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PRÀCTIQUES DE NUTRICIÓ I METABOLISME
(GRAU EN BIOLOGIA)
Alumne _________________________________ Grup __________
Curs 2.013-2.0014
FISIOLOGIA VEGETAL
UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
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Asignatura: Nutricio i Metabolisme Vegetal, Profesor: , Carrera: Biologia, Universidad: UAB
Tipo: Ejercicios
2013/2014
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PRÀCTIQUES DE NUTRICIÓ I METABOLISME
(GRAU EN BIOLOGIA)
Alumne _________________________________ Grup __________
Curs 2.013-2.
FISIOLOGIA VEGETAL
UNIVERSITAT AUTÒNOMA DE BARCELONA
MEDIDA DEL POTENCIAL OSMÓTICO. MÉTODO DE LA PLASMÓLISIS
INCIPIENTE
OBJETIVO: Observación del fenómeno de la plasmólisis en células epidérmicas de bulbo de Allium cepa y cálculo del potencial osmótico de las mismas.
FUNDAMENTO: El movimiento del agua se realiza siempre a favor de potencial hídrico. En una célula vegetal este potencial viene determinado tanto por el potencial osmótico como por el potencial de presión según la expresión (w = + P). Cuando una célula vegetal se pone en contacto con una solución que contenga un soluto para el cual la membrana celular sea impermeable, aquélla gana o pierde agua en función del gradiente de potencial que se establezca. Cuando la célula pierde agua, el potencial de presión disminuye y, si esta pérdida es suficiente, el citoplasma deja de presionar contra la pared celular, momento en que el potencial de presión se iguala a cero. En este punto, denominado de plasmólisis incipiente, y determinado prácticamente como aquel valor de potencial osmótico de la solución que provoca la plasmólisis del 50% del las células del tejido, el único componente del potencial hídrico celular es el potencial osmótico. Mediante una observación del comportamiento de las células frente a distintas concentraciones de un soluto no permeable en el medio se puede determinar el potencial osmótico celular.
MATERIAL
1 bulbo de cebolla. 6 cubreobjetos. 6 portaobjetos. 1 gradilla. Microscopio.
6 tubos de ensayo de 15 mL. Sacarosa 1 M. Pipetas (1x10mL, 1x15mL y 1x2mL). 1 pipeta Pasteur con tetina.
MÉTODO
Preparación
Preparar 6 tubos de ensayo y rotularlos de la siguiente forma:
0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.
Preparar 6 portaobjetos y rotularlos igual que los tubos anteriores. Procurar que estén bien limpios y secos.
A partir de una solución de sacarosa 1M, preparar 10 mL de las siguientes concentraciones: 0.0, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 y 0.7 M
Agitar bien los tubos hasta que la solución obtenida sea perfectamente homogénea.
Depositar en cada portaobjetos una gota de la solución de sacarosa correspondiente.
Tomar un bulbo de cebolla, pelarlo, y separar una de las hojas.
Separar un fragmento de epidermis de aproximadamente 1 cm de lado y depositarlo inmediatamente en uno de los portaobjetos. Si queda arrugado se puede alisar con la ayuda de unas pinzas y una aguja enmangada.
Resumen del protocolo empeado en la práctica.
No No ppllaassmmoolliissaaddaass
Pl Plaassmmoolliissaaddaass
PL PLAASSMMÓÓLLIISSIISS IINNCCIIPPIIEENNTTEE
ESTUDIO DE LA REACCIÓN DE HILL EN CLOROPLASTOS AISLADOS Y SU
INHIBICIÓN POR DCMU
OBJETO : Estudiar la reacción de Hill en una suspensión de cloroplastos (previamente aislados) utilizando DPIP (2,6-diclorofenol indofenol) como aceptor artificial de electrones. Paralelamente, se determinará la inhibición de la fotólisis del agua a nivel de fotosistema II, utilizando para ello el inhibidor sintético DCMU (3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetil urea), empleado en agricultura como herbicida y conocido comercialmente como Diuron ®.
