares es decir que son accesibles al solvente. Tienen proteólisis limitada: pones pocas proteasas y nos va a separar la zona más fácil, las loop, así tendremos los dos dominios separados. Si ponemos demasiada proteasa nos va a romper también los dominios. Los loops son muy flexibles para poder interactuar fácilmente (por ejemplo antígeno-anticuerpo). Ayudan también a compactar. El loop es la región más antigénica de las proteínas y los solemos ver en los centros activos de los enzimas, ya que unen biomoléculas. Son clasificables. Destacamos el loop omega (denominado así por su forma) que tiene una interacción de menos de 10 A. Además los loop pueden unir calcio. Son lugares de interacción proteína-proteína, pueden ser un punto de regulación alostérica, y podemos encontrar loops hacia adentro en vez de la superficie ya que tienen un anillo aromático.
- Turns: suelen ser el 12% de las estructuras secundarias. Conectan cadenas beta antiparalelas –las paralelas no pueden porque hay demasiada distancia- (aunque hay alguna excepción, como la HTH F 0E 0son hélice alfa unidas por turns). Suelen ser polares y están formados por 4 residuos anclados por un puente de hidrogeno (i, i+3). El tercer residuo suele ser una glicina, ya que es muy flexible y permite una acomodación perfecta al puente de hidrogeno. El segundo residuo
Dimec res 08/10/ Estructura terciaria (dominios y evolución molecular): el dominio es una estructura globular compacta. Dependiendo del tamaño de la proteína vamos a ver más o menos dominios. Cada dominio tiene (de mediana) entre 100 y 200 residuos. Suelen ser independientes en la función, no obstante hay interacción entre los diferentes dominio de una misma proteína. Los dominios suelen estar separados por loops y podemos separarlos mediante proteasa para poder obtenerlos y estudiarlos. Si queremos separarlos hasta obtener únicamente aa, hacemos una hidrólisis total con ácido clorhídrico. Se pueden separar los dominios por ET-SDS (electroforesis) i cromatografía. A los años 60 se vio que los genes eucariotas tenían axones e intrones, estos últimos ocupan mucho más que la secuencias exónicas. Los dominios de las proteínas corresponden a exones de la secuencia genética. Contra menos evolución más intrones observamos, pero estos se eliminan mediante el splicing. Siempre se había dicho que los procariotas no tenían intrones, pero hemos visto en los últimos años (gracias a la secuenciación de genomas) que algunos procariotas si que tienen intrones, especialmente en RNAr i RNAt.
- Exones: se piensa que los exones son genes ancestrales que se han duplicado muchas veces. Es un mecanismo de evolución más eficaz que la idea de ir haciendo mutaciones puntuales para conseguir una función determinada (como hacen la mayoría de microorganismos).
- Intrones: tenemos dos teorías para explicar su existencia:
- La temprana: en un inicio había muchos intrones para que se generara todo bien. Tal y como está todo bien formado van desapareciendo porque ya no son útiles. Los procariotas que vemos con intrones es porque aun están en proceso
de formación, pero este va a ir desapareciendo al igual que todos los intrones de los eucariotas.
- La tardía: los intrones han aparecido más tarde. Los científicos creen más en la teoría temprana, ya que los procariotas se reproducen más rápidamente y los intrones solo son un estorbo para ellos. Taxonomía (o clases estructurales) de los dominios:
- Clase I o todo alfa: tienen más del 50% de estructura alfa.
- Clase II o todo beta: tienen más del 30% de estructura beta i menos del 8% de alfa.
- Clase III o todo alfa más beta: tienen más del 30% de alfa y más del 20% de beta. Se encuentran ambas estructuras dispuestas al azar.
- Clase IV o alfa/beta: son igual que la clase III pero las secuencias están en orden.
- Clase V: no se consideran dominios perfectos, son proteínas pequeñas que cuasi no generan estructura secundaria. Forman puentes disulfuro, se unen a metales que les ayudan a compactarse, suelen tener muchos aa hidrofobicos… Cuando hay dominios las proteínas pueden ser de cualquier clase excepto de la V. No obstante los dominios catalíticos de los enzimas suelen ser de clase III. Las proteínas suelen ser multidominio, por lo tanto cada proteína tiene muchas clases de dominios. La combinación de los dominios estructurales se denomina Fold. El número de fold es determinado (1500-2000 folds). No todas las combinaciones de dominios son posibles, por eso hay un límite de números de folds. Esto sucede porque no todos los dominios son capaces de adaptarse bien (interactúan con otros y no se acomodan bien).
Estructura cuaternaria:
Métodos generales de purificación de proteínas: Podemos purificar las proteínas por varios mecanismos:
- Carga:
- Cromatografía de intercambio iónico.
- Cromatoenfoque: se usan anfolitos, es una técnica para visualizar.
- (^) Electroforesis nativa e iselectroenfoque (analítica).
- Polaridad:
- Cromatografía en fase reversa: es para abrir la cadena mediante las cargas (desnaturalizar). Va bien para trabajar con péptidos o proteínas multidominio. Una enzima cuando lo desnaturalizamos ya no consigue volver a su estado inicial.
- Cromatografía de interacción hidrofóbica: (no desnaturalitza). Añadimos sal a concentraciones elevadas, las cuales nos van a apantallar las cargas negativas, posteriormente eludimos con agua la cual se llevará la sal dejándonos las partes hidrofóbicas expuestas al soluble, cosa que ara que la proteína precipite.
- Cromatografía en papel y de adsorción (antígenos).
- Tamaño:
- (^) Cromatografía de gel filtración: contra más pequeña sea la proteína más tarde saldrá de la columna.
- Diálisis y ultrafiltración.
- Ultracentrifugación por gradientes.
- Electroforesis SDS (analítica).
- Especificidad:
- Cromatografía de afinidad: se pone un inhibidor para que se una con el enzima que queremos aislar (esta técnica se usaba antiguamente).
