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Laboratorio espectofotometria, Guías, Proyectos, Investigaciones de Bioquímica Médica

Universidad Nacional de ColombiaBioquímica Médica

guia laboratorio espectofotometria

Tipo: Guías, Proyectos, Investigaciones

2017/2018

Subido el 29/07/2018

kalbarracin
kalbarracin 🇨🇴

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PRACTICA 1
Horas de estudio no Presenciales: 3 horas
COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA
OBJETIVOS GENERALES:
1. Conocer los principios básicos de los métodos para la medida de concentración de las
sustancias.
2. Establecer diferencias entre Transmitancia y Absorbancia.
3. Realizar una curva espectral, una curva de calibración y establecer sus diferencias.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Reconocer y comprender los principios teóricos que se aplican en el empleo del
espectrofotómetro en la Bioquímica.
2. Identificar las soluciones seriadas que servirán como muetras para la construcción de la
curva espectral y luego para determinar las concentraciones en la curva de calibración.
3. Construir una curva espectral con una solución de Azul de metileno
4. Construir una curva de calibración con las diluciones seriadas.
5. Hallar la concentración de la solución problema de azul de metileno
CONSULTA DE PRE-LABORATORIO
1. Realice una tabla estableciendo las principales diferencias entre absorbancia y
transmitancia
2. Identifique cual es el rango del espectro en el cual absorbe y emiten los siguientes
compuestos: clorofila, hemoglobina, cafeína y riboflavina.
3. Cual es la importancia de una curva de calibración. Cual es su utilidad en el diagnostico
bioquímico?
4. Cuales son las características de un blanco
5. Cuales son las carcteristicas de un patrón
6. Que es exactitud, precisión y sensibilidad y cual es la importancia en el diagnostico
clínico?
A. COLORIMETRIA
Muchos experimentos bioquímicos incluyen la medición de un compuesto o grupo de
compuestos que hacen parte de una mezcla. Una de las técnicas más usadas para determinar
la concentración de dichos compuestos es la Colorimetría. El fundamento de la técnica se
basa en que si se pasa luz blanca a través de una solución coloreada, algunas longitudes de
onda se absorben con preferencia sobre las otras. Figura 2.1
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¡Descarga Laboratorio espectofotometria y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Bioquímica Médica solo en Docsity!

PRACTICA 1

Horas de estudio no Presenciales: 3 horas COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA OBJETIVOS GENERALES:

  1. Conocer los principios básicos de los métodos para la medida de concentración de las sustancias.
  2. Establecer diferencias entre Transmitancia y Absorbancia.
  3. Realizar una curva espectral, una curva de calibración y establecer sus diferencias. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
    1. Reconocer y comprender los principios teóricos que se aplican en el empleo del espectrofotómetro en la Bioquímica.
    2. Identificar las soluciones seriadas que servirán como muetras para la construcción de la curva espectral y luego para determinar las concentraciones en la curva de calibración.
    3. Construir una curva espectral con una solución de Azul de metileno
    4. Construir una curva de calibración con las diluciones seriadas.
    5. Hallar la concentración de la solución problema de azul de metileno CONSULTA DE PRE-LABORATORIO
    6. Realice una tabla estableciendo las principales diferencias entre absorbancia y transmitancia
    7. Identifique cual es el rango del espectro en el cual absorbe y emiten los siguientes compuestos: clorofila, hemoglobina, cafeína y riboflavina.
    8. Cual es la importancia de una curva de calibración. Cual es su utilidad en el diagnostico bioquímico?
    9. Cuales son las características de un blanco
    10. Cuales son las carcteristicas de un patrón
    11. Que es exactitud, precisión y sensibilidad y cual es la importancia en el diagnostico clínico? A. COLORIMETRIA Muchos experimentos bioquímicos incluyen la medición de un compuesto o grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Una de las técnicas más usadas para determinar la concentración de dichos compuestos es la Colorimetría****. El fundamento de la técnica se basa en que si se pasa luz blanca a través de una solución coloreada, algunas longitudes de onda se absorben con preferencia sobre las otras. Figura 2.

