¡Descarga Microbiologia C y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
BLOC C:
1. Genètica bacteriana. Mutagènesi. Importància en la patogenicitat.
Els gens: avenços històrics
- descobriment dels gens per Mendel (pèsols) 1866
- descobriment dels àcids nucleics. 1871
- estructura del DNA. 1953
- elucidació del codi genètic. 1960
- seqüenciació ràpida del DNA. 1977
- seqüenciació automatitzada. 1986
- primer genoma complert seqüenciat: 1995 (Haemophilus influenze)
- primer cromosoma seqüenciat 1999
- genoma humà seqüenciat (2000), aquest projecte va durar uns 13 anys i va costa prop de 2000 milions d’euros. Però, actualment, hi ha un aparell que per uns 760€ i en un dia, és capaç de seqüenciar un genoma humà completament.
Els bacteris són molt importants en aquest procés, ja que són necessaris els bacteris, o eren necessaris per tal de multiplicar els fragments de DNA i poder descodificar-lo a talls. Actualment existeixen bases de dades mundials que exposen el DNA de múltiples especies. Amb aquesta tecnologia actualment hem arribat a uns 2000 genomes.
Estudis genètics: Utilitzar el model bacteris causa:
Avantatges:
- baix temps de generació
- d’una cèl·lula s’obté una població idèntica (concepte de Clon/soca)
- material genètic senzill
Inconvenients
- Tenen una mida petita, i s’han d’estudiar les poblacions no els individus, no es poden veure a simple vista com els pèsols de Mendel.
- Reproducció sexual no convencional.
Conceptes genètics
El DNA està format per una doble hèlix de dues cadenes formades per sequencies complementaries de quatre nucleòtids diferents (A, C, T, G). Una cadena de DNA pot fer servir de motlle per formar la cadena complementaria. La seqüència de nucleòtids del DNA codifica la seqüència d’aminoàcids en les proteïnes. Triplets de 4 nucleòtids (4^3 =64) possibilitats per codificar 20 aminoàcids distints, més els senyals d’ inici i de stop → és molt Redundant
- concepte antic: un gen codifica una proteïna (1 gen = 1 proteïna). En bacteris podria funcionar bastant bé.
- concepte ampli: un gen codifica un pèptid.
Hi ha gens que codifiquen per RNAr, RNAt que no formen proteïnes i altres que no fan ni transcripció, ni traducció com les regions reguladores i els promotors. Els eucariotes tenen exons (contenen informació genètica) i introns (no contenen informació genètica). A procariotes aquest fenomen no existeix. A procariotes és molt habitual que un grup de gens que codifiquen proteïnes relacionades (ex: una ruta metabòlica) són transcrites, traduïdes i regulades en bloc.
Gen bacterià:
Estructura bàsica d’un gen bacterià:
Hi ha diferents regions que tenen diferents funcions, poden variar entre especies, però generalment és força comuna. Esta format per una cadena codificadora i una cadena motlle, que és contraria a la cadena modificadora i per això s’utilitza per el RNAmissatger.
- Hi ha una sèrie de zones, en la qual la DNA polimerasa comença la transcripció, ja que reconeix la seqüència com a gen. Aquesta funció la fa el promotor (caixa Pribnow, situada a la posició -35 i un altre a -10): hi ha un lloc d’unió per la RNA polimerasa, no es transcriu i és una seqüència molt conservada a tots els bacteris (poc evolucionada).
- L’anomenada seqüència líder (Shine-Dalgano) també és molt conservada i és el lloc en concret on es fixarà el ribosoma per saber quan s’ha de iniciar el procés de traducció. El primer triplet que es traduirà en seqüències bacterianes és l’AUG. En un inici codificarà per formilmetionina que bloqueja la síntesi d’aminoàcids en un sentit. Al·lel → són les formes mutacionals dels gens. No cal que siguin molt diferents, pot ser que el canvi es produeixi en una sola base. L’al·lel mutat, doncs, provindrà d’un estat salvatge (l’original). Genòfor bacterià → és l’equivalent a cromosoma bactèria. Conté la major part de la informació genètica, però no tota, hi ha altres estructures que contenen informació genètica addicional, principalment els plasmidis. Genoma bacterià → en procariotes és la suma del genòfor i dels plasmidis. A eucariotes el genoma és la suma dels cromosomes, el DNA mitocondrial i el DNA dels cloroplasts. Un espècie de bactèries és una espècie que té un conjunt de soques diferents. El pan – genoma bacterià és doncs, tot el repertori genètic de l’espècie. Dins el pan – genòmic, trobem el genoma central (gens presents a totes les soques) i els gens únics (presents en una única soca). Genotip → conjunt de gens d’un determinat organisme. Fenotip → conjunt de característiques observables d’un organisme. Es poden donar canvis degut a l’ambient: Morfològics: a nivell genètic no canvia res però canvia per exemple quan és vell. Enzimàtics: a E-coli per exemple si li posem lactosa al medi fabrica l’enzim β- galactosidasa, mentre que en absència de lactosa no el fabrica. Per tant podem tenir organismes iguals però amb diferents enzims.
