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Asignatura: Estructura de Macromoléculas, Profesor: Mauricio García Mateu, Carrera: Bioquímica, Universidad: UAM
Tipo: Apuntes
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También podríamos unir con el compuesto, y hacer algo con él. La naturaleza lo ha resuelto con la adecuada secuencia de aa en la proteína. Hay varias funciones que se basan en la unión a un ligando que dará lugar a un resultado biológico. Si este compuesto se le une una secuencia con otra función por ejemplo citotóxica podemos hacer una función biológica. La naturaleza lo ha resuelto hace mma y millones de veces con diferentes problemas y nosotros lo hemos descubierto y usado. Debe de plegarse, complementaria en parte y específica al ligando Unirse al ligando, con alta o baja especificidad o alta o baja afinidad dependiendo de su función. A veces no es lo más adecuado usar proteínas, dependiendo del problema y de lo que podemos usar en ese momento. Quimioterapia: Artificial efecto 2º, Inespecífico ya que mata todo lo que pille. 3º en concentración alta…. No hemos sabido hacerlo aún en proteínas Proteínas son moléculas grandes, no se trasportan fácilmente en la célula pero si le añadimos un péptidos trasportador viral como el receptor y péptidos de fusión del VIH (en liposomas), se trasporta dentro de la célula o con terapia génica podremos incluir el gen de interés. Sustitución de fármacos habituales por proteínas introducidas directamente o con terapia génica, además éstas pueden funcionar fuera de las células con lo cual el transporte no sería un problema. Además puede ser degradada por proteasas tiene el beneficio de carecer efectos 2º o de acumulación. En industria, los catalizadores no son biocatalizadores, los biocatalizadores funcionan con una Tº moderada con disolventes, con Ph a 7… los catalizadores biológicos resolverían el problema de contaminación, de especificidad… pero no aguantan esas condiciones por lo que se están modificando para que aguanten. Sino conocemos la estructura de proteínas difícilmente podemos usarlas para aplicarlas en industria-biomedicina. Si nos olvidamos de la investigación básica no podremos aplicarlo. Podemos si sabemos la estructura y predecirla: prevenir o curar enfermedades o usarlos con fines industriales y si sabemos porque funcionan podemos utilizar comos se pliegan para utilizarla ese conocimiento aplicado. Problemas que tenemos hoy en día Plegamiento: como una determinada secuencia se pliegue en 3D. Cual es la relación entre la estructura/conformación, y su función. Estos dos problemas son los que nos interesan el 2º se divide: 2a) Estructura y la capacidad de unir a un determinado ligando 2b) la capacidad una vez unido de realizar una actividad específica de la proteína (Catálisis , transporte….) Una secuencia de aminoácidos (polímero) que se une con alta afinidad y especificidad y que cuando se una con el ligando, haga algo con el, se consigue dando una secuencia de aa adecuada sabemos que se puede conseguir, la actividad es muy variada, y además sabemos que las propiedades sino son las adecuadas, si la secuencia la modificamos , la podemos modificar su naturaleza y sus características como las propiedades de resistir en determinadas condiciones no naturales-fisiológicas Están potencialmente presentes en la secuencia de la proteína: mayor interés tanto básico como aplicado.
Inconvenientes: no llega a resolución atómica necesitamos algo más poderoso para ver realmente la posición atómica ya que veremos al complejo molecular su forma 3d en general y no detallada. Debemos de ir a cristalografía o RNM. SIN DETALLE ATÓMICO PERO es superior que la microscopía electrónica con tinción negativa. No hay muchas diferencias técnicas respecto a la ME normal. La diferencia es que la muestra se congela a una bajísima Tº, tiene ventajas: Combinada con un procesamiento de imágenes: un montón de fotos de moléculas individuales depositados en la rejilla, las moléculas caen al azar, y caen en diferentes orientaciones. Se procesa electrónicamente en el ordenador, mediante un proceso matemático que realiza una reconstrucción en 3D de la molécula visualizada. Permite una alta resolución, combinando a que la muestra no se mueve porque esta fría. No hay tinción negativa que formaría una “Costra” que no nos deja verla bien. Podemos ver el interior de la molécula, porque debido a que la muestra no está teñida, los electrones pueden ser absorbidos a diferentes capas: pede verse su interior por capas. Una pequeña proteína no se le puede ver bien en detalle ya que difícilmente podemos ver las distancias atómicas y átomos individuales (10 A de máximo poder resolutivo). Pero se puede ver como se ensamblan las diferentes proteínas o por ejemplo la topológica de un complejo macromolecular, si nos interesa ver cual es la topología real de cada subunidad en su conjunto (virus, chaperonas, …). Además permite estudiar también grandes movimientos conformacionales en la molécula de varios A. PO REJEMPLO UN VIRUS, con su anticuerpo: respecto a la forma externa de la cápsida dond se une el anticuerpo, en que punto exacto( sin que nos interese las relaciones atómicas que puedan existir). Podemos ver tb en un bacteriófago donde estan las proteínas