Para el caso de la absorción de radiación visible, muchos iones o moléculas o son coloreados, o pueden reaccionar con una substancia coloreada o pueden formar en algunas de sus reacciones una substancia coloreada. Cada una de estas situaciones presenta la posibilidad de efectuar una determinación analítica cuantitativa. La mayor ventaja de este método consiste en que no es necesario el aislamiento del compuesto y así se pueden determinar los constituyentes de una mezcla compleja tal como la sangre Figura 2.1 Porqué son coloreadas las soluciones? . PARTES DE UN COLORIMETRO. Figura 2. La luz blanca emitida por una lámpara de tungsteno pasa a través de una rendija (apertura), y luego a través de un lente condensador que vuelve paralelos estos rayos que van a incidir sobre la solución problema (generalmente es coloreada o tiene la capacidad de absorber la luz) la cual se coloca en la celda o cubeta. La cubeta es generalmente de vidrio de paredes paralelas con 1 cm de separación entre ellas en la mayoría de los casos, esta distanciase conoce como paso de luz. El Filtro puede estar colocado antes o después de la cubeta y su color se selecciona para permitir la transmitancia máxima del color no absorbidodia. El color del filtro debe ser complementario al de la solución que se estudia, por ejemplo, si se quiere examinar una solución de color azul, se selecciona el filtro rojo que es complementario y permite la transmisión máxima del color no absorbido (azul) o dicho de otra forma el filtro rojo no absorbe Luz incidente Blanca Rojo Amarillo Azul (^) Amarillo Azul Verde Luz absorbida por la solución coloreada Roja Luz emergente y por consiguiente color de la solución verde

Fuente de energía radiante Hendidura De entrada Filtro (^) Hendidura de salida Cubeta Detector Pantalla

Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta: Ι = Ιo. e-k 2.c Dado que las dos características de la solución influyen en la magnitud de la intensidad emergente, surge la ley combinada de Beer Lambert****. Ι = Ιo. e-k 3.c.l Transmitancia y Absorbancia La concentración de la sustancia desconocida, puede calcularse en % transmitancia o en unidades de Absorbancia. El cociente de las dos intensidades, I/Io, se conoce como TRANSMITANCIA y se expresa como un porcentaje. %T= Ι / Ιo = luz transmitida (solución problema) luz incidente (solución blanco) Expresado en términos de Logaritmos:

  • Log Ι / Ιo = k.c.l Log Ιo / Ι = k.c.l. = Absorbancia = A k = Constante que depende de la longitud de onda, de la naturaleza del medio y del espesor. Conociendo %T de una solución coloreada se puede determinar su ABSORBANCIA. T = 100 __Ι __ Ιo Expresando en Logaritmos: Log % T = Log 100 + Log Ι / Ιo; como A = Log Ιo y Log 100 = 2 Ι entonces: Log %T = 2 - A por lo tanto: A = 2 – Log % T ABSORBANCIA = EXTINCIÓN = DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) Para buscar la concentración de una sustancia desconocida por colorimetría las lecturas deben hacerse en %T ya que la escala de lectura es lineal porque está dividida homogénaemente en 100 partes iguales lo que hace su medición más exacta; la escala de Absorbancia o extinción es logarítmica, se extiende de cero a dos con divisiones desiguales haciendo poco exacta la lectura principalmente en los valores altos. Sin embargo, en la

