¡Descarga microbiología y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
MICROBIOLOGÍA (Eulogio)
1.GENÉTICA BACTERIANA
Las bacterias estan formadas por un cromosoma bacteriano y por
plásmidos.
GENÉTICA: ciencia que estudia la herencia de los caracteres biologicos
por parte de los seres vivos.
GEN: es una secuencia de DNA que codifica para una proteína.
- Gen estructural: es la zona codificante (ORF)
- Región reguladora o promotora: si es + se expresa y si es – no se
expresa.
Es dónde se produce la diferenciación celuar, que se lleva a cabo según
su entorno y la expresión de unos genes específicos para esa célula.
GENOTIPO O GENOMA: conjunto de genes o elementos genéticos de un
organismo. el genóma de las células está constituido por ADN
exclusivamente, pero algunos virus poseen ARN.
FENOTIPO: manifestación externa, visible del genotipo. Es lo que
podemos observar de un organismo.
Los fenómenos adaptativos no son una manifestación visible, son
cambios adaptativos no se consideran cambios fenotípicos ni
mutaciones.
CEPA O CLON: población de individuos que proceden de un mismo
progenitor inicial, todos ellos poseen el mismo genotipo.
ADN: se encuentra codificada toda la información de un ser vivo.
LA SECUENCIA DE BASES: se organiza en tripletes o codones y cada
triplete codifica para un aminoácido.
CODÓN: mínima unidad de codificación. Podria ser un gen un conjunto de
codones.
- Iniciacion: AUG
- Terminación: UGA, UAG, UAA.
PROMOTOR: Es el sitio donde se reconoce el RNA polimerasa, se une y
da el inicio de la transcripción.
TRANSCRIPCIÓN: La RNA polimerasa se une a la región promotora del
gen.
DNA ---> RNA
TRADUCCIÓN:
RNA ---> PROTEINA
TRANCRIPCIÓN INVERSA
ARN ---> ADN
CODIGO GENÉTICO:
- És universal, cada codón codifica al mismo aminoácido para todos
los individuos, aun que hay excepciones.
- Está degenerado: 4 nucleótidos conforman el DNA y 3 forman un
codón, por lo tanto 4^3 son 64 codones para 20 aminoácidos que
hay. Por esto un aminoácido puede estar codificado por más de un
codón distinto.
Por otro lado, hay asignados tripletes de iniciación y de terminación.
Los de iniciación corresponden AUG o ATG (codifica a la metionina), todas
los proteínas comenzarán por uno de estos tripletes.
Los tripletes de terminación determinan dónde se termina el mensage
genético, estos serán UGA, UAG, UAA --> STOP, hay mas de un codón
STOP para asegurar el fin de la síntesi.
CARACTERÍSTICAS DEL GENOMA BACTERIANO
- Solo un cromosoma, porque solo tienen una copia de cada gen.
- Los genes están muy juntos, hay poco espacio no codificante, en
cambio en los eucariotas hay mucho espacio no codificante.
- Se organizan en operones: conjunto de genes que codifican a
proteinas que están relacionadas fisiológicamente entre si. No
existe espacio intergénico y son transcritos en un único ARNm
policistrónico. Los operones garantizan que la célula no tenga gasto
inútil.
Se puede ahorrar espacio en el Ux174, una proteina puede codificar dos
genes debido a que una secuencia si empiezas por otra letra incluida en
la secuencia se genera otra nueva.
DIFERENCIA ENTRE CROMOSOMAS
- Aspecto de las colonias: correspondido por la morfología del organismo
- Resistentes a bacteriófagos : los bacteriófagos son hospedadores, puede mutar y no reconocerlo o alguna enzima bacteriana para reconocerlo puede mutar. - Morfológicos
- Letales condicionales : en funcion de las condiciones se expresará o no la mutación.
- Condiciones restrictivas: se expresa la mutación
- Condiciones permisivas: no se expresa la mutación
MUTACIONES PLEIOTRÓPICAS Mutaciones que se ven afectadas por mas de un cambio en el fenotipo.
- Alelo silvestre: alelo que vamos a mutar
- Alelo mutante: alelo resultante de la mutación
Tipos de mutantes letales
- Condicionales al calor : la mutación no se realiza si hay bajas temperaturas (permisiva), pero si hay altas temperaturas si que producirá mutación (restrictiva)
- Mutantes sin sentido: se ha formado un codón de terminación dentro de la pauta de lectura abierta. Será mas corta que la original.