estructurales y en que posición en el interior. El DNA se ve que está ordenado en forma de capas de cebolla. No se ve en detalle pero se ve que está ordenado, compactado. Se ve el mecanismo de inyección dentro de la cápsida. Podemos ver estructuras tanto estáticas como también dinámicas, a lo largo de un proceso. Chaperona: proteína grande que ayuda a plegarse a las proteínas de las células, las chaperoninas tiene en forma de barril “dos donut puestos en columna” cada uno de ellos con 7 subunidades por ejemplo “groE”. Hay un agujero central. La proteína desplegada entra en el agujero, y entonces es tapado el agujero con una proteína más pequeña llamada gro L. Dentro la proteína desplegada tiene plena disposición para plegarse, sin interacción con otras proteínas. El problema que tiene las proteínas desplegadas se puede agregarse por interacciones hidrofóbicas. Si esto no funciona se pueden agregar (sus sitios hidrofóbicos) y por ello producir la muerte celular Y CIERTAS PATOLOGÍAS COMO EL Alzheimer. (no pueden ser atacadas por los proteasomas). en la chaperonina solo entra 1 molécula, como está aislada no puede agregarse, con el tiempo se pliega: eliminamos el problema de la plegación aislando la molécula. Requiere ATP y requiere un cambio conformacional, el hueco se expande y se contre, el ATP cambia la conformación, ese movimiento, sabemos que existe porque hemos tomado microfotografías con ATP y sin ATP. Grupos : carrascosa trabajan mucho con microscopia electrónica. Otro tipo de microscopía más exótica: microscopía de proximidad. Microscopía de forma fuerzas atómicas por ejemplo aquí representamos un experimento: visualizar el virus diminuto del ratón mMVL, modelo viral que tiene importancia para la terapia génica, es muy pequeño y muy simple: lo más sencillo que podemos estudiar en un virus animal (parvovirus). En La microscopía de fuerza atómica AFM, ponemos el virus en una superficie parecida a la microscopía electrónica, pero lo mantenemos en líquido y tº ambiente fisiológicos. Utilizamos una palanca con una punta tan fina que posee sólo unos pocos átomos en el extremo, si deslizamos la superpie en una determinada dirección, toca la superficie y sube hacia arriba es como el “braile” la palanca se levanta ligeramente. La palanca tiene un pequeño espejo que refleja una rayo láser, el ángulo de reflexión depende de lo levantada que está. Hay que barrer el eje x y en el eje Y. La punta del microscopio “siente” la forma como es tan fina, es capaz de resolver alturas y diferencias muy pequeñas, técnica revolucionaria para ver materiales biológicos. Que es lo que no podemos esperar de esta técnica: No podemos obtener de la resolución atómica, no acaba en un átomo. Entonces tiene un poder resolutivo de varios A, al menos 2NM = CRIOSCOPÍA ELECTRÓNICA. Vemos una sola molécula si dos moléculas en la misma especie se diferencian en la conformación cuando obtengamos la imagen, y
no podemos ver que hay 2 formas distintas, en la AFM no hace un promedio, sino da una información individuales. Permite trabajar con moléculas individuales. No como la criomicroscopía. Del interior no podemos decir nada. Vemos en virus individuales: si sabemos cual es la simetría de la partícula, como es icosaédrico, donde haya 5 caras y ejes de simetría quinaria, y 3 caras trinaría con 1 eje, y dos caras con un eje binario. Tiene tal poder de resolución que podemos ver las orientaciones del virus. La ventaja de esto es que podemos apretar ese objeto, y podemos ver la textura del objeto. ¿Es importante que un objeto biológico sea “duro o blando”?. Orientación de 5 caras: Se deforma más que en un eje de 3 que un eje de 2. Tiene una resistencia mecánica anisotrópica. Por el eje de 5 hay un poro donde ocurre el fenómeno de inyección del interior de la partícula del virión, es Esto es necesario para que llegue a infectar. Existe una señal que induce la salida al exterior. Para que salga por ese hueco es necesario un cambio conformacional mecánico. Necesita ser rígido para resistir las agresiones mecánicas, ser robusto, pero si es demasiado duro-rígido en esa zona, no puede ocurrir un cambio conformacional para que el virus sea infectivo. La cápsida es seleccionada para que sea dura experto esta zona. Cuando quitamos el DNA del virus, y repetimos los experimentos es = De blando x todos los lados. El virus utiliza el DNA para contrafuerte molecular. Lo lleva pensar para aprovechar el DNA como un contrafuerte, ¿qué segmentos son los contrafuertes?, estos segmentos se pegan en las paredes de la cápsida, en los ejes de 3 y eje de 2. Se pega una proteína a la superficie. Se funcionaliza la punta con un compuesto que tenga la afinidad por la proteína, que se une covalentemente a la proteína y éste lo unimos con la punta que lo tira de la punta para arriba, la proteína se despliega podemos medir los pico-newtons, la fuerza necesaria para desplegarse. Que fuerza mantiene plegada la proteína?. Tanto las 2 son bastante resolutivas peor no llegan a nivel atómico. Para llegar a nivel atómico recitamos una imagen atómica donde sabemos con precisión la posición de ccada uno de los átomos de la proteína. Para ver la posición de cada átomo en la proteína: sólo hay dos técnicas. Cristalografía de Rayos X y electromicroscopía de RMN. x-x- 