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observación en el microscopio de linfocitos
Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones
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TEMA: Cultivo de linfocitos y observación al microscopio AUTOR: Dra. Carmen A. Salvador Pinos Mg. María Eugenia Sánchez Msc. Juan Carlos Jácome Tomado de las prácticas de: Manual de Prácticas. Genética Molecular y Citogenética Humana. César Paz-y-Miño, Ligia Ocampo, María Eugenia Sánchez. Universidad de las Américas. Quito 2019.
Práctica N° 5 Tema Cultivo de linfocitos y observación al microscopio Propósito/ objetivo general Reconocer y aplicar la técnica de cultivo de linfocitos para observación de cariotipos en el microscopio utilizado para el diagnóstico genético Resultados de aprendizaje 1 Aplica la técnica para el cultivo y preparación de linfocitos de sangre periférica Resultados de aprendizaje 2 Obtiene cromosomas metafásicos para su posterior análisis Resultados de aprendizaje 3 Identifica la morfología general de los cromosomas humanos Material on- line http://www.biologia.arizona.edu/human/act/karyotyping/karyotyping.html´ Material que provee la cátedra o el laboratorio Equipos y material para el cultivo y extracción de linfocitos Ruta de estudio
Los linfocitos pueden ser inducidos a dividirse por acción de una glicoproteína obtenida del fréjol Phaseolus vulgaris llamada Fitohemaglutinina (PHA). El mecanismo exacto de inducción de la PHA aún se desconoce, pero se sabe que altera la permeabilidad de la membrana celular provocando un mayor ingreso de nutrientes y sustancias presentes en el medio. Este fenómeno estimula la síntesis de macromoléculas y en consecuencia se desencadena la división de la célula. In vitro se ha observado que la PHA, después de 24 horas de cultivo, causa un incremento en la síntesis de ARN, seguida de la síntesis de ADN y la división celular a las 48 horas. Además, en las primeras 24 horas después de estimuladas las células con PHA, los linfocitos producen una sustancia llamada Interleukina-2 (IL-2), conocida también como un factor de crecimiento linfocitario, la que perpetúa el proceso de mitosis a manera de reacción en cadena. Los linfocitos son las células blancas más pequeñas, con una proporción núcleo- citoplasma alta. Existen dos tipos principales de linfocitos, las células T (timo dependientes) involucradas en el proceso de inmunidad celular y las células B (médula ósea dependientes) involucradas en la inmunidad humoral. Los linfocitos T serán los estimulados selectivamente en su proliferación en los cultivos con PHA, se sabe que en un adulto normal, aproximadamente 70% de 1,5 - 4,0 x 10^9 linfocitos por litro de sangre son células T, los restantes son células B. Para el cultivo de linfocitos se utilizan medios suplementados tales como: Medio 199, MEM, F-10, y especialmente RPMI 1640, con 10 ml de suero fetal bovino o de ternera, 0,5 ml de L-Glutamina (aminoácido), 1,5 ml de antibiótico-antimicótico (concentración con efecto bacteriostático), 1,5 ml de Hepes buffer (pH 7,2) y 20 ml de PHA (estimulador de la división), por cada 100 ml de medio de cultivo. Con los requerimientos de temperatura y pH se trata de igualar las condiciones in vivo , esto es de 36- 38 C y pH de 7,0-7,4 respectivamente. Si la temperatura supera los 39 C provocará la muerte de las células cultivadas, mientras que si es inferior a los 36 C disminuirá el índice de divisiones celulares, perjudicando la calidad de la preparación. En la preparación cromosómica es necesario emplear un inhibidor del huso mitótico, especialmente en cultivos no sincronizados bloqueando el paso entre metafase y anafase. Estos tipos de químicos impiden la formación de las fibras del huso a las cuales se "ancla" el centrómero de cada uno de los cromosomas metafásicos, para que cada cromátide sea llevada a uno de los polos celulares. Entre estos químicos se cuentan la Viniblastina, la Colchicina y su análogo la Colcemida. Se debe tener en consideración que el tiempo durante el cual las células están expuestas al inhibidor del huso acromático es proporcional al índice metafásico, pero una exposición prolongada resulta en la reducción de la longitud de los cromosomas, de ahí que se ha estimado el tiempo de exposición en 1,5 a 2 horas para lograr un número adecuado de metafases con cromosomas lo suficientemente elongados que facilite una buena resolución al realizar el bandeo cromosómico. Parte esencial de la preparación de cromosomas es el tratamiento con un choque hipotónico. Una solución hipotónica es aquella con una concentración salina menor a la del citoplasma celular, de tal manera que dictado por las leyes del movimiento osmótico habrá un ingreso de H 2 O desde la solución hipotónica hacia el interior de la célula. Este fenómeno hincha las células, hemoliza la mayor parte de los eritrocitos y
complementa la acción del inhibidor del huso mitótico ayudando a la dispersión de los cromosomas. La morfología cromosómica también se verá influenciada enormemente por el proceso de fijación , el fijador usado con más frecuencia en las preparaciones cromosómicas es una mezcla de tres partes de alcohol (etanol absoluto o metanol) y una parte de ácido acético glacial conocida como fijador de Carnoy. El fijador juega un papel muy importante en el aplanamiento y separación de los cromosomas, y provoca, además, la hemólisis de los glóbulos rojos remanentes en la muestra. La exposición excesiva de las células a la solución de Carnoy resultará en la ruptura prematura de la membrana celular y la consecuente pérdida del material genético. Para la observación de cromosomas se procede a la tinción, siendo el Giemsa uno de los colorantes más utilizados. En estas condiciones las metafases ya están listas para proceder a su fotografía o captura, digitalizar y proceder a la obtención de cariotipo. Figura 1. Metodología habitual en la obtención del cariotipo. Es preciso partir de células que contengan cromosomas y que sean susceptibles de división. Tras varios días de cultivo en presencia de estimulantes mitóticos son tratadas con colchicina para detener a los cromosomas en metafase, tratados con solución hipotónica y fijados para proceder a su análisis.
TEMA: Técnicas e instrumentos en diagnóstico genético Apellidos: Nombres: Paralelo: Fecha: Ejercicio 1 Realice un mapa conceptual o mapa mental en donde se describa el procedimiento para el cultivo de linfocitos humanos para análisis cromosómico tomando en cuenta todo lo realizado en la práctica y adicionalmente los siguientes aspectos: (Citar y usar bibliografía validada).
