Cuadernillo de prácticas 16/17, Ejercicios de Fisiología de las Plantas

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CUADERNO DE PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA

VEGETAL

2º GRADO EN BIOLOGÍA

CURSO 2016/

García Rodríguez, Daniel

Grupo 1 (Prácticas)

ÍNDICE

PRÁCTICA 1: MEDIDA DEL POTENCIAL HÍDRICO EN TEJIDOS VEGETALES………………...

PRÁCTICA 2: MEDIDA DE LA TRANSPIRACIÓN………………………………………………………...

PRÁCTICA 3: PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS. EXTRACCIÓN Y CROMATOGRAFÍA……

PRÁCTICA 4: ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LAS CLOROFILAS Y DETERMINACIONES

CUANTITATIVAS……………………………………………………………………………………………………..

PRÁCTICA 5: REACCIÓN DE HILL……………………………………………………………………………..

PRÁCTICA 6: EFECTO DE LA LUZ Y LA TEMPERATURA SOBRE LA FOTOSÍNTESIS……….

PRÁCTICA 7: INFLUENCIA DEL ÁCIDO INDOLACÉTICO SOBRE EL CRECIMIENTO DE

SECCIONES DEL COLEÓPTILO DE AVENA………………………………………………………………...

PRÁCTICA 8: EFECTO DEL ÁCIDO GIBERÉLICO SOBRE LA MOVILIZACIÓN DE RESERVAS EN

EL ENDOSPERMO DE SEMILLAS DE TRIGO……………………………………………………………..

PRÁCTICA 9: EFECTO DE LA KINETINA SOBRE LA SENESCENCIA DE LAS HOJAS……….

PRÁCTICA 10: LOCALIZACIÓN DEL CRECIMIENTO EN TALLOS Y RAÍCES…………………..

PRÁCTICA 11: ENSAYO DE GERMINACIÓN DE SEMILLAS………………………………………..

PRÁCTICA 12: ENSAYO DE VIABILIDAD DE SEMILLAS……………………………………………..

PRÁCTICA 13: EXTRACCIÓN Y MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DEL ENZIMA LIPASA EN

SEMILLAS DE RICINO…………………………………………………………………………………………….

PRÁCTICA 14: DETERMINACIÓN DE ACIDEZ Y SÓLIDOS SOLUBLES EN FRUTOS. CÁLCULO

DEL ÍNDICE DE MADUREZ……………………………………………………………………………………..

Con ella, y con el peso molecular de la sacarosa, ya somos capaces de despejar el n.º de moles necesarios, y a partir de estos saber cuántos gramos de sacarosa necesitamos en cada caso:

• DISOLUCIÓN 0'15 M → 5'13 gramos de sacarosa
• DISOLUCIÓN 0'20 M → 6'84 gramos de sacarosa
• DISOLUCIÓN 0'25 M → 8'55 gramos de sacarosa
• DISOLUCIÓN 0'30 M → 10'26 gramos de sacarosa
• DISOLUCIÓN 0'35 M → 11'97 gramos de sacarosa
• DISOLUCIÓN 0'40 M → 13'68 gramos de sacarosa Tras tener preparadas las disoluciones, cogemos los cilindros de patata y los pesamos. Unimos en parejas los cilindros de pesos similares. Después, pesamos las parejas y registramos el peso fresco total. Finalmente, introducimos las 6 parejas en las distintas disoluciones de sacarosa. Cubrimos los vasos con papel de aluminio y los dejamos reposar un día entero a temperatura ambiente. Una vez pasado el tiempo de reposo del tejido en las disoluciones, los sacamos de ellas y los secamos con papel de filtro. Tras esto, determinamos su peso fresco total final y apuntaremos todos los datos obtenidos en la práctica en una tabla de datos.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Procederemos a contruir un gráfico que represente el cambio de peso en función de la concentración de sacarosa. Obtendremos una recta, en la cual, existirá un punto de corte con el eje de abscisas que será la concentración de sacarosa en la que no hay ni pérdida ni ganancia de peso. Podemos calcular el potencial osmótico del tejido vegetal estudiado con dicha concentración de sacarosa mediante la siguiente fórmula: ψ 0 = -c · i · R · T Donde c es la concentración de sacarosa (en nuestro caso, sabemos que es 0'255 M por el punto de corte obtenido), i es el grado de ionización de la sacarosa (en este caso es 1 porque no está ionizada), R es la constante de los gases (0'0083 L ·Mpa · mol

• ·K - ) y la T es la temperatura (en nuestro caso, 296 K).

fuente de luz.