08 Para profundizar en la referencia 6 : crioscopia electrónica. En cristalografía la más recomendable es la 6 y la referencia 16 matemáticas avanzada, y 17. Hay cristalógrafos en el CNIO! Cristalografía de rayos X: máximo poder resolución a casi décimas de A. La cristalografía de rayos X es una técnica consistente en hacer pasar un haz de rayos X a través de un cristal de la sustancia sujeta a estudio. El haz se escinde en varias direcciones debido a la simetría de la agrupación de átomos y, por difracción, da lugar a un patrón de intensidades que puede interpretarse según la ubicación de los átomos en el cristal, aplicando la ley de Bragg. Es una de las técnicas que goza de mayor prestigio entre la comunidad científica para dilucidar estructuras cristalinas, debido a su precisión y a la experiencia acumulada durante décadas, elementos que la hacen muy fiable. Sus mayores limitaciones se deben a la necesidad de trabajar con sistemas cristalinos, por lo que no es aplicable a disoluciones, a sistemas biológicos in vivo, a sistemas amorfos o a gases. La cristalografía de rayos X desempeñó un papel esencial en la descripción de la doble hélice de la molécula de ADN (Véase también: Rosalind Franklin, James D. Watson, Francis Crick). Esta técnica se utiliza ampliamente en la determinación de las estructuras de las proteínas. Si incidimos luz en una cartulina con una forma determinada una luz monocromática con una longitud de onda y colimada (en la misma dirección, no se dispersa, eso es la luz láser) en el perímetro se dispersan los fotones. Ponemos detrás una pantalla y vemos un patrón de difracción junto de rayos dispersado por un objeto que llega en esa zona. Las zonas llegan luz o no. Depende de cómo disperse los fotones y como los dispersados interfieren de forma + o -. El patrón de difracción es un conjunto de luz y sombras que depende de la forma del objeto que difracta los fotones.
ha hecho interfiere en la cristalización. Para proteínas transmembrana hay que añadir detergentes a baja concentración para no desnaturalizar para mantenerla en disolución. No se sabe muy bien las condiciones de cada proteína : ensayo y error: Tº, sal, aditivos, etc. Se hace en una cámara una habitación especial con la Tº controlada, … es muy engorroso. Lo intentan con varias porque nunca sale a la primera. Es un paso crucial. Por eso se suele encargar a alguien que lo haga y lo hace para varios a la vez y así no estar de brazos cruzados sino sale. Ejemplo: proteína globular dimérica de cada una 20KDA , soluble en agua. Sabemos la secuencia de aminoácidos hemos obtenido grandes cantidades gracias a DNAc Es necesario obtener una cantidad de mgr. Hace falta tiempo meses, semanas o años en cristalizar. No se sabe bien las reglas exactamente, no podemos predecir lo que va a pasar, puede que no cristalicen nunca. Si queremos los cristales más grandes posibles: al existir más proteínas, aumenta de intensidad el patrón de difracción. Sino aumentamos la intensidad de los rayos X. Los aceleradores de partículas: fuentes de rayos X de alta intensidad. Radiaciones obtenidas en aceleradores de partículas: sincrotrón , pero las proteínas se calientan y puede destruir la molécula (radicales libres) se mantiene la tº fría pero aún así es mejor reducir el tiempo de exposición. Tiene que es un cristal perfecto con la misma orientación, el patrón de difracción es más nítido si están ordenadas sino se hace más borroso, ya que es la suma de las moléculas individuales. El movimiento térmico puede mover las moléculas: borroso, se intenta entonces bajar la tº , y el orden: jugar con las condiciones de cristalización. Se forma un Cristal molecular: formado puramente por operaciones de traslación no son superponibles, moléculas que se encuentren a distancia relativas que no pueden obtenerse la misma estructura solo de traslación no podemos cambiar la posición para obtenerla: celdilla asimétrica. Si hay que rotarla forma la misma celdilla unidad. Si la consideramos las dos moléculas en este caso como un todo y la trasladamos en h o v en el espacio encontramos una posición idéntica (la celdilla como un todo), este conjunto de estas dos moléculas forma la celdilla unidad. Dependiendo de las operaciones de traslación tendremos un cristal cúbico…. Cúbico: la misma distancia del eje X Y Z par obtener la posición de la siguiente celdilla los ángulos de desplazamiento tiene que ser ortogonales: 90º. ALFA, BETA Y GAMMA= 90, A=B=C Hay que saber la forma del cristal porque patrones de cristalización de la misma proteínas da patrones de difracción diferentes. Lo que resuelve la cristalografía es la celdilla unidad. Si no forma 90º y los lados diferentes : cristal triclínico, cada uno de ellos da un patrón de difracción. Los cristales son sólidos aparentemente pero hay agua por lo que son muy blandos no como los iónicos. Hay huecos enormes entre moléculas, hay agua más del 50% , están en un perfecto estado de solución aunque no se puedan mover, están en condiciones fisiológicas. No hay ningún problema en su estructura está probado experimentalmente, pero están inmovilizadas para moverse: interacciones no son covalentes entre ellas aunque sean iguales, no son muy fuertes porque no está preparada para ello no es natural, pero hay zonas expuestas