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I. INTRODUCCION.
II. ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA PLASMATICA.
II. 1. Estructura II.1.1. Observaciones de cortes finos II.2.2. Observación de réplicas
III. COMPOSICION QUÍMICA
III.1. Estudio in situ
III.2. Aislamiento de fracciones
III.3. Analisis químico
III.4. Lipidos de membrana III.4.1.La bicapa lipídica III.4.2.Los glucolípidos III.5. Proteinas de membrana III.6. Carbohidratos de la membrana
IV. NATURALEZA DINAMICA DE LA MEMBRANA
IV.1. El eritrocito: un ejemplo de estructura de la membrana plasmática
V. ARQUITECTURA MOLECULAR DE LA MEMBRANA PLASMATICA. EL MODELO
DEL MOSAICO FLUIDO
LA MEMBRANA PLASMATICA
I. INTRODUCCION.
Las membranas celulares son cruciales para la vida celular. La membrana plasmática rodea a la célula, definiendo su extensión y manteniendo las diferencias esenciales entre el contenido de la célula y su entorno. Su existencia se sospechó antes de poder ser observada. Dado que por su pequeño grosor (unos 75 Å) no es visible con el microscopio óptico, únicamente se puede visualizar con el microscopio electrónico. La membrana supone una auténtica interfase que delimita a las células y actúa como un filtro altamente selectivo. Desde el punto de vista de la permeabilidad se dice que es una estructura semipermeable pues es permeable para algunas moléculas e impermeable para otras. Aquellas moléculas impermeables que es necesario introducir o expulsar de la célula necesitan sistemas de transporte a través de la membrana.
Fig1. Imágenes de una membrana celular: Micrografía electrónica de una MP de eritrocito humano en sección transversal.
A pesar de que tienen diferentes funciones, todas las membranas biológicas, en las células eucarióticas, comparten una estructura básica común : una finísima capa de moléculas lipídicas y proteicas, que se mantienen unidas fundamentalmente por interacciones no covalentes y que al microscopio electrónico se manifiesta como una doble capa oscura (osmiófila) delimitando una capa intermedia clara (osmiófoba); el concepto de "unidad de membrana" hace referencia a este patrón estructural común.
Las membranas celulares son estructuras dinámicas, fluidas , y la mayoría de sus moléculas son capaces de desplazarse en el plano de la membrana. Las moléculas lipídicas están dispuestas en
Cualquiera que sea el tipo celular, la membrana plasmática aparece siempre, en cortes de material fijado químicamente, formada por tres laminillas superpuestas. Una de las cuales, la más externa, posee un revestimiento fibroso más o menos notable. Observadas en las mismas condiciones, las otras membranas celulares (membranas del R.E., del Golgi, de las mitocondrias o de los cloroplastos) presentan la misma estructura caracterizada por la existencia de dos laminillas densas que difunden los electrones y están separadas por una laminilla clara menos difusora;
Fig.3 At high magnification, the filaments of the glycocalyx are 2.5 to 5 nm thick and may extend for 0.1 to 0.5 μm beyond the tips of the microvilli
Fig. 4 Intestinal epithelium of cat. The glycocalyx is exceptionally well developed on the brush border of intestinal absorptive cells
debido a esto y para resaltar el carácter tan generalizado de esta ultraestructura de las membranas, se habla de membrana unitaria , término introducido por Robertson en 1959.
II.2.2. Observación de réplicas .- Previa congelación ultrarrápida de células y empleando la técnica de criofractura, la observación de réplicas muestra que cuando la superficie de fractura pasa tangencialmente a la superficie de la célula, la membrana plasmática queda dividida por la mitad. Fig.6 (2)
Fig.5.- Shown here are the surface membranes of two adjoining cells separated by a 15 nm intercellular cleft occupied by material of low electron density assumed to consist mainly of carbohydrate
Fig.6.- In the freeze-fracture method, the path of membrane cleavage is along the hydrophobic interior of the lipid bilayerresulting in two complementary fractures faces: (1) an outwardly directed inner half- membrane presenting the P-face from which the majority of the globular proteins project, and (2) an inwardly directed outer half-membrane presenting the E-face which is relatively smooth but shows occasional protein particles.