Mutacions:
Són variacions genotípiques. Qualsevol canvi permanent de la seqüència de DNA es considera una mutació, pot ser deguda a canvis de moltes bases (macrolesions) o a canvis d’una única base (microlesions).
Hi ha diferents tipus de macro-lesions:
a. Delecions: pèrdua de material genètic. b. Duplicacions: multiplicació d’un determinat fragment de DNA. c. Inversions: s’inverteix una seqüència (ABCDE → ABEDC) d. Insercions: s’incorporen bases al DNA, dos fragments de DNA que intercanvien informació entre sí. És semblant a la Recombinació meiòtica.
Mutàgens físics:
- Radiacions ionitzants
- Radiacions ultraviolades: El dany produït per la radiació UV pot ser reparat per dos mecanismes:
a) la fotoreactivació amb llum visibles. La presència de fotons activa un enzim, la fotoliasa, que es capaç de trencar el dímers de pirimidines. b) Reparació fosca: no necessita llum visible. És un procés complex en el que s’utilitzen diferents mètodes.
- Per escissió: endonucleasa uvrABC trenca els dímers de timina i copia el fragment de DNA nou mitjançant la DNA polimerasa I, i la DNA ligasa uneix els trossos de DNA. És un mecanisme lliure d’errors.
- Per recombinació: proteïna recA, hi ha un reconeixement de la regió homòloga i es replica.
- Reparació SOS (sense motlle): en el cas que les mutacions siguin tant grans que no es puguin reparar amb aquests mecanismes anteriorment explicats, els quals són molt ben definits. Hi ha diversos enzims que hi participen, el recA que activa els enzims reparadors i inhibeix al lexA. El lexA inhibeix enzims reparadors (uvr gens). És un mecanisme que produeix molts errors. 2. Intercanvi genètic bacterià.
Mecanismes d’adquisició de DNA:
- Transformació: el DNA prové de l’exterior, es capta DNA lliure. És fàcil trobar-se aquesta situació a la natura.
- Transducció: el DNA prové de virus
- Conjugació: el DNA prové d’un altre bacteri.
2.1. Transformació:
2.1.1. Transformació natural: ( Streptococcus pneumoide):
Aquest fenomen es va estudiar a partir d’aquest bacteri, el qual pot presentar diferents soques, unes violentes i amb capsula (llises o S) i altres que no tenen massa patogenicitat i tampoc tenen capsula (Rugoses o R).
Experiment de Griffiths, 1928.
Van desactivar la soca S amb calor i li van afegir la soca R viva. Al ajuntar les cèl·lules rugoses amb el degradat de cèl·lules S es produeix la transformació natural: la soca R ha adquirit fragments de DNA que codifiquen la capacitat de produir càpsula. Al injectar la soca R a l’animal, aquest mor. Al extreure el microorganisme de l’animal mort, es veuen dues soques: llises (S, amb càpsula) i rugoses (R sense càpsula).
Etapes de la transformació natural:
Etapa de competència:
a. producció de factor de competència: proteïna soluble b. adsorció en superfície cel·lular c. expressió de determinats gens: auto lisina, proteïna d’unió al DNA, nucleasa = cèl·lula competent.
Etapa de transformació
d. proteïna d’unió al DNA heteròleg e. nucleasa (degrada una cadena) f. proteïnes de competència g. DNA mc: integració
2.1.2. Transformació artificial:
Es fa de manera artificial, en un laboratori. El CaCl 2 augmenta la permeabilitat de la cèl·lula pel DNA i així en pot entrar més. S’utilitzen plasmidis perquè tenen DNA circular i així el DNA és més estable i podrà entrar amb més possibilitats d’èxit.
2.2. Transducció: El DNA prové d’un bacteriòfag. El bacteriòfag infecta a la cèl·lula donadora, de la qual agafa un fragment de DNA i aquest fragment és introduït pel bacteriòfag a la cèl·lula receptora.
2.2.1. Transducció generalitzada: El bacteriòfag injecta material genètic amb la finalitat de multiplicar-se dins la cèl·lula infectada. Aquest DNA introduït, el DNA víric, serà suficient per multiplicar el fragment de DNA i les proteïnes que l’envolten, la càpsida. El bacteriòfag anul·la la capacitat de funcionament del genòfor. El DNA de la bactèria es fragmenta per nucleases. La bactèria conté moltes còpies del DNA víric i fragments del seu propi DNA (que provenen del genòfor trencat). El DNA víric tornarà a ser reincorporat a la càpsida i quan infecti a una altra bactèria, també injectarà material genètic bacterià perquè hi ha fragments de DNA bacterià degradat que s’han incorporat dins la càpsida. Es diu transducció generalitzada perquè qualsevol gen de la bactèria donadora pot introduir-se d'aquesta manera a altres bacteris, només cal que el seu fragment hi càpiga a la càpsida.
2.3. Conjugació: L’intercanvi de gens entre dos bacteris es dona a través de el pili sexual, que tenen alguna espècie de bacteris. Existeix en aquest procés una cèl·lula donadora i una altre receptora, segons l’espècie de la qual es tracti donaran molt material genètic (Hfr) o molt poc (F+) i hi ha algunes, que no en donen, que en reben (F-). Les F+ donen poc material genètic perquè donen un plasmidi que dona fertilitat, ja que el factor f està en forma de plasmidi dins aquests bacteris. En canvi, en el cas del Hfr, tenen el fragment F integrat dins l’ADN i donaran part dels cromosomes del seu DNA a l’hora de injectar-lo.
- Plasmidis:
Característiques:
- Els plasmidis són cadenes curtes de DNA de pes molecular baix.
- Són elements genètics prescindibles
- Tenen replicons : són autosuficients per replicar-se.
- Tenen un DNA de doble cadena (bicatenari) i circular, com el DNA bacterià.
- Tenen pocs gens.
- Dins d’una cèl·lula hi poden haver una o moltes còpies i estan regulats per la mateixa cèl·lula.
- Episoma: es poden trobar integrats a la cèl·lules (com el factor F) o lliure.
N’hi ha de molts tipus, de conjugació (factor F), de resistència, bacteriocines, metabòlics nocius de nodulació o de degradació i productors (de pigments, antibiòtics...).
Plasmidis R o de resistència:
Aquest tipus de plasmidis no es va descobrir fins el 1955 ja abans no eren capaços de explicar que aquesta resistència venia deguda a una mutació. Els plasmidis de resistència són fragments que capaciten a la cèl·lula per destruir antibiòtics o partícules tòxiques de metalls. Actuen formant enzims que combaten i ataquen els antibiòtics, com els que actuen sobre la penicil·lina.
Per exemple: L’enzim que combat l’anell de la lactamasa de la penicil·lina i li treu el poder antibiòtic, s’anomena β-lactamasa.
Els plasmidis de resistència tenen un fragment que s’anomena FRF que codifica aquest enzim que els dota de una resistència. També trobem una sèrie de seqüències gèniques que codifiquen per enzims resistents a varis antibiòtics. Podríem determinar doncs, dos tipus de resistència diferents:
- RTF, que determina la transmissió de resistència.
- Uns altres que hi ha els determinants de resistència
Bacteriocines:
Són plasmidis que produeixen proteïnes que inhibeixen o destrueixen altres bacteris estretament relacionats. Per exemple, els E. Coli que codifiquen la síntesi de proteïnes en contra del E. Coli.
Plasmidis de virulència:
Contenen gens que codifiquen la síntesi de toxines o que augmenten la capacitat de resistir les defenses de l’hoste (normalment d’eucariota animal / home). Són propis de bacteris que ells mateixos no solen tenir virulència, però amb aquests plasmidis són capaços de crear o sintetitzar una toxina determinada (exemple: soques enterotoxígenes de E.coli, toxina tetànica de C. Titani i toxina de carboncle de B. Anthracis.
Transposons:
Són elements gènics que tenen la capacitat de desplaçar-se (saltar) pel genoma de procariotes i eucariotes. A més de saltar dins del cromosoma, també poden saltar dins dels plasmidis i des de els plasmidis fins al DNA original, cosa que els dota de més diversitat. Hi ha dos tipus basics de transposons:
- Seqüencies d’inserció: són seqüències relativament curtes de DNA i que codifica a els enzims necessaris per a poder saltar.