de la proteína que son complementarias con otras zonas de la molécula. No son uniones tan fuertes como la unión a ligandos que sí que están evolucionadas para ello. Por lo tanto es un cristal molecular frágil, que se rompe fácilmente. Para estar en el sincrotrón, hay que convencer a un comité: competir por el tiempo usado. Focos de difracción en un átomo: el núcleo puntual es un foco de difracción. La densidad electrónica (otro punto) baja con al distancia del núcleo. La zona de difracción son las cercanías del núcleo atómico (los fotones interactúan con los electrones porque son ondas electromagnéticas) pero en la práctica es como si fuera el propio núcleo. Cuando interpretemos el patrón de infracción lo que vemos es la nube de densidad electrónica. El patrón de difracción es bidireccional aunque el cristal es tridimensional hay que girar el cristal para conseguir un conjunto de patrón de difracción para poder tenerlo en 3D. Cada mancha del patrón de difracción que tiene 3 posiciones en el espacio porque el patrón de difracción es esférico. Además hay que tener en cuenta los ángulos, distancias dependiendo del tipo de cristal, hay que dar la posición de cada manca respecto a un eje no ortogonal, y la densidad de la mancha que depende de la amplitud de la onda del fotón (densitómetro).
La fase del fotón no se puede medir directamente pero sí por procesos matemáticos conocer las fases de difracción que es bastante complejo por los métodos de : molecular replacement, anomalous scatteing, lisomorphous replacement.
. VAMOS A DETERMIANR LA DENSIDAD ELECTRÓNICA CON UN número, sin saber si están los átomos o no, donde encontramos alta densidad electrónica: núcleo atómico y cuando hay baja no tomamos que hay núcleo. Hay que tomar puntos cada 0.1 a por ejemplo, con coordenadas XYZ cual es su densidad electrónica. la densidad electrónica en un punto = 1/volumen de la celdilla unidad sumatorio de cada coordenadas de cada punto. Fórmula:
Pone la resolución. 4 A de resolución, no vemos bien las cadenas laterales, la estructura no va a ser buena, 1.5 A cada protuberancia aunque sea de un solo átomo queda definida, incluso aparece el hueco central de electrones del ciclo. Casi sin errarla posición de los átomos Coordínate error, alrededor de 0.23 A. Como la longitud del enlace es 1, algo, es una precisión enorme, es para decidir si merece la pena usar estos datos o no. El Ph tb viene de cristalización. Contenido del agua en el cristal, condiciones fisiológicas e incluso podríamos meter el sustrato en el cristal y la enzima funcionaría. Hay que poner un agente reductor para que no se oxide en el proceso de cristalización etc. Coordenadas de cada átomo! Factor B: movilidad de cada átomo en el cristal, ya uqe los átomos por movimiento browniano están físicamente moviendo vibrando, o la posición del átomo en cada cristal esta un poco cambiado de lugar o la vibración. Es mejor que sea bajo. Anda pone hasta las coordenadas del agua coordinadas con la proteínas, fijadas en el cristal, pegadas a la proteína, primera capa de hidratación. END: final. Con el programa RASMOL podemos ver la estructura de la molécula 20 - X- 08 LA IDEA FINALISTA EN BIOLOGÍA HAY QUE DESTERRALA, Pensamos porque somos como somos y no al revés. Las moléculas más complejas del universo son las proteínas. Pocas expectativas podremos tener, vamos a gastar el dinero o el tiempo en nada. Para usar el programa: Rasmol: freeware hay direcciones y tutorials para poder usarlo. En la referencia 6: usar la programa de visualización. Es un dímero viéndolo por el backbone (cada vertice un Calfa) y con cartoons: líneas: bucles hélices alfa, vemos el fold, la arquitectura básica proteica. Como los dos monómeros son idénticos, Los primero aminoácidos de la proteína se mueven no están fijados en el cristal ni tiene una estructura ni los vemos ni los interesa demasiado. CPk: azul al N rojo O gris a C amarillo al azufre (para ver el puente disulfuro Hay qe leer y trabajar con este programa Triptófanos: floróforos, ver fluorescencia intrínseca de try. El Tryp sale hacia fuera en el monómero peor es hdrofóbico!, pero en el dímero entra dentro del monómero. Estos dos triptófanos, so determinante a la dimerización, es una concavidad los que lo rodea, son hidrofóbicos, las formas de la cabeza del triptófano, y realiza enlaces hidrofóbicos en los aminoácido de alrededor. Si queremos hacer un monómero, mutamos el TRt, eliminamos el triptófano por alanina. Sino mutagenizar al azar, para que no pierda el plegamiento. Podemos cortarla: efecto hidrofobito de los aminoácidos de alrededor del TRY.. hace de llave para dimerizar, poniendo en contacto los dos monómeros. Lo polar fuera lo apolar fuera. Termodonámicamente favorable. No e ve ningún H. Las aguas son parte de la estructura de la proteína, solo se ven las fuertemente pegadas, difractan en la misma posición los rayos X. Y otras temporalmente. Espectroscopía RMN. La cristalografía lleva funcionando 40 años, pero la RMN empezó a los años 80. Es mucho más joven. Van creciendo cada vez más en RMN, el modelo es distinto, el principio físico es distinto. Referencias: no evalúan: capitulo de la referencia 8 menciona lo básico. Más allá. Capítulo de la referencia 6, moreno y sancho. Referencia 15 especializada.