CLASES DE MUTACIONES:
- Puntual: cambio de una base por otra
- Un tipo de puntual: cambio de un aminoácido por otro. Si el aminóacido era importante para algo se veria un cambio en el genotipo, es decir, dependiendo de si lleva a cabo una funcionalidad importante en la proteína.
- Codón sin sentido: mediante una mutación puntual. Se verá una cambio fenotípico dependiendo de si el cambio se realiza al final o al principio, porque si se produce el cambio al final no se veria ningun cambio fenotípico.
- Silenciosa: cambio en el fenotipo pero no del genotipo, porque no cambia el aminoácido codificado.
- Inserción: Las inserciones son mutaciones en las cuales se insertan pares de bases adicionales en un lugar nuevo del ADN.
- Delección: perdida de un fragmento de ADN del cromosoma En las dos se produce un cambio en el marco de lectura.
AGENTES MUTÁGENOS
- Análogos de bases : una sustancia diferente de una de las bases estandard de los acidos nucleicos pero que se puede integrar en el material genético, (se incorpora en la cadena)
- El 5 bromo uracilo provoca transiciones A-T G-C, y la transición
aparece en la tercera generación, no es instantanea.
- Mutágenos químicos : capaces de modificar las bases que están ya presentes en el DNA.
- Ácido nitroso: desamina la adenina, también se provoca la transición A-T G-C en la tercera generación
- EMS (etilmetilosulfato): alquila (introduce grupos alquilo) a la guanina y timina. La transición es AT GC o viceversa.
- Sustancias intercalantes : analogos de acrilinas sustituidas. Se pueden ver los cambios fenotípicos si no ocurren al final. - Mutagénesis por radiaciones:
- Ultravioleta: forma dimeros de timina adyacentes.
- Se repara por una endonucleasa o hexonucleasa, que corta los laterales. Actúa una polimerasa reparando.
- O también durante la replicacion de la polimerasa salta lo que no se conoce y se crea un hueco, y con una endonucleasa se repara sintetzando la nueva cadena.
- Sistema SOS: usa una polimerasa permisiva, pone dos bases al azar, aparece una mutación y si afecta a genes esenciales la célula muere.
- Transposones: son elementos genéticos que parece que van saltando a lo largo del genoma de un organismo, mediante inserciones. - Simple - Complejo: codifica para una toxina o resistencia a antibiótico.
REVERSIÓN INTRAGÉNICA Reversión dentro de un mismo gen mutado Probabilidades: Misma base, mismo lugar, otro lugar (mas probable) La mutación en otro gen distinto revierte la mutación original.
- PIR1 ----//---- F 0E 0pir 1: sensible a la temperatura. Falta de un gen que revierte el original.
- PIR 32---//--- F 0E 0 pir 32: no pasa nada, crece bien a 37ª.
Aplicacion para detectar agentes carcinógenos. Se usa para ver en las sustancias que se tengan que vender que no tengan mutágenos.
Test de AMES:
- Cepa parental: Salmonella typhimunum: auxotrofa para histimina. (la necesita para crecer), la histamina seria el factor de crecimiento. Esta cepa parental tiene dañado el sistema de reparación de DNA, tiene que ser puntual la mutuación. Hay una posibilidad baja de regresión espontánea.
Si en las placas al añadir un químico aparecen otras colonias, ha mutado por lo que pueden ser carcinógenos, no se podian vender.
Sin compuesto químico (control), con compuesto químico (placa problema). Alrededor del disco aparecen colonias, el compuesto seria mutagéno, posiblemente carcinogeno.
Producción de mutante de glucógeno El glucógeno es glucosa, se añade lugol para detectarlo porque mata la glucosa, haríamos una réplica antes y compararíamos.
Mutante letal condicionante del calor Hacer réplica y incubar una en 25ª y otra en 37ª y compararlas.
RECOMBINACIÓN GENÉTICA EN BACTERIAS
- Transformación : proceso por el cual ADN libre pasa de una bacteria donadora a una bacteria receptora. La célula donadora tiene que lisarse (romperse para que esté libre el DNA)
- Transducción: transferencia desde una bacteria donadora a una receptora utilizando de vehículo un virus. El DNA está transportado por el fago.
- Conjugación : transferencia de información genética (cromosoma o plásmido) des de una célula donadora a una receptora habiendo contacto dirécto entre dos bacterias. - Se puede transferir solamente un plásmido (plásmido conjugativo), las que no tienen este tipo de plásmido no pueden hacerlo por este proceso. - Puede transferirse parte del cromosoma, es necesario que el plásmido conjugativo se encuentre integrado en el cromosoma
- El DNA donado , se transfiere: ADN donador o Exogenote
- El DNA de la bacteria receptora: DNA receptor o Endogenote Para que sea estable se tiene que integrar en el cromosoma de la bacteria, tienen que existir zonas de hemologia para esta integración, si no no seria facil esta integración.