- Transposons compostos: en els extrems tenen dues seqüències de inserció i entre aquestes seqüències podem trobar gens que codifiquin per diferents gens. Tots aquests gens estan entre els dos punts d’inserció de cada extrem.
Com salten aquests transposons? Tipus de transposicions:
- Conservativa: el nº total de còpies és un. El transposo pot moure’s però no pot replicar-se, per tant, va movent-se de DNA a DNA però sempre n’hi haurà un.
- Replicativa: el nº total de còpies és 2 com a mínim. El transposo es duplica abans d’insertar-se en el nou genoma. La majoria dels transposons, una copia queda en el lloc original i l’altra s’inserta al genoma.
Efectes de la transposició:
- Formació de plasmidis R.
- Disseminació d’informació molt elevada.
- Poden alterar la seqüència de un gen, depenent del lloc on es col·loquin, per tant, causen mutacions.
Recombinació genòmica (com s’integra un o més DNA i formen una nova seqüència de nucleòtids):
Hi ha tres maneres diferents de recombinació genètica:
- Recombinació general (homòloga): la més freqüent. Es dona entre seqüències molt semblants. Si la molècula és molt semblant al lloc on s’ha d’integrar, és molt fàcil que s’integri per complementarietat. No fa falta que sigui completament idèntica. Es duu a terme a qualsevol lloc del genoma on hi hagi una seqüència homologa i intervenen gens rec del cromosoma.
Per assegurar-se que el bacteri E.coli en el cultiu ha adquirit el plasmidi, s’utilitza un plasmidi que conté un gen de resistència a un cert antibiòtic (per exemple: tetraciclina). La colònia que creix en el medi amb tetraciclina ha adquirit el plasmidi (però no necessàriament el gen). Aquest mètode funciona amb gens de procariotes, però no a eucariotes (que tenen introns i exons).
La transcriptasa inversa és un reactiu que prové dels retrovirus, que tenen com a genoma RNA i s’integren al DNA del seu hoste (ja que prèviament amb la transcriptasa inversa han passat el seu RNA a DNA). Quan tenim el RNAm que volem el tractem amb transcriptasa inversa i generarà el DNA complementari al RNAm (cDNA).
Vectors de clonació:
- El més conegut són els plasmidis, en els quals se li introdueix un fragment d’interès perquè utilitzi els seus mecanismes de replicació i repliqui el fragment. Els plasmidi són fàcils de introduir i fàcils de aïllar i purificar, per això es fàcil la seva manipulació. Porten gens de resistència a els antibiòtics, i per això podrem jugar amb les diferents soques. Els Plasmidi PBR 332 conté dos gens que codifiquen resistència a dos antibiòtics diferents: ampicilina i tetraciclina. Per assegurar-nos que ha entrat el fragment desitjat dins el plasmidi utilitzarem plasmidis resistents a dos medis de cultiu diferent i introduirem el fragment amb un enzim de restricció que talli pel mig d’un gen de resistència, és a dir, anul·li una resistència. Mitjançant la comparativa de dos medis de cultiu, sabrem quins són els que han introduït el gen i quins no.
- Fags: són monocatenaris o bicatenaris. El genoma fag, és modificat i s’introdueix en càpsides virals perquè infecti noves cèl·lules hoste. Els derivats del fag són molt útils en clonació però només permet clonar fragments petits (45kb).
- Còsmids: són plasmidis de esterichia coli artificials, que s’ha modificat genèticament per poder-se empaquetar en partícules fag i llavors es replica com un plasmidi.
- Cromosomes artificials: s’elimina gran part del genoma bacterià (BAC) per poder introduir una gran quantitat de genoma. Es poden utilitzar E. Coli, però si es volen introduir quantitats més grans (2.000.000 pb) es poden utilitzar llevats (YAC). Aquest metòde es util alhora de treballar amb genoma humà, ja que és molt llarg.
- Un mecanisme de clonació de DNA sense utilitzar cèl·lules vives, és el mètode de la PCR. El problema és que els fragments clonats no són molt grans. Aquesta tècnica s’anomena PCR (reacció en cadena de la polimerasa) i permet sintetitzar grans quantitats d’un fragment de DNA sense clonar-lo. S’utilitza un termociclador que varia la temperatura ràpidament. S’utilitza per separar les cadenes de DNA (escalfant-les) i fent que s’ajuntin (refredant-les). Per fer-ho són necessaris: a. DNA diana (20 nucleòtids) b. Cebadors (en excés) c. dNTPs (A, T, G, C) d. Taq polimerasa (termostable): és una DNA polimerasa que utilitza una cadena de DNA com a motlle. La polimerasa pot catalitzar la reacció a temperatures elevades necessàries per mantenir les cadenes separades. La taq polimerasa s’extreu d’un bacteri, Thermus aquaticus, que viu a manantials calents.
La genòmica és l’estudi de l’organització molecular dels genomes, el contingut de la seva informació i dels productes gènics que codifiquen. Hi ha diferents àrees de la genòmica:
- Genòmica estructural
- Genòmica funcional
- Genòmica comparada 5. Aspectes genètics de regulació. Tipus de mecanismes de control:
Concepte de regulació: model bacterià
J. Mond 1940. E. coli sabien que lactosa positiva utilitza lactosa. Té una permeasa que
transporta lactosa a l’interior de la cèl·lula i l’enzim B- galactosidasa trenca la lactosa en glucosa i galactosa. Si fem créixer E. coli en un medi de cultiu sense lactosa, la quantitat de les dues proteïnes és molt baixa. En canvi, en presència de lactosa les dues estan presents en alta quantitat.
La alolactosa (isòmer de la lactosa) és qui activa la síntesis de proteïnes. L’operò lactosa està format per una sèrie de gens que es tradueixen de forma sistrònica en presència de lactosa (β- galactosidasa- degrada la lactosa en glucosa i galactosa, permeasa- permet l’entrada de glucosa a l’interior de la cèl·lula). L’operó lacO és l’operador de la lactosa i conté el promotor i altres elements.
Operó: unitat d’expressió gènica coordinada dels gens que participen en el catabolisme o biosíntesi d’enzims. Està format per:
- regulador: sintetitza una proteïna repressora activa o inactiva segons el tipus de regulació (catabolisme o biosíntesi d’enzims).
- Promotor: és on es lliga la polimerasa per fer la traducció de l’RNAm.
- Operador: és on actua la proteïna repressora d’aquest sistema.
- Estructurals: codifiquen un polipèptid.
- Operó lactosa : el primer que van descobrir.
Quan en el medi hi ha lactosa hi ha molta β-galactosidasa. Van veure que la producció d’aquest enzim era induïble mitjançant una molècula petita (alolactosa). Només són necessàries quan el substrat (lactosa en aquest cas) està disponible i no estan presents en absència de l’inductor. Els enzims que es poden activar d’aquesta manera es coneixen amb el nom d’ENZIMS INDUIBLES.
Sense inductor: No hi ha lactosa al medi
Lac Z β-galactosidasa Lac Y permeasa O operó lactosa
Enzims constitutius: Es produeixen en una taxa constant. Es necessiten sempre. Com per exemple els enzims glucosa – glucòlisi. Medi de cultiu: glucosa + lactosa: Quan el medi hi ha glucosa i lactosa el creixement és diàuxic: hi ha dues àreea de creixement exponencial. La regulació de diferents nutrients afavoreix la utilització del nutrient més fàcil de degradar: en aquest cas el més fàcil de degradar és la glucosa perquè no li val la pena fabricar enzims (per tant gastar energia) per consumir la lactosa.
- glucosa: enzim constitutiu, bon substrat, AMP cíclic
- succinat: mal substrat, AMP cíclic.
- ↑cAMP inhibició de l’operò Lac.
Creixement diàxic: Control positiu: repressió per catabòlit Quan hi ha una font d’energia d’utilització fàcil, com en E.coli la glucosa, la concentració de AMPc. Quan hi ha poca concentració de AMPc (senyal metabòlica) indueix la síntesis de CAP (proteïna activadora de catabòlits. Receptora de l’AMPc), que inhibeix la transcripció dels gens que codifiquen els enzims del metabolisme de lactosa, encara que la concentració en el medi sigui alta.
Quan la concentració de glucosa és baixa, augmenta la concentració de AMPc que fixa el CAP. El promotor del gens de metabolisme de la lactosa queda exposat, i la RNA polimerasa pot començar la transcripció d’aquests gens (transacetilasa, β-galactosidasa i permeasa).
Si hi ha cAMP: CAP + cAMP ESTIMULA TRANSCRIPCIÓ
Si no hi ha cAMP: no hi ha unió TRANSCRIPCIÓ BAIXA
És la unió de l’ AMPc amb CAP que facilitat que hi hagi una lectura de transcripció de RNAm i que provoca una alta transcripció. La resta està bloquejat perquè hi ha Alactosa.
