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Tipo: Tesis
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L'1i-tad de
Producción de ácido láctico por medio de
fermentación anaerobia y su polimerización a partir de
reacciones de apertura de anillo
Tesis que presenta
L.A.Q.B. Fátima Gimena Orozco Olivarez
En opción al título de
Mérida, Yucatán, Junio de 2011
CENTRO DE INVES TIGACION CIENTIFICA DE YUCA TAN A.C. POSGRADO EN CIENCIAS EN MATERIALES POLIMÉRICOS
RECONOCIMIENTO
Producción de ácido láctico por medio de fermentación anaerobia y su polimeri zación a partir de reacciones de apertura de anillo
A mis hermanos, Carito y Nicolás
A mis padre s, Silvia y Rolando
----------------~( IV )~-----------------
Al CONACYT por el apoyo con la beca 298166.
A la Dra. Liliana Álzate Gaviria.
Al M. C. Jorge Domínguez Maldonado.
Al Dr. Alex Valadez.
A la Q.I. María Verónica Moreno Chulim.
Al Dr. Felipe Barahona y a la Q.I. Tanit Toledano Thompson, así como al Dr. Luis Carlos Ordoñez López.
Al Dr. Manuel Aguilar Vega y al Dr. Manuel Cervantes U c.
A los técnicos de la Unidad de Materiales: Q.I. Santiago Duarte Aranda, M. María Isabel Loría Bastarrachea, Q.I. Rossana Faride Vargas Coronado y M. Wilberth Antonio Herrera Kao.
A los integrantes del Depto. de Instrumentación: Ing. Leonardo Gus Peltovich, Ing. César Ortiz Clavel, Ing. Edgar Rubén Pech Cauich y Luis Samuel Flores Mena.
Al M. José Herminsul Mina, al Dr. Fabio Zuluaga y a los integrantes del grupo de Polímeros de la Universidad del Valle.
A la Dra. Marcela Zamudio de la UADY.
A mi amiga y compañera Alejandra Aimeé Gutiérrez y a Adrián Hernández.
1.2.1 Microorganismos empleados en el proceso 1.3 SEPARACIÓN Y CONCENTRACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO
1.4 GENERALIDAD ES DEL ÁCIDO POLILÁCTICO l. 4.1 Influencia de la pureza óptica en las propiedades del ácido poliláctico 1.4.2 Influencia del peso molecular en las propiedades del ácido poliláctico 1.4.3 Comparación del ácido poliláctico con otros termoplásticos de uso común Vll
JO 13
1.4.4 Métodos para obtener ácido poliláctico 25 1.5 SÍNTESIS DEL ACIDO POLILACTICO 25 1.5.1 Polimerización por condensación directa (PCD) 26 l. 5.2 Uso de agentes acoplantes de cadena en oligómeros de bajo peso molecular l. 5. 3 Polimerización por apertura de anillo CAPÍTUL
METODOLOGÍA
2. 1 PRODUCCIÓN DE ACIDO LACTICO 2.1.1 Microorganismos y reactivos 2.1. 2 Reactivación de bacterias 2.1. 3 Curva de crecimiento bacteriana 2.1. 4 Condiciones de fermentación
2.1.5 Determinación de azúcares reductores y ácido láctico 39 2.1.6 Preservación de los microorganismos 2.2 SEPARACIÓN Y CONCENTRACIÓN DEL
2.2.1 Microfiltración 41 2.2.2 Nanofiltración y Ósmosis Inversa 42 2.2.3 Determinación de concentración de ácido láctico 43
2. 3 POLIMERIZACIÓN DELACIDOLACTICO. 44 2.3.1 Reactivos 44
viii
ANEXOS 74
ANEXO A ESCALA DE Me FA RLAND 75
ANEXO B MÉTODO UV PARA DETERMINAR ÁCIDO D- Y L- LÁCTICO BOEHRINGER MANNHEIMIR-BIOPHARM 76
ANEXO C CELDA DE FLUJO CRUZADO PARA FILTRACIONES 79
------1( X )1------
Tabla 1.1. Producción de ácido láctico y condiciones de fermentación para distintas BAL ...... .............................................................................................. 14 Tabla 1.2. Producción Industrial de PLA año 2008 ......................................... 20 Tabla 1.3. Propiedades del PLA producido por Birmingham Polymers ·......... 22 Tabla 1.4. Dependencia de algunas propiedades de PLA con el peso molecular ............ .............................................................................................. 23 Tabla 1.5. Algunas propiedades mecánicas de polímeros de uso común ........ 24 Tabla 2.1. Microorganismos utilizados para la fermentación láctica .............. 35 Tabla 2.2. pH óptimo de fermentación láctica ................................................. 38 Tabla 3.1. Producción de ácido D- y L-láctico por cepa bacteriana ............... 53 Tabla 3.2. Concentración de ácido láctico a través de los procesos de filtración ............. .............................................................................................. 57 Tabla 3.3. Bandas presentes en los espectros FTIR de PLA ........................... 60 Tabla 3.4. Valores de tiempo y viscosidad de las diluciones de PLA en cloroformo ........................................................................................................ 61