- Hay en la célula unos sistemas de modificacion/restricción: tienden a degradar el DNA extraño que entra. Está constituido por unas enzimas de restricción que reconocen secuencias específicas del DNA. Modifican las secuencias rompiendo o pegando, puede utilizarse el método de metilación.
- Cuanto más cercania génetica más fácil será la recombinación genética, más hemoligia.
- Marcadores: es un segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o puede ser alguna sección del ADN sin función conocida. Son aquellas señales, sean del tipo que sean, que sirven para indicarnos la presencia cercana de un gen de interés en un cromosoma dado.
ETAPAS DEL PROCESO DE TRANSFORMACIÓN 1 El estado de competencia es debido a que una proteína hace la pared mas laxa para que el DNA foraneo interaccione. 2 Las proteínas de DNA estabilizan 3 Se encuentra el DNA y se sustituye por el nuevo fragmento (4)
- Transfección : el DNA virico libre en una bacteria, sintetiza virus y mata la bacteria - Transducción: Es la transferencia de genes bacterianos por medio de virus Generalizada: Cualquier fragmento del DNA del huésped puede quedar incluido en el interior de una cápside viral y ser transcrito al receptor. Ocurre en el ciclo lítico de fagos virulentos, se encapsidan al interior de capsides proteicas fragmentos de cromosoma bacteriano.
Especializada: se transfieren porciones específicas del genóma bacteriano. Es posible durante un error del ciclo lisogénico porque puede tener el genoma del fago porciones de cromosoma bacteriano.
- Por ellas mismas no pueden llevar a cabo el ciclo lítico porque se dejan un trozo del genoma en la bacteria y los fagos que salen son defectuosos.
Comparación entre la especializada normal y rara: En las dos hay una celula lisogenizada, un DNA fagico y los genes gal en la célula hospedadora, en la normal, el DNA fágico se circula y se libera de la célula hospedadora mientras que en la rara una porcion de DNA hospedador se cambia por DNA fágico. En las dos el DNA liberado se replica. Normalmente luego la sintesi de partículas fágicas se completa y finalmente se lisa la celula y seliberan fagos normales o se lisa y se liberan fagos capaces de transducir los genes GAL
Abortiva: el exogenote no se ingiere en el genoma de la bacteria receptora, es decir, contienen DNA transducido pero no integrado en el genoma, son diploides parciales. *Fago Helper: es un fago colaborador que ayuda a realizar el ciclo lítico.
- His: auxotrofo para histidina
- Conversión fágica : Cuando un fago se integra en el genoma de una bacteria, queda inmune a otro de un mismo o similar fago, no entra.
PLASMIDOS Moléculas de DNA extracromosomico que se replican de manera independiente
Conjugación Hfr El factor F es un episoma (plásmidos que pueden integrarse de forma reversible en la celula huésped) y puede integrarse en el cromosoma bacteriano en diferentes localizaciones mediante recombinación. Cuando se ha integrado , el operón tra del plásmido F sigue siendo funcional. El plásmido puede dirigir la síntesi del pili y llevar a cabo la replicación mediante el mecanismo de circulo rodante y transferir el material genético a una célula receptora F. Debido a que inicialmente solo se tranfiere parte del factor F el receptor F- no se convierte en F+
- Sexducción: consiste en el transporte de material genético desde una célula a otra por medio de plásmidos F.
PLASMIDOS R Son moléculas de DNA que confieren resistencia a antibióticos, son autotransmisibles, hay plásmidos R para todos los antibióticos conocidos. También hay plásmidos resistentes a sulfamidas y a otros compuestos. Son capaces de codificar enzimas que alteran el antibiótico y su resistencia se debe a cambios estructurales sobre la diana del antibiótico. Estructura
- Factor RTF: factor determinante de las transferencias , lleva los genes que se transfieren.
- Determinante R: lleva los genes que se codifican a enzimas que degradan el antibiotico. Responsable de la resistencia a los antibióticos. Un plásmido R tiene un factor RTF y puede llevar varios determinantes R en target. Si se encuentran separados se transfiere por conjugación en factor RTF y el determinante R no, ya que solo se transferira con la presencia del factor RTF. En cambio si que se tranferiria el determinante R si se transforma, es decir, si se libera DNA. Los agregados para resistir a los antibióticos se hacen a través de las secuéncias de insercción.