Nos centramos en los núcleos atómicos, los núcleos de hidrógeno. Bien definidas en la estructura de la proteína, estos que no se veían en cristalografía, si se ven en RMN. Los núcleos atómicos tiene su momento magnético, con un vector, porque giran como un planeta. RMN: orientamos en la misma relación los momentos magnéticos de todos los núcleos (Especialmente el de H que tiene un momento magnético menor): orientar con otro imán. RMN utiliza campos magnéticos muy potentes. Hay dos posiciones del espín del protón para un campo magnético: + 1/” y - 1/2 para el estado del núcleo atómico. La diferencia de energía es pequeña pero medible. Hay una pequeña diferencia dependiendo con qué átomo está enlazado. Se excita el nivel mas energético con radiofrecuencia con una lambda muy grande, con un pulso de radiofrecuencia: se hace una serie de pulsos, con un resultado complejo; se relaja la situación, y se deja que los núcleos decaigan a su estado fundamental , que es cuando emite un cuanto de energía del nivel excitado al basal: fotón de longitud de onda de radio, se obtiene un patrón de ondas de todos los núcleos atómicos de hidrógenos ( a una L determinada para que no emita otros átomos);. El ensayo se realiza en un tubo de 0.5ml de proteína muy concentrada, cuanto más moléculas es más fácil de detectar. En ambos casos se necesita gran cantidad de proteína pero no hay que formar cristales, nos ahorramos esperar meses, o que no cristalice nunca. La cantidad de proteína es mucho mayor en RMN (0,5ml), pero hay que hacer pocos intentos, con lo cual al final la cantidad de proteína puede ser menor. Orientamos los núcleos de hidrógenos, damos un pulso de radiofrecuencia, le dejamos que se relaje, y vemos el fotón emitido en radio. 21 - x- 08 En una proteína con unos núcleos de hidrógenos, orientamos con un campo magnético, orientamos los spines de los hidrógenos de igual forma, si le ponemos radiofrecuencia y le dejamos que se relaje obtenemos una radiación. Cada hidrógeno tiene un “ambiente químico ” diferente, emitiendo a diferente longitud de onda, si representamos la frecuencia frente a intensidad, cada uno de los protones da un pico a una frecuencia específica, podemos tener miles de picos, que solapan, es difícil verlo porque hay miles de hidrógenos. Se puede hacer un espectro bidimensionales es que además de la fr de la que emite la radiación los protones de la muestra, tb obtenemos un dato fundamental, la fr está perturbada en función de la cercanía de los átomos de hidrógenos de la muestra. De esa huella dactilar, podemos saber que átomos de hidrógeno corresponden a los picos, y que átomos de hidrógeno hay cercanos a ellos. Esos parámetros tienen unos nombres complicados (no hace falta). Podemos en teoría saber la distancia entre cualquier par de protones en identificar que protón es de la molécula. Tb ángulos de enlace, orientación de enlaces, qué átomos están formando puentes de hidrógeno, podemos deducir restricciones espaciales = calcular la estructura 3D , luego se refina, y luego se deposita en el PDB. Si por ejemplo no conocemos la molécula, si sabemos las distancias entre ellos, ninguna estructura (3 puntos hipotéticos) si están los 3 puntos a la misma distancia, sólo puede ser un triángulo equilátero. Si no fuese así sería un triángulo isósceles (1, 3 y 3 de distancia) definimos la estructura espacial de los átomos de hidrógenos unidos cov a otros átomos a la proteína mediante las distancias. Como hay miles de átomos de hidrógenos, sólo podremos tener rangos (error experimental) entonces ya no existe una sola posible estructura sino hay varias mientras cumple las restricciones, es imposible saber exactamente la estructura, hay varios modelos estructurales, todos ellos compatible son la verdadera estructura de la molécula. El intervalo es muy reducido de distancias, los modelos son muy parecidos, en realidad, sino queremos saber con mucho detalle nos vale el ensayo RMN, en el pdb es un modelo, que es un promedio de los modelos estructurales con los datos experimentales.