FUNDAMENTO : Robert Hill observó en 1.937 que al iluminar preparaciones acelulares que contenían cloroplastos en presencia de algún aceptor artificial de electrones (como podía ser el ferricianuro o algún colorante orgánico capaz de aceptar electrones procedentes de la fotólisis del agua), se producía desprendimiento de oxígeno y reducción del aceptor de electrones según la reacción:
LUZ 2A + 2H 2 O --------------> 2AH 2 + O 2 Ésta es la llamada Reacción de Hill, donde A=aceptor de electrones. En condiciones naturales, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. Estos aceptores naturales pueden ser sustituidos in vitro por el DPIP, compuesto que en solución y en estado oxidado presenta un intenso color azul, con un máximo de absorbancia a 590 nm, que mengua al ser reducido dicho compuesto.
MATERIAL:
20 g de espinacas. Centrífuga y 4 tubos de centrífuga de 50 mL de plástico con tapón, preenfriados. Mortero preenfriado. Espectrofotómetro.
Baño de hielo. Embudo Büchner, dos gasas y Kitasatos preenfriados. Papel de aluminio
Reactivos DPIP 0.2 mM DCMU: 0.5, 1, 2 y 3 μg/mL 14 tubos de ensayo de 10 mL. Sacarosa 0.5 M fría. Tampón fosfato 0.2 M pH 6.5 frío.
MÉTODO:
Realizar los dos apartados siguientes (a y b) en paralelo para que una vez obtenido el extracto pueda ser depositado en los correspondientes tubos inmediatamente.
a) Extracción de cloroplastos:
** Nota Preliminar: Las condiciones de frío bajo las cuales es necesario operar durante el aislamiento de los cloroplastos son necesarias para evitar la pérdida de actividad de los orgánulos. Por lo tanto, se ruega encarecidamente mantenerlos en frío usando los baños de hielo y procurando que las extracciones no alcancen temperatura ambiente hasta el momento de realizar la reacción y posterior lectura colorimétrica.
Pesar 20 g de hojas de espinaca, desprovistas de los peciolos y nervios principales.
Lavar con agua destilada y cortar en pequeños trozos.
Triturar el material en un mortero preenfriado, al cual se añadirán 10 ml de sacarosa 0. M. Mantener las condiciones de frío con un baño de hielo.
Filtrar el homogeneizado en un embudo Büchner bajo vacío a través de dos gasas. Añadir al mortero 40 ml de sacarosa 0.5 M (en volúmenes de 10 ml), hasta conseguir la recuperación total del triturado. Si no se dispone de trompa de vacío, se puede filtrar por gravedad hasta haber añadido toda la sacarosa y realizar el extracto mediante cerrando las gasas en foma de bolsa y estrujándola hasta que todo el líquido haya salido de ella.
Recoger el filtrado en un Kitasatos preenfriado y dispuesto sobre hielo.
Distribuir volúmenes iguales del filtrado en dos tubos de centrífuga preenfriados, equilibrándolos posteriormente a ojo.
Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 min. para eliminar trozos groseros de tejido, paredes celulares, etc. Tener preparados otros dos tubos de centrífuga para realizar la siguiente operación con rapidez.
Decantar cada sobrenadante, el cual contiene los cloroplastos, en sendos tubos de centrífuga preenfriados, equilibrándolos posteriormente.
Centrifugar a 3500 r.p.m. durante 5 min. para sedimentar los cloroplastos.
Desechar el sobrenadante. Añadir 12 mL de tampón fosfato 0.2 M pH 6.5 bien frío en cada tubo y resuspender, mediante agitación suave el sedimento. Reunir en un solo tubo las suspensiones de cloroplastos, agitar suavemente y,si es necesario, almacenar bajo refrigeración hasta el momento de su utilización.
RESULTADOS:
a) Anotar los resultados de absorbancia de los diferentes tratamientos.
ABSORBANCIA
SC SA 0 0,5 1 2 3
CON
LUZ
SIN
LUZ
b) Representar en una misma gráfica los resultados obtenidos, situando los valores de absorbancia en función de las cantidades de inhibidor (DCMU) utilizadas. Los valores correspondientes a los ensayos SC y SA pueden representarse en el gráfico por una línea paralela al eje de abscisas.
Abs 590
[DCMU] (μg/mL)
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA INDUCIDA POR EL
NITRATO
OBJETIVO: Inducir y estudiar la activada del enzima nitrato reductasa en cotiledones de plántulas etioladas de mostaza ( Sinapis alba L.), suministrando nitrato (su propio sustrato) al medio de cultivo.