3.INGÉNIERIA GENÉTICA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Moléculas empleadas por la bacteria para degradar qualquier DNA extraño que entre en ellas.
- Nomenclatura: E co R I E= especie (esterichia), co= especie (coli), R= cepa, I= numero romano, el orden en que ha sido aislada. Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de DNA y pueden cortar a esa enzima simetrica o asimetricamente.
Las enzimas de restricción del tipo dos, reconocen secuencia polindrómicas (se leen igual por los dos lados) Pueden presentar dos tipos de extremos, los extremos protuberantes que no se pueden unir y los ramos que si que podran unirse.
VECTORES DE CLONACIÓN Capaces de reciclarse por ellos mismos. Son los plásmidos, fagos y cosmodos YAC y cromosomas artificiales. Un vector es una molécula de DNA con un origen de replicación autónomo y que posee zonas donde pueden introducirse fragmentos de DNA exógeno. Así, el DNA exógeno se replica como parte del vector en la célula receptora y hospedadora.
Para que un vector de clonación sea útil debe cumplir las siguentes propiedades:
- Debe haber un método para poder introducir el vector en la célula. Ej: transformación
- Debe tener origen de replicación, se replican de manera autónoma
- Las células que hayan adquirido el vector se deben de seleccionar por un método directo. Un método selectivo para diferenciar las que han tomado vector y las que no. Para que sean funcionales:
- Debe disponer de un origen de replicación
- Deben poseer diana de restricción única (multiple sitio de clonación)
- Marcadores: son esenciales para saber por donde van. Los vectores o plásmidos estan tanto en eucariota como en procariotas.
- Lac Z: codifica para la B-galactosilasa
- ORI R: es el marcador de la anticilina, se encuentra en bacterias
- 2 ¹ ORI: levaduras, marcador: auxótrofo: URA 3 (auxótrofos para el uracilo)
Clonación 3:
- Blancas: no metabolizan X-Gal
- Azul: lo metabolizan
Problema de la selección: Queremos un fragmento de a secuencia. Al digerirse una molecula grande el gen que queremos se mezcla con los demás, los plasmidos recombinantes resultantes todos producirian colonias.
*Si una especie tiene 125 aminoácidos organizados en tripletes
- Podrán tener una transcripción parecida pero uma traducción no porque este no está degenerado, cada triplete es para un aminoácido. 3^5=125 no tendria
el mismo triplete de terminación.
Estrategias para la selección
- Directa: en el medio de cultivo que diseño crecerá el que lleve el plásmido recombinante correcto. Solo sobrevivirá el correcto.
- Indirecta: Utiliza sondas de DNA o anticuerpos Un ejemplo de directa: Aislamos el material genético de la bacteria y cortamos con la enzima que queramos. Después se ligan, pero solo uno podra crecer en ese medio, solo el recombinante vive. El mismo actúa como marcador. Segundo ejemplo de directa: Se cortan fragmentos y uno tendrá el gen que queremos. Obtendremos una genoteca.
IDENTIFICACIÓN DEL CLON CORRECTO MEDIANTE HIBRIDACIÓN (INDIRECTA) Hay que utilizar plásmidos marcadores para ver quien es recombinante
- Sondas radioactivas: hay que lisar las células para liberar el DNA, hay que separar la doble hebra del DNA, para que la membrana se quede unida al azúcar fosfato. Si se incuba se apareará, se pondrán rayos X y donde haya radiación se vera una mancha negra que se puede comparar.
- Otra manera (anticuerpos): si tenemos anticuerpos producimos un sistema en el que la bacteria produzca proteínas eucariotas. Se lisan las células y las proteínas sintetizadas por las células, se pegan a las proteínas sintetizadas y añadimos otro anticuerpo. Aparecerá la mancha negra y podremos comparar.
Aplicaciones de la ingenieria genética : Obtención de proteínas de uso farmacológico, de bacterias que crezcan rápido, enfermedades metabólicas, obtención de microorgaismos que fijen materiales pesados, clonación de eucariotas, células madre..
PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Un hombre compró nucleotidos, separó la polimerasa la calentó y por ello se separaron las hebras. Luego bajo la temperatura y se unieron, cuando volvia a calentar se volvian a separar... Pero solo polia durar un ciclo. Se utilizaron termófilos y se aislaron esas polimerasas para que no se desnaturalizaran las porteinas. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Necesitará también en gen X-Gal. Si no puede metabolizar X-Gal no dará color. También diferencia si son recombinantes o no.