• 4º) 10 minutos sometida a viento caliente (con la ayuda del secador ) además de la fuente de luz. Tras todo esto, obtenemos los siguientes datos: Peso inicial Peso final Variación de peso Velocidad de transpiración (g H 2 O/min) 10 min en condiciones de laboratorio 392'5 gramos 392'137 gramos 0'363 gramos 0'0363 g/min 10 min con luz encendida (a 20 cm) 392,137 gramos 391'991 gramos 0'146 gramos 0'0146 g/min 10 min de viento frío + luz 391'991 gramos 391'370 gramos 0'621 gramos 0'0621 g/min 10 min de viento caliente+luz 391'370 gramos 384'8 gramos 6'57 gramos 0'657 g/min

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Observando los resultados obtenidos, podemos afirmar que los factores ambientales afectan (y de manera bastante significativa) en la transpiración de la planta y, por consiguiente, en la regulación de su nivel hídrico. No obstante, podemos ver que no todos los factores afectan de la misma manera en los niveles de la velocidad de transpiración; por ejemplo, podemos ver que el viento caliente acompañado de la luz afecta mucho más en los niveles transpiración. Por lo tanto, concluimos que los diferentes tipos de condiciones ambientales que sufre la planta son influyentes en su velocidad de transpiración, en mayor o menor medida según el tipo de condición.

PRÁCTICA 3: PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS. EXTRACCIÓN Y

CROMATOGRAFÍA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Extraeremos los pigmentos presentes en los cloroplastos de tejidos foliares (en esta práctica, utilizaremos hojas de espinaca). Tras ello, los separaremos mediante técnicas de cromatografía en papel.

MATERIAL NECESARIO

Para el desarrollo de esta práctica, necesitaremos los siguientes utensilios:

• 0'5 gramos de tejido foliar (en nuestro caso espinacas, aunque sirven otras plantas con hojas verdes).
• Etanol al 95%
• Acetona al 80%
• Acetona pura
• Éter etílico
• Tetracloruro de carbono (CCl 4 )
• Carbonato de calcio (CaCO 3 )
• Mortero
• Embudo de decantación de 250 ml y soporte para éste
• Probeta
• Cámara cromatográfica
• Papel de cromatografía (Whatman n.º 1)
• Tubo capilar
• Clips
• Regla
• Cuentagotas

PROCEDIMIENTO

En primer lugar, debemos realizar la extracción de los pigmentos : Cogemos unos 0'5 gramos de tejido foliar (hojas de espinaca) del cual debemos usar todo menos la vena central de la hoja. Acto seguido, colocamos el tejido en el mortero junto con un poco de CaCO 3 , de este modo se neutralizan los ácidos celulares y evitamos que se sustraiga el Mg del núcleo de la clorofila. Procedemos entonces a triturar el tejido; añadimos 20 ml de acetona al 80% y comenzamos a machacar las hojas con el mortero hasta obtener una masa del tejido junto al sobrenadante , en el cual estarán los pigmentos que estudiaremos.

Finalmente, mediremos la distancia de las bandas de pigmentos con la línea transversal situada en la base del papel de filtro, donde pusimos el extracto del tejido foliar. Con estos datos, seremos capaces de calcular el Rf de cada pigmento. Se trata de un valor adimensional que refleja el grado de plaridad de un pigmento sometido a cromatografía. Se calcula de la siguiente manera: Rf= Distancia del compuesto (cm) / Distancia del frente (cm)