XI
Figura 2.9. Kit enzimático. A :ácido L-glutámico; B:NAD ; C: glutamato- piruvato transaminasa; D: D-lactato deshidrogenasa; E: L-lactato deshidrogenasa ......................................................................... 43 Figura 2.10. Purificación y oligomerización del ácido D,L-láctico .... ......... Figura 3.1. Curvas de crecimiento de las BAL .....................................,. .......... Figura 3 .2. Consumo de lactosa y producción de ácido láctico de L. bulgaricus y Le. lactis ........................................................................................................ 51 Figura 3.3. Consumo de lactosa y producción de ácido láctico de L. plantarum, L. delbrueckii y L. lactis ................................................................ 52 Figura 3.4. Matraz con fermentado de leche NIDO®; permeados de Microfiltración (a), N anofiltración (b) y remanente de Ósmosis Inversa (e) .. 55 Figura 3.5. Oligómero de ácido láctico ............................................................ 58 Figura 3.6. Cristales de D,L-lacturo ................................................................. 58 Figura 3.7. Ácido poli(D,L-láctico) ................................................................. 58 Figura 3.8 Espectros FTIR del ácido láctico obtenido por fermentación con L. delbrueckii y PLA sintetizado .......................................................................... 60 Figura 3.9. Linealización de la viscosidad reducida e inherente para el PDLLA sintetizado, solvente: cloroformo a 25 °C ........................................................ 63 Figura 3.1 O. Curva de DSC de PDLLA sintetizado, calentado de 20 a 170 °C a 2°C/min ............................................................................................................ 64 Figura 3.11. Espectro 13 C-NMR de PDLLA .................................................... 65 Figura 3.12. Espectro 1 H-NMR de PDLLA ..................................................... 66
xiii )t-------------
La cantidad de residuos plásticos no biodegradables ha alcanzado límites máximos de contaminación y su reciclaje es cada vez más complicado, generar materiales biodegradables es importante para disminuir los desechos y la contaminación generada, puesto que al ser desechados en ambientes propicios los microorganismos presentes los descomponen en dióxido de carbono, agua, minerales y biomasa sin provocar impacto ambiental o ecotoxicidad 1 •
El ácido poliláctico (PLA) es un polímero biodegradable de amplia versatilidad, puede aplicarse tanto en productos de uso diario: platos, bolsas, etc., como en fármacos o implantes médicos, ya que no es tóxico al ser humano. Una de las ventajas de este polímero es que puede obtenerse a partir de residuos de industrias alimenticias, mediante la fermentación de estos desechos se obtiene el ácido láctico, monómero a partir del cual se sintetiza el PLA.
En el presente trabajo se produjo ácido láctico mediante la fermentación de leche NIDO® usando bacterias ácido lácticas con rendimientos de 0.99 g de ácido láctico/g de lactosa, concentrando el mismo hasta 81 giL utilizando membranas de microfiltración, nanofiltración y ósmosis inversa; el ácido láctico recuperado se polimerizó mediante reacciones de apertura de anillo obteniendo PDLLA con peso molecular viscoso, Mv, de 19,264.07 g/mol.