práctica debe emplearse valores de Absorbancia, que pueden hallarse mediante la fórmula o mediante una tabla de conversión para cada valor de transmitancia. Con valores conocidos de A o %T, es posible hallar la concentración de una sustancia desconocida (solución absorbente). La relación entre la concentración y el % T no es lineal, por lo cual se requiere muchos puntos para lograr una medición exacta; en contraposición existe una relación lineal entre la concentración y la Absorbancia. (Figura 2.5.). Figura 2. 5 Relación entre la absorción de la luz y la concentración Por lo tanto con un solo punto dado por el patrón (Estándar de concentración conocida) es posible trazar una curva correcta teniendo en cuenta solo si se ha establecido la relación lineal (o rango lineal) y descartando los rangos de desviación tanto a altas concentraciones como a bajas concentraciones Limitaciones de la Ley Beer Lambert Para que se cumpla la Ley combinada deben darse las siguientes condiciones:

  1. La luz preferiblemente debe ser monocromática o la longitud de onda debe estar entre límites muy estrechos.
  2. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución. Esto permite conseguir la sensibilidad óptima.
  3. No debe haber ionización, asociación, disociación o solvatación del soluto con respecto a la concentración o el tiempo.
  4. La ley sólo se cumple hasta cierto límite máximo de concentración, característico de cada sustancia (Linealidad). B. ESPECTROFOTOMETRIA
  1. Conecte y encienda el espectrofotómetro, de acuerdo a las indicaciones hechas por los docentes
  2. Tomar una alícuota de una solución de azul de metileno aportada por los docentes a cargo de la practica
  3. Medir esta alícuota en una celda de espectrofotometría limpia
  4. Introduzca esta celda con el lado liso frente a usted
  5. Inicialmente debe llevar a blanco con agua destilada y cada vez que cambie de longitud de onda debe repetir este procedimiento
  6. Inicie la medición de la absorbancia del compuesto desde 380nm hasta 700nm, de 20 en 20nm y registre los datos de absorbancia en una tabla
  7. Realice una grafica de los cambios en absorbancia registrados y establezca el punto de máxima absorbancia. II. ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN Debe conocerse la longitud de onda o el rango óptimo de Absorbancia para la sustancia a analizar (que ha sido hallada mediante una curva espectral). Figura 2. 6. Curva espectral. Los %T se transforman a Absorbancia (D.O)

Se realiza en papel milimetrado una curva resultante de graficar en la abcisa las diferentes concentraciones de los patrones procesados y en la ordenada las absorbancias correspondientes a cada uno. Si se cumple la ley de Beer Lambert uniendo los puntos se obtendrá una recta, dentro de un rango de absorbancia vs. Concentración. Tambien se determinarán los rangos de desviación. Solo con el rango lineal posible hallar cualquier concentración desconocida de la sustancia analizada, si interpolamos sobre la ordenada el dato correspondiente a la Absorbancia del desconocido en la abcisa. Dado que muchas curvas cumplen las leyes de Beer Lambert por la ley matemática de proporciones, se cumple: Absorbancia 1 Absorbancia 2 ____________ : _____________ Concentración 1 Concentración 2 Dado que conocemos la concentración del patrón estándar y las absorbancias de ambos casos, del patrón y de la muestra, es posible, despejando, hallar la concentración desconocida: _A standard (A St ) = _A muestra (A m) ; C muestra = A m (^) X C St C standard (C St ) C muestra (C m) A St En donde: A = Absorbancia m = Muestra C = Concentración St = Estándar o patrón Factor = C St A St RECORDAR QUE ESTA PROPORCION ES VALIDA SOLO SI YA ESTÁ COMPROBADO QUE LAS CURVAS CUMPLEN LAS LEYES DE BEER LAMBERT, POR ELLO EN ESTA PRACTICA NO REALIZARÁ ESTA RELACION MATEMATICA. PROCEDIMIENTO

  1. Partiendo de diluciones seriadas de concentración conocida y habiendo realizado la curva espectral con la que determinó su longitud de onda optima. Ajuste el equipo en esta longitud de onda y calíbrelo utilizando agua como blanco de reactivos.
  2. Lea la absorbancia de cada una de las diluciones aportadas y registre el dato en una tabla