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Pigmento Distancia disolvente (cm) Distancia pigmento- punto de origen (cm) Valor Rf Clorofila A 5'1 0'75 0' Clorofila B 5'1 0'55 0' Xantofila 5'1 1'8 0' Caroteno 5'1 4'95 0' Para una buena comprensión de los resultados obtenidos y su significado, hemos de tener claros una serie de principios de cromatografía : La cromatografía se trata de un proceso físico de separación para la caracterización de mezclas complejas (en este caso, el extracto obtenido de las hojas de espinaca). En este experimento, podemos observar como según ha ido ascendiendo la fase móvil por el papel de filtro, los pigmentos han ido quedándose en un lugar más alto o más bajo. Este hecho se debe a la denominada velocidad de difusión , la cual se define como la cantidad de solubilidad que tiene cada sustancia. De este modo, los pigmentos más solubles se desplazarán más rápido, pues acompañarán fácilmente a la fase móvil según vaya ascendiendo ésta. Por lo tanto, los pigmentos más separados de la línea donde pusimos el extracto del tejido foliar serán los pigmentos más solubles (en nuestro caso, los carotenos); y cuanto más ancha sea la banda que formen los pigmentos, más abundantes serán dichos pigmentos en el tejido foliar. → Fórmula estructural de las clorofilas a y b

→ Fórmula estructural de la xantofila → Fórmula estructural del beta caroteno Estos pigmentos, clorofilas y carotenoides (xantofilas y beta caroteno), se encuentran engarzados dentro de las proteínas fotosintéticas presentes en el aparato fotosintético en las membranas de los tilacoides , formando los denominados complejos pigmento- proteina. También existen otra serie de pigmentos en la célula, como los pigmentos antociánicos o antocianinas. Son pigmentos hidrosolubles que se encuentran en las vacuolas de las células vegetales y dan color rojo, púrpura o azul a hojas, flores y frutos. Esta serie de pigmentos accesorios, sirven para la absorción de luz en diferentes longitudes de onda. Este hecho puede ocasionar que se produzca un fenómeno de fotoluminiscencia (emisión de luz consecuencia de la absorción previa de una radiación, en este caso la UV del sol) que puede darse de dos formas: si la fotoluminiscencia persiste tiempo después de cesar la radiación incipiente, hablamos de fluorescencia ; al contrario puede darse la fosforescencia , cuando la fotoluminiscencia no persiste al cesar la radiación incipiente.

Una vez obtenido el extracto de clorofilas, nos dispondremos a determinar las cantidades de clorofila existentes en él: Introducimos el extracto en cubetas (una de ellas la llenaremos de acetona al 80%). Tras esto, lo primero será introducir la cubeta con acetona en el espectrofotómetro para determinarlo como el ''blanco''. Después introducimos las cubetas con el fin de medir la densidad óptica o absorbancia de las clorofilas a diferentes longitudes de onda (en nuestro caso: 645, 652 y 663 nm). Gracias a los espectros de absorbancia, podremos calcular los miligramos de cada clorofila existentes en el tejido de estudio. Este hecho se basa en que no todas las clorofilas absorben la luz con la misma longitud de onda y que dependiendo de la cantidad de pigmento que exista en un determinado tejido, se absorberá más o menos luz.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Utilizaremos las denominadas fórmulas de Arnold : mg clorofila A / g tejido = (12'7 · D 663 – 2'69 · D 645 ) · (V/1000 · W) mg clorofila B / g tejido = (22'9 · D 645 – 4'68 · D663)) · (V/1000 · W) mg clorofila total / g tejido = (20'2 · D 645 + 8'02 · D 663 ) · (V/1000 ·W) Donde D es la densidad óptica a esa longitud de onda, V es el volumen final del extracto clorofílico en ml (50 ml) y W el peso fresco en gramos del tejido vegetal utilizado (0' gramos). Con todos lo datos reunidos, obtenemos los siguientes resultados : Clorofila A = 0'45 mg / 0'5 g de tejido vegetal Clorofila B = 0'15 mg / 0'5 g de tejido vegetal Clorofila total = 0'6 mg / 0'5 g de tejido vegetal

PRÁCTICA 5: REACCIÓN DE HILL

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

En esta práctica, realizaremos un estudio de la reacción de Hill de la fotosíntesis. Para ello, usaremos un inhibidor de dicha reacción (atrazina) en una determinada cantidad de tejido vegetal.

FUNDAMENTO TEÓRICO

La fase clara, fase luminosa, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera fase de la fotosíntesis. Depende directamente de la luz o energía lumínica para conseguir energía química en forma de ATP y NADPH a partir de la fotólisis del agua; es decir, se obtiene energía y poder reductor que posteriormente se utilizarán en la fijación del carbono. Los productos finales obtenidos son oxígeno molecular e hidrógeno. La enzima que cataliza esta reacción es la NADP+ reductasa , presente en los cloroplastos. La reacción fue determinada en 1939 por Robin Hill, quedando de la siguiente manera: H 2 O + A → ½ O 2 + AH 2 Siendo A el aceptor final de electrones y protones (en este caso, el NADP+). No obstante, existen otros compuestos que pueden ocupar el lugar del NADP+ como aceptor final de electrones. Nosotros, en esta práctica utilizaremos el Diclorofenol indofenol (DCPIP). La reacción por lo tanto, quedaría así: 2 DCPIP (azul) + 2 H 2 O → 2 DCPIP·H (incoloro) + O 2 + H+ Este compuesto es de un color azulado, y tras la reacción de Hill, al reducirse, pasa a ser incoloro. De este modo, en este experimento, podremos ver si se está produciendo la reacción con observar simplemente el color de nuestros tubos de ensayo.

ml. Finalmente resuspenderemos la mezcla, y habremos obtenido así los cloroplastos. Comenzamos ahora la segunda parte de la práctica, la reacción de Hill : En primer lugar, cogemos 5 tubos de ensayo , a los cuales añadiremos tampón fosfato (la cantidad que indique la tabla de abajo) y los dejamos unos 10 minutos en un baño de agua (baño María a unos 20º – 25ºC) junto a la luz de una bombilla. Tras este tiempo de espera, iremos introduciendo los tubos con diferentes compuestos, para realizar una investigación de la reacción de Hill en diferentes situaciones: Tubo Tampón fosfato 0'05 M (ml) Cloroplastos (ml) Diuron (herbicida) (ml)

DCPIP 1'1·

- M (ml) 1 10 0'5 - - 2 5 0'5 - 5 3 → Oscuridad 5 0'5 - 5 4 → Hervidos 5 0'5 (a 100ºC) - 5 5 → Herbicida 5 0'5 0'1 5

• Al tubo 1 no le añadimos el DCPIP para comprobar que la reacción de Hill necesita un donador de electrones. Este será el TUBO CONTROL.
• En el tubo 2 encontramos todos los componentes para que se produzca la reacción de Hill, por lo que se producirá sin problemas (además, tampoco hay herbicida).
• El tubo 3 lo mantendremos en un ambiente oscuro (lo forraremos con papel de aluminio ), con el fin de demostrar que la reacción de Hill requiere luz.
• En el tubo 4 hemos introducido cloroplastos hervidos, es decir, que han sido inactivados por el tratamiento con calor.
• En el tubo 5 hemos introducido el herbicida , para ver si éstos afectan a la reacción de Hill o no. Tras esto, tapamos los tubos con parafilm , los agitamos, y los devolvemos a la gradilla, donde los dejaremos reposar durante 10 minutos. Una vez pasado este tiempo, los llevaremos al espectrofotómetro.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Las absorbancias a 620 nm de cada tubo fueron las siguientes:

• Tubo 1 (CONTROL) → 0'
  • Tubo 2 → 0'
• Tubo 3 (oscuridad) → 1'
• Tubo 4 (cloroplastos hervidos) → 1'
• Tubo 5 (herbicida) → 1' En cuanto al color de los tubos, observamos lo siguiente:

• El tubo 1 no ha cambiado de color, ya que al no contener DCPIP, no ha tenido lugar la reacción de Hill ya que no hay sustancia que acepte el poder reductor.
• El tubo 2 es el único tubo que ha cambiado de color (se observa incoloro), por lo que sí ha tenido lugar la reacción de Hill en él.
• El tubo 3 no ha cambiado de color, por lo que aceptamos el hecho de que la luz sea necesaria para que se produzca la reacción de Hill.
• El tubo 4 y el tubo 5 tampoco han cambiado de color, ya que no se ha producido la reacción de Hill debido a la inactivación de las enzimas del cloroplasto (en el caso del 4, por hervir los cloroplastos, y en el caso del 5 por añadir el herbicida). Teniendo en cuenta estos resultados, podemos observar la importancia de cada uno de los productos utilizados en este experimento para que la reacción de Hill se produzca de manera fructífera. Los cloroplastos son indispensables ya que son la maquinaria biológica que lleva a cabo la reacción. La luz también es necesaria ya que son ella, los productos no se convierten en los reactivos. El agua actúa como donador de electrones , necesarios para que trabaje la cadena de transporte electrónico del cloroplasto. El tampón fosfato permite que se estabilicen los niveles de pH en el experimento. El 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP) actúa como aceptor final de electrones , por lo que es muy importante en la reacción también. Por último, hay que estudiar el efecto de los herbicidas sobre la reacción de Hill. Muchos herbicidas afectan al aparato fotosintético, impidiendo así la fotosíntesis; un ejemplo son las triazinas (como la atrazina o la simazina), las cuales impiden el transporte de electrones entre las plastoquinonas QA y QB. También podemos mencionar la acción de herbicidas como el diquat o el paraquat , los cuales inhiben el flujo de electrones entre la ferredoxina y el NADP, provocando la reducción del oxígeno a su radical superóxido (O 2

) y que los cloroplastos pierdan su actividad metabólica.

burbujas; así, obtendremos la tasa de fotosíntesis (número de burbujas/tiempo). Gracias al agua enriquecida con CO 2 , nuestra planta acuática tomará el carbono en forma de HCO 3 (como todas las plantas acuáticas) y aseguraremos que la obtención de carbono no sea un factor limitante que se interponga en nuestro experimento. HCO 3 + H+^ → H 2 CO 3 ↔ CO 2 + H 2 O Seguidamente, introduciremos la probeta en un baño, en el cual iremos variando la temperatura del agua y la distancia de la bombilla a la probeta (fuente de luz blanca de alta intensidad). Cada situación durará 3 minutos, dejando 5 minutos entre cada una para que la planta se aclimate. Tras una serie de recuentos, veremos si estos factores ambientales (temperatura y luz) afectan o no al proceso fotosintético.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Realizamos los siguientes recuentos: -Primero, con el agua a 30ºC:

• Bombilla a 45 cm de distancia → 3 burbujas/min
• Bombilla a 30 cm de distancia → 2'5 burbujas/min
• Bombilla a 15 cm de distancia → 2 burbujas/min -Con el agua a 40ºC:
• Bombilla a 15 cm de distancia → 4 burbujas/min -Con el agua a 50ºC:
• Bombilla a 15 cm de distancia → 5 burbujas/min

PRÁCTICA 7: INFLUENCIA DEL ÁCIDO INDOLACÉTICO SOBRE EL

CRECIMIENTO DE SECCIONES DEL COLEÓPTILO DE AVENA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

En esta práctica realizaremos un bioensayo, en el cual estudiaremos el efecto del ácido indolacético (AIA) en el crecimiento de secciones del coleóptilo de una planta (en nuestro caso utilizaremos Avena sativa ).

MATERIAL NECESARIO

Para el desarrollo de esta práctica, necesitaremos los siguientes utensilios:

• 25 plántulas de avena ( Avena sativa ) crecidas en oscuridad y preparadas antes de hacer la práctica
• Disolución tampón de KH 2 PO 4 0'01 M a pH=4'5, conteniendo el 2% (w/v) de sacarosa (medio basal)
• AIA
• Disolución de hipoclorito sódico al 1%
• Agua destilada
• Compartimento a la oscuridad a unos 25ºC y con una humedad relativa de un 85%
• Placas de Petri
• Cuchillas
• Pinzas
• Papel de filtro
• Regla graduada en milímetros o papel milimetrado

FUNDAMENTO TEÓRICO

Al cortar el ápice del coleóptilo (que es la zona donde se sintetiza el AIA y desde el que difunde al resto de la plántula) pretendemos cuantifica el crecimiento, o la respuesta biológica de la plántula al AIA, en vez de cuantificar el contenido endógeno de dicho factor regulador del crecimiento.

PROCEDIMIENTO

En primer lugar, antes de la realización de esta práctica, se ha realizado la preparación de las plántulas de avena. Se esterilizaron semillas de avena introduciéndolas durante 5 minutos en hipoclorito sódico al 1% ; tras esto fueron lavadas con agua destilada para eliminar los restos de hipoclorito. Después de esta esterilización, las semillas son sembradas en vermiculita, con luz roja incipiente de baja intensidad y en oscuridad (25ºC y 85% de humedad).