En cambio para los genes, genbank, con 20 millones de genes secuenciados, variantes etc. Nos da más información de la estructura primaria de la proteína más que de 3D, Habrá que buscar una forma rápida de relacionar la estructura la 1º en la 3º de las proteínas, haciendo más fácil RX o RMN o otra técnica de verlo más rápido. Se está haciendo intentos, de RX automatizada, o RMN automatizada, un poco como la secuenciación automática. Hay programas que no son fiables, que convierten la secuencia en plegamiento, pero aún no son fiables porque no sabemos como se pliegan; es el FOLDING PROBLEM, un gran problema en bioquímica, si supiéramos las reglas de plegamiento, sabríamos la estructura tridimensional. Aún queda saber la función, hay muchos datos que aún no se ha estudiado. Cuando la historia del iglo 20 se escriba, con seguridad el capitulo de la determinación de la estructura de proteínas, dependen de gran medida del conocimiento de los procesos bq. Tema 3: Estructura primaria de proteínas La “disecamos” primero empezamos con la estructura primaria covalente de la proteína, y luego la plegamos: Lo primero que tiene que hacer cuando se sintetiza, es plegarse, lo segundo, unirse a algún ligando. Lo siguiente ya no se puede generalizar. ¿Cuál es la base estructural por la cual las proteínas funcionan así? Cuál es el mecanismo molecular por la que la proteína funciona? No lo entenderemos bien, sin lo relacionamos con el funcionamiento de esa proteína, Ac nucleico. Extrema simplificidad química que tiene la proteína. La proteína la podemos simplificar en adelante como si fuera globulares, solubles en agua, (pero estructurales no son así, ya que existen proteínas fibrosas, alargadas pero su plegamiento se basan en lo mismo) las proteínas de membrana no son solubles en agua, pero sí en lípidos. La estructura no es igual, está adaptada para unirse en lípidos, pero aún así no es tan diferentes que las proteínas globulares solubles en agua. Polímero por ejemplo poliamida (plástico), todos los monómeros son iguales , no puede plegarse. La formación de interacciones entre átomos, no dirige la formación de plegamiento (si pensamos en los ph). Están inmersas en agua, no favorece realmente la formación de ph con el agua (si en el vacío) por lo que no habría tendencia en un principio en plegarse. Los pH están ocupados por las moléculas dejan de hacer ph con ellas mismas, si pensamos que al hacer puentes de hidrógeno entre ellas , el agua aumenta su entropía no es así ya que cada par de moléculas de agua k se libera, hace un ph con ellas mismas, se forman por lo tanto el mismo número de pH entre ellas (Agua y entre ellas miasmas). La variedad de monómeros sirve para favorecer el plegamiento, y permite la unión del máximo número de ligandos. La variedad permite la existencia de mayor número de clases de interacciones y por ello favorece el plegamiento, y formar una gran variedad de un centro de unión a un ligando, pudiendo hace runa molécula genérica, que cambiando el CA haga varias cosas. Los Polisacáridos no se pliegan de forma única: son polares por lo que no hay efecto hidrofóbico que sí dirige el plegamiento en proteínas, ya que al plegarse aumenta la entropía del agua ya que elimina agua de la capa de clatrato por lo que TD es favorable. Necesitamos que haya interacciones hidrofóbicas que inicien el plegamiento. En el caso de Nucleótidos: apolar-polar, las bases nitrogenadas son apolares, se supone que las primeras moléculas autorreplicantes eran RNA dirigen su propia replicación, son suficientemente variados, como para plegarse en una estructura única. Los ácidos nucleicos que tiene funciones pero que las proteínas pueden hacer bastantes más que ellos no pueden hacerlas, además las proteínas pueden ser mas eficaces. Hay mas variedad en aminoácidos, hay mas número de variaciones, los nucleótidos son muy parecidos entre sí, la diferencia química apenas hay ; sólo hay diferencias de algun radical. Pero si se basa en una estructura un scaffold común pues no se necesita tener diferentes relaciones químicas: hacer un enlace peptídico, igual en todos los aminoácidos, tener un grupo acido y un amino, y algo pegado,