FUNDAMENTO: La mayoría de las plantas son capaces de reducir el nitrato, la principal forma de absorción de nitrógeno por las raíces, hasta NH4+ y su incorporación a la materia
orgánica:N0^3 - NO^2 -^6 NH 3 2 e^ e^ - ^ ^ ^ . Por este proceso autótrofo, las plantas pueden sintetizar a partir de la forma inorgánica oxidada del NO3-, el nitrógeno reducido de los diferentes compuestos orgánicos: aminoácidos, ácidos nucléicos, alcaloides, etc.
Los nitratos son transportados, vía xilema, desde el lugar de absorción (la raíz) al resto de los tejidos de la planta.
La reducción de los nitratos puede ocurrir en la planta, tanto en los tejidos verdes (hojas), como en las células sin capacidad fotosintética (raíces). En los tejidos con cloroplastos no funcionales (p.e.: plántulas etioladas), la reducción de los nitratos va acompañada de un incremento respiratorio.
En las células eucariotas (hongos, algas verdes y plantas superiores), la nitrato reductasa cataliza la reducción del nitrato a nitrito utilizando el poder reductor de los piridín nucleótidos reducidos NADH/NADPH:
N0 3 -^ NAD( P) H + H + NO 2 - NAD( P) + H O 2 2 e^ .
Este enzima es una flavoproteína que contiene molibdeno. Se citan diferentes localizaciones del enzima nitrato reductasa a nivel celular (citoplasma) y a nivel subcelular (microcuerpos o incluso cloroplastos). Una proposición relativamente bien fundada establece su localización en la membrana externa del cloroplasto.
MATERIAL:
1er. día: NaOCl 1%. 9 placas de Petri. 225 semillas de Sinapis alba.
1 pipeta de 5 mL. Frasco para lavado.
2º día: Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL. Gradilla con 10 tubos de ensayo ( mL..) Gradilla con 9 tubos de ensayo ( mL).
Gradilla con 6 tubos de ensayo ( mL). Gradilla con 13 tubos de ensayo ( mL). Espectrofotómetro. Desecador conectado al vacío.
Reactivos: Molibdato sódico 150 nM. KNO 3 150 mM + Mo 150 nM. Tampón de extracción.
Ácido sulfanílico 1%. Naftiletilendiamina 0.05%. Nitrito sódico 1 mg/L.
Tomar 15 plántulas de cada placa (si no están germinadas, utilizar 15 semillas), seleccionando las mejor desarrolladas, e introducirlas en su correspondiente tubo. Someter todos los tubos a presión reducida, introduciéndolos en el desecador conectado al vacío. Dejar durante 25 minutos para favorecer la penetración del tampón. Mientras tanto, preparar la curva patrón (ver apartado siguiente).
c) Realización de la curva patrón:
Rotular 7 tubos de ensayo de 10 mL con las cantidades de NO2-^ a preparar. Preparar 5 mL de NaNO2 en cantidades de 0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8 y 1mg/L, diluyendo una solución acuosa de NaNO2 (1 mg/L). Agitar el tubo cada vez que se prepare una solución. Tomar otros 6 tubos de ensayo de 10 mL y rotular las concentraciones de nitrito al igual que en el punto anterior. Pipetear en cada tubo 3 mL de las cantidades de las concentraciones de nitrito preparadas.
d) Análisis del producto de reacción (NO2-).
Añadir a cada tubo, tanto a los 7 de la curva patrón (apartado c) como de análisis del producto (apartado b), 1 mL de naftiletilendiamina y 1 mL de ácido sulfanílico. Homogeneizar los tubos y dejar reposar durante 10 minutos. Mientras tanto, preparar 10 tubos de ensayo de 10 mL y rotularlos como en el apartado b). Transcurridos los 10 minutos, transferir a los tubos preparados en el punto anterior, la solución evitando que caigan en ellos las semillas. Recordar que el décimo tubo contiene el blanco y, que al no tener semillas, no es necesario proceder a su decantación. Leer la absorbancia a 540 nm tanto de la recta patrón, como de las soluciones ensayadas. Ajustar el espectrofotómetro con el blanco previamente preparado (tubo 10).
RESULTADOS:
Calcular y representar gráficamente la curva patrón.
Abs 540 nm
mg/L NO2- Abs = __________ [NO2-] + ___________ r= __________
a) A partir de la recta anterior, calcular la concentración de nitrito en cada una de las muestras analizadas.
(mg/L NO 2 - )
Tratamiento
Tiempo de inducción
H 2 O Mo NO 3 -^ + Mo
ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN TERPÉNICA DE UN ACEITE ESENCIAL
OBJETIVO
Determinar la presencia, mediante cromatografía de capa fina en silicagel, de mentol en el aceite esencial de Mentha piperita comparando con un patrón de mentol.
FUNDAMENTO
Los aceites esenciales consisten en una mezcla de compuestos de naturaleza mayoritariamente terpénica presentes en la planta y que son productos del metabolismo secundario. Son sustancias solubles en disolventes orgánicos y detectables mediante cromatografía debido a su capacidad de ser coloreados mediante el ácido fosfomolíbdico. El procedimiento habitual es la extracción mediante corriente de vapor o mediante ebullición en presencia de un disolvente orgánico como el metanol.
El constituyente principal del aceite esencial de la hierbabuena ( Mentha piperita ) es el mentol, el cual será analizado en esta práctica mediante cromatografía en capa fina.
MATERIAL
1 gramo de Menta seca. Baño de agua a 60 °C Erlenmeyer de 100 mL Embudo Pera de succión
Pipetas Pasteur Cámaras de desarrollo y tapones herméticos 2 cromatofolios Papel de filtro
Reactivos: Metanol Acetato de Etilo Tolueno
Revelador (ácido fosfomolíbdico) Solución patrón de Mentol
MÉTODO:
Poner los dos cromatofolios en la estufa de 100 °C durante al menos 30 min. Marcar en éllos una línea a 2 cm. sobre el borde inferior, sobre la que se aplica la muestra.
Extracción del aceite esencial:
Pesar 1 gramo de hojas secas de Menta, y triturarlos, en un mortero de vidrio, hasta obtener un polvo fino.
Llevarla a un Erlenmeyer de 100 mL, y añadir 25 mL de Metanol (MeOH).
Cubrir el matraz con un embudo,
Poner el erlenmeyer al Baño María (60 °C), a reflujo, durante 15 minutos.
Transcurrido el tiempo, sacarlo y dejar enfriar.
Filtrar la mezcla, empleando el mismo embudo utilizado para tapar el matraz, y recoger el filtrado en un tubo de ensayo.
Preparar mientras transcurren los 15 minutos, la fase móvil de la cromatografía: Acetato de Etilo:Tolueno (0.5:9.5). Preparar 2 cámaras de desarrollo pipeteando 3 mL de la fase móvil en cada cámara. Desechar el volumen restante en el recipiente indicado.
Trasvasar 1 mL del extracto obtenido a un tubo de ensayo a parte. Aplicar el extracto obtenido en el cromatofolio, previamente activado, mediante el uso de una micropipeta. Realizar esta aplicación gota a gota y esperando a que la gota acabada de aplicar se seque antes de aplicar la siguiente. PROCURAR NO TOCAR EL CROMATOFOLIO CON LA PUNTA DE LA PIPETA.
Coger la solución patrón de mentol y aplicar 1 mL de la misma en el otro cromatofolio. Tratar de la misma forma que la muestra.
Poner el cromatofolio, una vez se ha secado la muestra aplicada, en la cámara de desarrollo y dejar que el frente de disolvente ascienda 15 cm.
Una vez hayan alcanzado dicha altura, sacar los cromatofolios de la cámara y dejar que se sequen. Colocarlos en la campana extractora y pulverizar sobre ellos el ácido fosfomolíbdico (revelador).
Colocar los cromatofolios en la estufa de 100 °C entre 1 y15 min. hasta que aparezcan las manchas, vigilándolos continuamente. RESULTADOS Anotar las manchas aparecidas en el cromatograma y, por comparación con el cromatofolio del patrón, identificar el mentol y calcular su Rf (Rf = recorrido de la mancha / recorrido del frente de disolvente).