iii. Algunas proteínas de membrana son glicoproteínas. Cuando se incuban células aisladas como los eritrocitos humanos, en un medio que contenga una proteasa (tripsina o pronasa), los glicopéptidos se separan de la superficie celular. Ent re las unidades glucídicas de estos glicopéptidos hay que destacar la presencia de ácidos siálicos (principalmente el ácido N-acetilneuroamínico) que son los responsables de la mayor parte de cargas negativas de la superficie celular. Estas cargas se ponen de manifiesto por electroforesis de células enteras: sometidos a la acción de un campo eléctrico, los eritrocitos, células normales o cancerosas en cultivo, se dirigen hacia el ánodo. Si las células se tratan con neuraminidasa, enzima que separa específicamente el ácido neuramínico de las glicoproteínas de la membrana plasmática, su movilidad electroforética queda muy disminuida.
Estos resultados demuestran, pues, que la membrana plasmática nativa está constituida por lípidos, proteínas y cadenas polisacáridas unidas a los polipéptidos.
Diversos métodos citoquímicos prueban que las cadenas polisacáridas están localizadas esencialmente a nivel del revestimiento fibroso. Cuando el revestimiento fibroso es espeso (ameba, disco estriado de los eritrocitos) la oxidación con ácido periódico y tinción con el reactivo de Schiff da como resultado una coloración púrpura que se hace muy patente en cortes observados al microscopio óptico – dan positiva la Reacción del PAS-. El uso de sales de plata después de la oxidación con ácido periódico de cortes finos, muestra al microscopio electrónico que los depósitos de granos de plata se forman sobre la cara externa de la membrana plasmática y más concretamente sobre las fibrillas del revestimiento fibroso.
La presencia de polisacáridos de superficie se demuestra, igualmente mediante el uso de lectinas , proteínas de origen vegetal que se extraen principalmente de las leguminosas. Las lectinas poseen centros estereo específicos que les permiten unirse específicamente a ciertos azúcares. La más utilizada es la concanavalina A que se extrae de la judía Jacquier, Canavalia ensiformis; es un tetrámero de PM 112000 daltons; cada una de sus cuatro subunidades idénticas está formada por 238 aminoácidos y su estructura terciaria ha sido también identificada. La concanavalina A se une específicamente a la glucosa o a la manosa. Después de incubar células vivas o fijadas en un medio en presencia de concanavalina A, la existencia de la lectina en la superficie celular se revela con marcadores: marcadores como la ferritina (microscopía electrónica) o la fluoresceína (microscopía óptica) que se unen a la Concanavalina A antes de que ésta reaccione con los azúcares de la membrana; o marcadores como la peroxidasa que se unen a las lectinas después de que éstas se hayan fijado en la célula y cuya actividad catalítica se puede revelar seguidamente mediante diaminobencidina y tetróxido de osmio.
La mayoría de las lectinas tienen, por molécula, muchos lugares de fijación para azúcares específicos (en efecto, son asociaciones de subunidades protoméricas que poseen cada una un lugar de fijación); colocadas en una suspensión celular forman puente entre células vecinas y provocan su aglutinación. Esta propiedad fue encontrada por primera vez en los glóbulos rojos de la sangre y es por ello, que las lectinas también se conocen con el nombre de fitohemaglutininas.
III.2. Aislamiento de fracciones
El aislamiento de membranas plasmáticas plantea problemas técnicos difíciles que han sido resueltos inicialmente eligiendo un material muy favorable, el glóbulo rojo de mamífero o hematíe (llamado también eritrocito). En efecto, los hematíes son células anucleadas (han perdido su núcleo en el curso de su maduración en la médula ósea roja) que adem ás carecen de
orgánulos citoplasmáticos. Son, pues, sacos cuya pared es la membrana plasmática o estroma y cuyo contenido es rico en hemoglobina. Vaciando estas células por shock osmótico se obtienen fácilmente precipitados de glóbulos rojos que no poseen más que su membrana plasmática. Son los llamados «glóbulos rojos fantasma». En la práctica, los glóbulos rojos humanos son los más utilizados puesto que se pueden obtener en grandes cantidades en los bancos de sangre. Después de lavar los glóbulos con una solución salina isotónica (NaCI 9 %, tamponada a pH 7,0 o ligeramente alcalina), se centrifuga y el precipitado obtenido se resuspende en un medio hipotónico (solución tamponada de NaCI al 5 % o menos). Los glóbulos se hinchan; a los 15 segundos del comienzo de este shock osmótico se abren en la membrana pequeños agujeros de 200 a 500 Á de diámetro. En estas condiciones, el hialoplasma, rico en hemoglobina, sale de los glóbulos y se diluye en el medio hipotónico extrácelular; los glóbulos se vacían así de su contenido, es el fenómeno de hemolisis. Por centrifugación se obtiene un precipitado de membranas plasmáticas que delimitan todavía los sacos plasmáticos, puesto que los agujeros aparecidos en la membrana durante la hemolisis, después de la salida de la hemoglobina (aproximadamente a los 25 segundos del tratamiento hipotónico), se vuelven a cerrar. La preparación de fracciones de membranas plasmáticas a partir de otros tipos celulares, como las células del hígado o del páncreas exocrino, es mucho más larga y complicada; estas células poseen en su citoplasma el retículo endoplasmático, los dictiosomas del aparato de Golgi, las mitocondrias cuyas membranas son muy difíciles de separar, unas de otras, a partir del homogeneizado inicial y posterior centrifugación diferencial en gradientes de sacarosa. A pesar de estas dificultades, se consiguen preparar fracciones de membranas plasmáticas en las que la contaminación debida a otras membranas celulares es baja.
III.3. Analisis químico .-
III.3.1. LIPIDOS DE LA MEMBRANA PLASMATICA.-
La membrana plasmática del eritrocito de rata tiene un 40% de lípidos. Hay unas 5.10^6 moléculas de lípido por μ^2. Los principales son:
- Fosfolípidos:
- fosfoglicéridos
- esfingolípidos
- colesterol y sus derivados
- Los lípidos que contienen carbohidratos son glucolípidos****. Las características químicas de los lípidos mencionados son:
- Los fosfoglicéridos están formados por una molécula de glicerol esterficado con dos ácidos grasos (entre 16 y 20 C de longitud) y cada uno de ellos se encuentra unido por su extremo carboxilo al hidroxilo del glicerol. El tercer hidroxilo del glicerol está esterifiado con un fosfato. Si este grupo fosfato no se encuentra esterficado con ningún otro componente el fosfolípido se denomina ácido fosfatídico. Si el fosfato está esterificado por otros radicales, se denomina de acuerdo con este radical.
Los principales fosfolípidos son los unidos a:
- colina (fosfatidil colina o lecitina), - serina (fosfatidilserina o cefalina), - etanolamina (fosfatidil etanol amina, también llamada cefalina como el anterior,
- inositol (fosfatidil inositol), o a otra molécula de glicerol (fosfatidil glicerol).
Fig. 8.- Representación esquemática de los distintos lípidos de la MP
III. 3.2. LA BICAPA LIPÍDICA -
El concepto moderno de la naturaleza bioquímica de la membrana celular data desde que Langmuir's (1917) , demostrara que cuando los ácidos grasos o fosfolípidos son disueltos en benceno y varias gotas de esta solución, se disponen en una superficie de agua, las moléculas se orientan con sus terminales hidrofílicos hacia el interior formando una monocapa en la interface aire- agua.
Fig.9.- Drawing illustrating that when phospholipid is spread upon a large surface of water, the molecules orient with their hydrophilic ends inward to form a coherent layer at the air-water interface.
Partiendo de esta propiedad Gorter and Grendel (1925) extraen los lípidos de los eritrocitos, miden el área que ocupa la monocapa que forman una vez dispersados sobre el agua y obtienen que es dos veces el área de la superficie calculada de los eritrocitos originales, concluyendo que los lípidos deben de constituir una bicapa en las membranas celulares. La conclusión es acertada pero resultó que se basaba en dos ideas equivocadas pero que afortunadamente se compensaban la una a la otra. Por un lado, la acetona no extrajo todos los lipidos de las membranas de los eritrocitos y por otro, la superficie calculada para lo eritrocitos se basaba en preparaciones secas y por consiguiente era inferior al verdadero valor establecido en preparaciones húmedas. De todos modos las conclusiones de este experimento ejercieron una profunda influencia e la biología celular; a consecuencia del mismo, la existencia de una bicapa lipídica como estructura básica de la membrana plasmática fue plenamente aceptada.
Métodos más sofisticados han establecido de forma rotunda que la bicapa lipídica es la base de la estructura de la membrana. Por ejemplo el analisis por difraccion por Rayos X ha demostrado la existencia de bicapas lipídicas en las membranas de las vainas de mielina, midiendo el grosor de esta bicapa así como sus propiedades eléctricas viniendo a convenir que las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos han de estar perpendiculares al plano de la membrana.
La observación de que la tensión superficial de las membranas artificiales es alta, mientras que las de las naturales es relativamente baja condujo a Davson y Danielli a postular la existencia de una capa de proteinas a ambos lados de la bicapa lipídica. Este concepto de organización de la membrana celular perduró durante veinte años.
Las colas suelen ser ácidos grasos, y pueden tener diferente longitud (normalmente contienen de 14 a 24 átomos de carbono). Normalmente una de las colas presenta uno o más dobles enlaces C is (es decir, es insaturada) mientras que la otra normalmente no tiene dobles enlaces (es decir, es saturada). Como se muestra en la Figura 10-2, cada doble enlace C is genera una suave curvatura en la cadena. Las diferencias de longitud y de grado de saturación entre las colas hidrocarbonadas son importantes porque afectan la capacidad de las moléculas de fosfolípidos para empaquetarse una contra otra y, por lo tanto, afectan la fluidez de la membrana. La forma y naturaleza anfipática de las moléculas lipídicas es lo que determina que estas moléculas formen espontáneamente bicapas lipídicas en solución acuosa. Cuando las moléculas anfipáticas se encuentran rodeadas por todas partes por un ambiente acuoso, tienden a agregarse de tal manera que las colas se enfrentan entre sí y las cabezas hidrofílicas se encuentran expuesta al agua, formando micelas o bicapas lipídicas.
Propiedades de las bicapas
- Autoensamblaje espontáneo en bicapas. Debido a su forma cilíndrica la mayoría de los fosfolípidos de membrana se ensamblan espontáneamente bicapas en un entorno acuoso. Además estas bicapas tienden a cerrarse sobre sí mismas formando compartimentos herméticos. Autosellado. Por esta misma razón, los compartimentos formados por bicapas lipídicas tienden a cerrarse de nuevo después de haber sido rotos. Además de las propiedades de autoensamblado y autosellado, una bicapa lipídica tiene otras propiedades que hacen de ella una estructura ideal para construir las membranas celulares.
Fig. 12 .- Esquema de una molécula de fosfolípido. En (A) de forma esquemática, (B) como fórmula química, (C) como modelo espacial y (D) como símbolo
Fig.1 3 .- Las bicapas lipídicas se ensamblan formando un compartimento cerrado que es una estructura muy estable porque evita la exposición al agua de las colas hidrocarbonadas hidrofóbicas, que podría se energéticamente desfavorable.
- Fluidez. Una de la más importante es la fluidez, que, como veremos, es crucial para muchas de sus funciones. Sorprendentemente, no fue hasta principio de los años 1970 que los investigadores reconocieron por primera vez que las moléculas lipídicas pueden difundir en el seno de la bicapa. La demostración inicial procede de unos estudios llevados a cabo con bicapas lipídicas sintéticas. Dos tipos de estas bicapas sintéticas han resultado muy útiles en los estudios experimentales: (1) bicapas producidas en forma de vesículas esféricas, denominadas liposomas, cuyo tamaño puede variar de 25 nm a 1μm de diámetro según cual sea el sistema de preparación, y (2) bicapas planas, denominadas membranas negras , formadas a través de un agujero situado en una separación entre dos compartimientos acuosos.
Fig. 1 4 .- Sellado espontáneo de una bicapa fosfolipídica formando un compartimento cerrado
Fig. 15 .- (A) Micrografía electróinca de vesículas de fosfolípidos (LIPOSOMAS) en agua, congelados rápidamente a Tª de N- liquido. La estructura bilaminar de las vesículas destaca claramente. (B) Esquema de un pequeño liposoma esférico visto en sección transversal. Normalmente los liposomas se utilizan como modelos de membrana en estudios experimentales.
La fluidez de las membranas celulares es biológicamente muy importante. Algunos procesos de transporte y algunas actividades enzimáticas, por ejemplo, pueden detenerse cuando la viscosidad de la bicapa se incrementa experimentalmente por encima del nivel umbral.
LA FLUIDEZ DE UNA BICAPA LIPÍDICA DEPENDE TANTO DE SU COMPOSICIÓN
COMO DE SU TEMPERATURA, TAL COMO HA SIDO DEMOSTRADO EN ESTUDIOS
EN BICAPAS SINTÉTICAS.
- Una bicapa lipidica artificial producida a partir de un solo tipo de fosfolípido pasa del estado líquido (fluido) al cristalino (rígido) en un punto de congelación preciso y característico de ese fosfolípido. Este cambio se llama transicion de fase , y se da a más baja temperatura (la membrana es mas difícil de congelar) cuanto más cortos e insaturados son sus ácidos grasos.
- En las bicapas artificiales con mezcla de fosfolípidos (diferente longitud y grado de saturación y por consiguiente diferentes puntos de transición de fases), se pueden producir separaciones de fase, cuando se alcanza su punto de congelación las moléculas individuales de fosfolípidos del mismo tipo se agregan y se congelan formando grupos.
Sin embargo, en las membranas biológicas los fosfolípidos tienen en una misma molécula cadenas de ácidos grasos saturados e insaturados que impide la transición de fases, por tanto no se produce congelación y en consecuencia la fluidez se ve aumentada
Podemos decir que la existencia, en las membranas biológicas , de fosfolípidos con cadenas hidrocarbonadas de diferente longitud y diferente grado de saturación, hace que no se produzcan transiciones de fase permitiendo que la fluidez de la membrana permanezca.
Otro determinante de la fluidez de las membranas celulares es el colesterol.
Dada la elevada concentración que se encuentra en la mayoría de las membranas plasmáticas de las células eucarioticas (una molécula de colesterol por cada molecula de fosfolípido), impide que las cadenas hidrocabonadas de fosfolípidos se junten y cristalicen. De esta forma, impide la transición de fases y mantiene la fluidez de la membrana.
Fig. 18.- Influencia de la presencia de dobles enlaces cis en las cadenas hidrocarbonadas. La presencia de dobles enlaces cis hace más dificilmente el empaquetamiento de las cadenas
Además de regular la fluidez se cree que el colesterol aumenta la estabilidad mecánica de la bicapa. Las moléculas de colesterol se orientan en la bicapa con sus grupos hidroxilo próximos a las cabezas polares de las moléculas de fosfolípidos, sus anillos esteroides planos y rigidos, interactúan y en parte inmovilizan las porciones de las cadenas hidrocabonadas más cercarnas a las regiones polares dejando el resto de la cadena (la más alejada) mas flexible. Se cree que aumenta tanto la flexibilidad como la estabilidad mecánica de la bicapa.
La importancia del colesterol en el mantenimiento de la estabilidad mecánica de las membranas queda patente en líneas celulares mutantes incapaces de sintetizar colesterol, que se lisan rapidamente amenos, que se añada colesterol al medio en cultivo. El colesterol añadido se incorpora a la membrana y se impide que se lisen.
El colesterol también disminuye la permeabilidad de las bicapas lipídicas para pequeñas moléculas solubles en agua. El colesterol también facilita los cambios en la forma de la membrana que requieren que las dos caras de la bicapa lipídica se contraigan o extiendan en grados muy diferentes, ya que a diferencia de los fosfolípidos, el colesterol puede moverse de una cara a la otra de la bicapa en "flip-flop".
Fig. 19
Fig. 20
existe una mayor proporción de fosfatidil-colina y esfingomielina en la cara externa y de fosfatidil etanol amina y fosfatidil serina en la cara interna, lo que se traduce en una diferencia importante de carga entre las dos monocapas, (la fosfatidilserina es el único fosfolípido de los cuatro que posee una carga neta negativa). La asimetría de los grupos de cabeza (+ o -) se haya acompañada de una asimetría en las colas hidrocarbonadas que hacen que la monocapa interna sea algo más fluida que la externa. Puesto que las moléculas lipídicas no saltan en flip-flop es posible que esta asimetria se genere en el momento de la formación de los diferentes lípidos en las membranas del retículo endoplasmático, mediante enzimas, translocadoras de fosfolípidos, que trasfieren moléculas lipídicas específicas de una monocapa a otra.
La asimetría lipídica ha de tener algún significado funcional. Pudiera ser que ayudase a mantener las proteinas de membrana orientadas adecuadamente en la bicapa ya que estas se hayan colocadas de manera altamente asimétricas como veremos más adelante
III.3.3. Los glucolípidos .- Los glucolípidos se encuentran en la superficie de todas las membranas plasmáticas si bien, todavía se desconoce totalmente su función. Estas moléculas lipídicas, que contienen en sus cadenas restos de oligosocaridos, son las reponsables de la asimetría más marcada de las dos caras de la membrana plásmatica, merced a la diferente distribución de los mismos en las dos hemimembranas. Estas moléculas solo se encuentran en la hemimembrana externa y sus grupos de azucar quedan al descubierto en la superficie de la célula. Se presentan probablemente en las membranas plasmáticas de todas las células animales, constituyento aproximadamente el 5% de las moléculas lipídicas de la monocapa superior. Si bien existe una variablidad interespecífica e intertisular dentro de la misma especie. En las bacterias y en las plantas casi todos los glucolípidos derivan del glicerol, mientras que en las células animales derivan de esfingosina.
Entre los glucolípidos más difundidos en las membranas plasmáticas de las células eucarióticas y procarióticas se encuentran los glucolípidos neutros. Algunos se encuentran en ciertos mamiferos y en determinados tejidos. Un ej. típico lo constituyen lo galactocerebrósido s (sólo galactosa en la cabeza polar), que constituyen los glucolípidos principales de la mielina, donde representan un 40% de la monocapa exterior. Puesto que no se hallan en cantidades importantes en
Fig. 22.-
otras membranas plasmáticas, quizás tengan que ver con el proceso de enrollamiento típico de la mielinización. Los glucolípidos más complejos, los gangliósidos, tienen uno o más resíduos de ácido siálico (NANA) con carga negativa.
En resumen.- Todas las membranas biológicas tienen una doble capa contínua de moléculas lipídicas, en las que estan inmersas varias proteinas de membrana. Esta bicapa lipídica es fluida, y las moléculas lipídicas pueden difundir rapidamente dentro de su propia monocapa. Sin embargo, raramente pasan de una monocapa a otra. Las moléculas lipídicas de la membrana son anfipáticas, y la mayoría de ellas forman expontáneamente bicapas al ser colocadas en agua. Por esta razón, las bicapas celulares se forman por autoensamblaje y si se rompen se unen de nuevo (autosellado). En la bicapa de la membrana plasmática existen tres clases principales de moléculas lipídicas: fosfolípidos, colesterol y glucolípidos, siendo diferente la composición lipídica de las dos monocapas interna y externa. Además las membranas diferentes de una misma célula eucariótica tienen también composición lipídica diferente.