variando “eso pegado” pera simplificar ya que para la síntesis basamos en la misma química ( enlace peptídico , poliaminas) como en los nucleótidos, pero poseen poca variación, solo tienen de diferente la cadena lateral de la base nitrogenada que además son muy parecidas, los aminoácidos son más versátiles mucho más variados, y mucho más distintos unos de las otros. En el experimento de Miller se formaban mayor numero de aminoácidos que nucleótidos, si fueran mas diversos, mas versátiles, y mayor número: seria basado en nucleótidos y no en aminoácidos. Una parte histórica fundamental. Por ejemplo el Mecano: para construir un mismo juguete a partir de las mismas piezas, (¡9 distintas) Compatibles entre ellas, para poder máximo número de modelos, la naturaleza “eligió” ciegamente los aminoácidos: en términos generales hay gran cantidad de variación. La mitad de los aa fundamentales son hidrofóbicos y la otra mitad hidrofílicos, eso es lo idóneo, porque los hidrofóbicos se esconden dentro, iniciando el plegamiento, y los hidrofilitos , interaccionando con el agua, haciendo que la proteína sea soluble. En el caso de que hubiera un solo par hidrofóbico-hidrofílico, aunque llegara a plegarse no tendría fundones biológicas. Si la estructura de los aminoácidos apolares fueran asimétricas que es lo más normal, no queda compactado bien. Pero si éstos son diferentes y asimétricos podríamos hacer una especie de puzzle, pudiendo quedar las piezas encajadas. diversificar los aminoácidos hidrofóbicos: el empaquetamiento se mejora, y las interacciones de Vander-walls aumenta, y se pliega correctamente, los apolares, su función más importantes es dirigir el plegamiento de la proteína generando un núcleo hidrofóbicos. Y esto es lo que encontramos en la naturaleza. El efecto hidrofóbico: funciona como un puzzle 3D, que encajan las piezas unas con otras, maximizan por lo tanto el efecto hidrofóbico y las fuerzas de vander-waals. Los aa polares: pH con el agua, y entre ellos: para que se puedan disolver en agua, si las proteínas no se disuelven en agua, difícilmente van a trabajar, difícilmente van a funcionar en la química de soluciones acuosas. Los monómeros Variados les permiten además funcionar de forma versátil. Para que existan diferentes tipos de interacciones, además de diferentes formas para encajar estructuralmente con el ligando y así maximizar las fuerzas de vander-walls, iónicas de corto alcance. Para ligandos con grupos hidrofóbicos: estabilizarlo en el CA, gracias a grupos hidrofóbicos, pueden llegar a la superficie. Los polares también es importante interacciones polares para plegarse, por ejemplo en el CA puede tomar su forma porque la superpie de la proteína tiene una determinada forma, hace falta no solo hidrofóbicas sino polares, para que haya esa zapping, formateado de la forma, hay que tener interacciones intrerproteína. Ambos tipos de aminoácidos se basan en el mismo tipo de interacciones para plegar la proteína como para unir ligandos. Aminoácidos: Todos son CL aminoácidos, y además L quirales. Todos son parcialmente polares, la polaridad cuando hablamos de ella, nos referimos a las cadenas laterales. Hay que aprenderse as cadenas laterales de los Aminoácidos como sus propiedades físico-químicas. A) apolares de cadena lateral alifática Glicina: en realidad no tiene cadena lateral, es un hidrógeno. Pero realmente tiene 2 hidrógenos. No es polar porque el c alfa, no es electronegativo. Se podría clasificar como cadena lateral “no polar”. Alanina pequeño globular – ch valina, pequeño ch3 - ch3 + largo leucina mas largo ch2-ch3.ch3 e isoleucina ramificaciones apolares.
Methionine Met M nonpolar neutral Phenylalanine Phe F nonpolar neutral Proline Pro P nonpolar neutral Serine Ser S polar neutral Threonine Thr T polar neutral Tryptophan Trp W nonpolar neutral Tyrosine Tyr Y polar neutral Valine Val V nonpolar neutral
Amino Acid Short Abbrev. Avg. Mass (Da) pI pK 1 ( α - COOH) pK 2 ( α - +NH 3 ) Alanine A Ala 89.09404 6.01 2.35 9. Cysteine C Cys 121.15404 5.05 1.92 10. Aspartic acid D Asp 133.10384 2.85 1.99 9. Glutamic acid E Glu 147.13074 3.15 2.10 9. Phenylalanine F Phe 165.19184 5.49 2.20 9. Glycine G Gly 75.06714 6.06 2.35 9. Histidine H His 155.15634 7.60 1.80 9. Isoleucine I Ile 131.17464 6.05 2.32 9. Lysine K Lys 146.18934 9.60 2.16 9. Leucine L Leu 131.17464 6.01 2.33 9. Methionine M Met 149.20784 5.74 2.13 9. Asparagine N Asn 132.11904 5.41 2.14 8. Pyrrolysine O Pyl Proline P Pro 115.13194 6.30 1.95 10. Glutamine Q Gln 146.14594 5.65 2.17 9. Arginine R Arg 174.
Serine S Ser 105.09344 5.68 2.19 9. Threonine T Thr 119.12034 5.60 2.09 9. Selenocysteine U Sec 168. Valine V Val 117.14784 6.00 2.39 9. Tryptophan W Trp 204.22844 5.89 2.46 9. Tyrosine Y Tyr 181.19124 5.64 2.20 9.