La cantidad de residuos plásticos no biodegradables y su reciclaje se complica cada vez más por la pérdida de propiedades en cada ciclo de procesamiento, por lo que realizar productos con materiales biodegradables es importante tanto para mantener las necesidades básicas como para el procesamiento de desechos. Un polímero completamente biodegradable es un material que es convertido a dióxido de carbono, agua, minerales y biomasa por los microorganismos sin impacto ambiental o ecotoxicidad 1.
Uno de l os polímeros biodegradables empleados para fabricar artículos desechables de uso comercial como vasos, platos, cubiertos y recipientes para almacenar comida, es el ácido poliláctico (PLA), un biopoliéster con características similares al polietilentereftalato (PET) así como al polipropileno (PP) y al poliestireno (PS). El PLA es un material con muchas aplicaciones, desde implantes y materiales quirúrgicos hasta envases para alimentos, ya que puede ser modificado para impacto, extruido, inyectado, cristalizado térmico e incluso copolimerizado 2.
El monómero empleado para la síntesis del PLA es el ácido láctico, que es un subproducto de la fermentación anaerobia a partir de un sustrato orgánico como es la glucosa, la cual transforman los microorganismos del género lactobacilo 3.
En la naturaleza existen dos esteroisómeros del ácido láctico: el ácido L- láctico y el ácido D-láctico, cuya polimerización y copolimerización da lugar a productos con propiedades físicas diferentes. La pureza del monómero es
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importante para que se lleve a cabo una polimerización con buenos rendimientos en cuanto a pesos moleculares y características deseadas para su procesamiento y aplicación. En los últimos años, se han empleado técnicas de separación de ácido láctico por medio de nanofiltración y ósmosis inversa, obteniéndose el monómero en _grados de pureza mayores al 80% 4.
La polimerización del ácido láctico puede llevarse a cabo por medio de apertura de anillo del lacturo, formado a partir de dos moléculas de ácido láctico que se ciclan en la presencia de sales de estaño, calor y vacío 5.
Es importante resaltar que algunas de las investigaciones que se llevan a cabo actualmente en el Centro de Investigación Científica de Yucatán con aplicaciones biomédicas, por ejemplo el desarrollo de andamios y cementos óseos, emplean PLA, el cual es difícil de conseguir por su costo y disponibilidad. En México un aspecto importante para incentivar el uso del PLA, es la aplicación de la reforma a la Ley de Residuos Sólidos del Distrito Federal que entró en vigor en enero de 20 10 con el propósito de disminuir las grandes cantidades de residuos como son las bolsas que se generan por parte del sector comercial.
Por lo anterior, en este estudio se propone la obtención de ácido láctico por medio de fermentación láctica para su posterior separación y purificación, por lo que se empleará nanofiltración y ósmosis inversa con membranas de poliamida, y una posterior polimerización por apertura de anillo.
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CAPITULO 1 ANTECEDENTE S
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El ácido láctico tiene una larga historia en el uso de fermentación y preservación de alimentos, se descubrió en 1780 por el químico Scheele, quien inicialmente lo consideró como un componente de l'a leche, para 1789 Lavoisier lo llamó "acide lactique", posible origen de la actual terminología para ácido láctico. Pasteur descubrió que no es un componente de la leche, sino un metabolito generado por la fermentación realizada por ciertos microorganismos, lo que llevó a Fermy a producirlo mediante la fermentación de carbohidratos como la sacarosa, lactosa, manitol, almidón y dextrosa 6 • Para 1881, se comenzó la primer producción comercial de ácido láctico mediante un proceso microbiano en Estados Unidos de América 7 •
El ácido láctico (ácido 2-hidroxipropanóico), con fórmula CH 3 CHOHCOOH, es uno de los ácidos hidroxicarboxílicos más comunes 8. Este ácido carboxílico es producido por animales, plantas y microorganismos de dos formas ópticamente activas, como se observa en la Figura 1.1, la D(-) levorrotatoria y la L(+) dextrorrotatoria, ambos isómeros existen en los sistemas biológicos, generalmente el obtenido por fermentación es una mezcla racémica (formas D y L) 9 , Soccol et a/. 10 reportaron que el isómero más importante en la industria de los alimentos es el L(+), ya que sólo éste lo asimilan los humanos mediante la producción de la enzima L-lactato deshidrogenasa.
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