Side chain properties Amino Acid Short Abbrev. Side chain Hydro- phobic pKa Polar pH Alanine A Ala - CH 3 X - - - Cysteine C Cys - CH 2 SH - 8.18 - acidic Aspartic acid D Asp - CH 2 COOH - 3.90 X acidic Glutamic acid E Glu - CH 2 CH 2 COOH - 4.07 X acidic Phenylalanine F Phe - CH 2 C 6 H 5 X - - - Glycine G Gly - H X - - - Histidine H His - CH 2 - C 3 H 3 N 2 - 6.04 X weak basic Isoleucine I Ile - CH(CH 3 )CH 2 CH 3 X - - - Lysine K Lys - (CH 2 ) 4 NH 2 - 10.54 X basic Leucine L Leu - CH 2 CH(CH 3 ) 23 X - - - Methionine M Met - CH 2 CH 2 SCH 3 X - - - Asparagine N Asn - CH 2 CONH 2 - - X - Pyrrolysine O Pyl Proline P Pro - CH 2 CH 2 CH 2 - X - - - Glutamine Q Gln - CH 2 CH 2 CONH 2 - - X - Arginine R Arg - (CH 2 ) 3 NH-C(NH)NH 2 - 12.48 X strongly basic Serine S Ser - CH 2 OH - - X - Threonine T Thr - CH(OH)CH 3 - - X weak acidic Selenocysteine U Sec - CH 2 SeH X 5.73 - - Valine V Val - CH(CH 3 ) 2 X - - - Tryptophan W Trp - CH 2 C 8 H 6 N X - - - Tyrosine Y Tyr - CH 2 - C 6 H 4 OH - 10.46 X -
Aprender de memoria: el carácter químico de la cadena lateral. El Código 3 letras por ejemplo SER, y el de una letra. Estereoquímica, los aminoácidos naturales son L, se lee “corn” “maíz” (regla nemotémica coo con R y luego N. ¿Se puede hace runa proteína con aminoácidos D? Los ribosomas no pueden reconocer Aminoácidos D, el enlace peptídico es un enlace amida, se puede sintetizar artificialmente. Síntesis de fase sólida, de Merrifield, que tengan aminoácidos D o no naturales. La conformación de R más estable: rotámeros: los rotámeros más estables suele ser aquellos en que los átomos de R estén lo más separados unos de otros posible. Péptidos retroinverso: tenemos un epítopo peptídico, ese mismo epítodo, de un virus YTASARGDLAHLTTT, no se pliega porque es demasiado pequeño, pero funciona, porque es capaz de ser reconocido por un anticuerpo si se pliega una vez unido, por la energía de unión. Las proteasas reconocen los enlaces péptidos, los degradan porque están expuestos, se degradan muy fácilmente, son blancos directos. Si hacemos la secuencia al revés, (Amino iz, carboxilo derecha) TTLHLALDGRASATY pero aminoácidos D, mantiene la forma del epítopo, porque como es la imagen especular pero al contrario, esto induce anticuerpos que reconoce el virus de la fiebre aftosa, las proteasas no pueden actuar. OJO! (síntesis en fase sólida de Merrifield) Porque son aminoácidos L? Nadie lo sabe, parece que se fijó al principio de la existencia de la vida, y como las mutaciones es imposible que se den para utilizar los aminoácidos D, porque el organismo no podría funcionar. Propiedades ácido-base de los aa Tanto el grupo alfa amino y alfa carboxilo tienen pKs entre 7-8 del amino y 3-4 del coo, en ph fisiológico, los aminos NH3+ Y los COO-. Lo mismo que en ASP y GLU, los guanidino, amino e histidina 12 - 10 - 7 cargados +, la histidina al estar al ph fisiológico depende más o menos del entorno local, importante en reacciones catalíticas. Cys, Tyr, no son protonables a ph fisiológico. Dependiendo del entorno químico, el pk varía, no sería exactamente si se encuentra libre o aminoterminal de la proteína, dependiendo del entorno químico, del extremo aminoterminal. El aminoácido no está libre está unido. Varía entonces que el grupo sea más o menos fácilmente protonable. No están formando una interacción iónica con otro grupo. La presencia de un puente salino el COO- Y NH3 De dos aminoácidos, cambia el PKa de cada especie química. Nota pka es el – long de Kacidez. Arg pH= 7 , cargada positivamente, la forma ácida de la arginina ArgininaH+ --> agrinina + h+ (arginina )básica Ka = arginina · h/arginina h+ Por ejemplo la proteína que une retinol: trasporte de retinol, distribución de aa en la estructura : el ligando retinol es muy hidrofóbico por lo que se esconde en el interior de la proteína, esta proteína ha evolucionado para hacer una cavidad hidrofóbica estrecha, pero entonces el retinol no podría entrar si la cavidad es rígida. Como es posible que haya entrado el retinol? Cambio conformacional? No porque lo hemos visto. las proteínas no son estáticas son flexibles, esta proteína localmente cambia su conformación cuando el retinol se une a él. Si el ligando es polar puede estar hundido en la superficie, con aminoácidos polares. El oxígeno del retinol tiene interacción con los aminoácidos de la proteína del O del retinol, que pueda dar o aceptar un ph. No pueden evolucionar en complejidad en el sentido de añadir más monómeros porque habría que cambar le código genético, la proporción de secuencias que realmente funcionara es muy baja.
Ya que no podemos aumentar el número de piezas, una vez ya construida, modificando las piezas a posteriori : modificaciones postrasduccionales. Hay varios tipos:
