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MICROSCOPÍA
Elementos. El Microscopio: M. Óptico y M. Electrónico.
La microscopía es el conjunto de técnicas y métodos que permite producir imágenes aumentadas de objetos con la finalidad de estudiarlos a nivel microscópico. ELEMENTOS I. Objeto
- Material de observación del cual serán estudiados sus componentes a nivel morfológico, bioquímico, fisiológico y/o genético. II. Fuente de Iluminación
- Aquella fuente que tiene la capacidad de evidenciar y distinguir a mayor aumento detalles del objeto. III. Sistema óptico
- Es aquel conjunto de mecanismos que permiten ver objetos invisibles a simple vista. Dependiendo del tipo de microscopio, sus elementos pueden ser diversos. EL MICROSCOPIO (mikròs=pequeño; skopèoo=observar) I. Historia: 1.º. s. XVII: Anton van Leeuwenhoek utilizó el microscopio simple compuesto por la unión de diversas lentes y lupas, con ellas logró obtener un aumento de 260x. Observó bacterias, espermatozoides, glóbulos rojos y protozoos. 2.º. 1590 – 1610 : Hans (padre) y Zacarías (hijo) Janssen construyeron los primeros microscopios compuestos mediante el tallado cuidadoso de lentes biconvexas.
3.º. 1877 : Ernst Abbe publica la Teoría del
Microscopio donde expone y plantea algunas mejoras importantes para la óptica. 4.º. 1877: Carl Zeiss sustituye el agua por aceite de cedro como fluido de inmersión, lo que le permitió lograr un aumento de 2 000x. II. Tipos de Microscopía A. M. Simple: Aumenta la imagen de muestra de 10 a 15 veces. Para ello utiliza una sola lente ocular biconvexa montada en un soporte que se conecta con una columna afirmada a una base o pie. Es útil para la observación de muestras diseccionadas de hongos, insectos, estructuras vegetales. B. M. Compuesto: Se dice “compuesto” porque compone la luz haciendo que atraviese dos o más lentes que aumentan la imagen. Entre 100 y 1 500 veces. Utiliza 3 sistemas de lentes: condensador, objetivos y oculares.
- M. Óptico Fotónico: Emplea a la luz como fuente de iluminación.
Consiste en pasar la luz empleada a través de lentes ópticos múltiples. COMPONENTES a. Componente Óptico Objetivo (s)
- Imagen real Invertida - Define la nitidez y el poder de resolución - Lente convergente = convexas ^ Lente divergente = cóncavas - El poder de resolución es un parámetro óptico que determina la nitidez y calidad de la imagen. - El límite de resolución es la distancia mínima entre dos puntos para ser discriminados como tales.
Aumento
Grosor del
cubreobjetos
Longitud del tubo
AN
Lente inferior, de campo o colectora: Recibe la imagen real formada por el objetivo y lo refracta y origina en el plano del diafragma del ocular una imagen.
- Se pueden clasificar, según la disposición de lentes y el diafragma dentro del tubo, en: Negativos de Hüygens: Dos lentes con planos y convexos cuya superficie convexa se dispone hacia abajo. El diafragma se sitúa entre las lentes. Positivos o de Ramsden: Dos lentes planos y convexos cuyas superficies curvas se orientan hacia adentro. Diafragma debajo del lente inferior. b. Componente Mecánico Es aquel conjunto de sistemas que sirven de sostén, movimiento y sujeción de los sistemas ópticos y de iluminación, así como de los objetos que se van a observar. Sistema de Soporte - Platina: es el soporte plano que posee una perforación central sobre el cual se coloca la muestra a observar. Está compuesta de una escala de medición y de un par de pinzas o carrito a charriot para sujetar la muestra. - Pie o Base: soporte metálico y sólido en donde se apoyan los otros componentes. - Tubo óptico: cilindro metálico que suele medir 160mm o 170 mm de longitud, el cual, en un extremo, está conectado al revolver y en el otro se relaciona con el (los) ocular(es). - Brazo, estativo o columna: Permite la sujeción y traslado del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la platina y el revolver. - Cabezal: componente situado en relación con el tubo del microscopio que alberga
principalmente prismas o espejos que sirven para acondicionar en él dos o más oculares, o sistemas mecánicos que soportan cámaras fotográficas, de vídeo o sistemas de proyección de la imagen. Sistema de Enfoque
- Macrométrico: produce desplazamientos evidentes y rápidos de la platina. - Micrométrico: produce movimientos imperceptibles de la platina y sirve para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen. Sistema de Ajuste - Anillo de ajuste de los oculares: Permite ajustar los oculares a la posición de los ojos del observador. - Revólver o portaobjetivos: Es un componente que gira alrededor de un eje con la finalidad que los objetivos que sostiene coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina. - Tornillo del cabezal: Permite mover y ajustar la posición del cabezal. - Tornillo del condensador: Permite ajustar el condensador con la lámpara. - Tornillos reguladores de la platina: Permiten mover la platina para alinear la muestra con el objetivo. - Palanca de cierre del diafragma: Permite modificar la apertura del diafragma. c. Componente de Iluminación Fuente de Luz - Por lo general es una lámpara halógena de intensidad graduable. Condensador - Concentra y regula los rayos que provienen de la fuente luminosa. - Dos lentes convergentes. - Orienta la mayor cantidad de rayos luminosos a la abertura central de la platina. - Suele poseer un diafragma o iris que regula la cantidad de luz incidente. Diafragma o Iris - Se sitúa dentro del condensador. - Si se cierra, mejora el contraste, pero empeora la resolución. Filtro(s) - Se halla(n) en diversas partes del recorrido de haz luminoso, aunque en la mayoría de los casos se sitúan entre la fuente luminosa y el condensador. - Modifica(n) la longitud de onda de la luz que ilumina el objeto a observar.
cambios de color atenuados tanto que las células parecen coloreadas. Se usa en laboratorios para supervisar cultivos celulares. *Se observan células y tejidos in vivo. * Se observa mitosis in vivo. 1.4. M.O. de Fluorescencia: Emplea fuente de luz U.V., la cual excita a los fluorocromos con los que se tiñe la muestra. Requiere tinción especial con colorantes fluorescentes. La luz se emite en forma de destellos de diferentes colores. La condición esencial para que se produzca fluorescencia es que la longitud de onda de la energía radiante excitatoria sea menor que la longitud de onda emitida. Existen dos tipos de fluorescencia: Natural o Autofluorescencia: se produce cuando determinadas estructuras o sustancias animales o vegetales, al ser excitadas con radiación ultravioleta irradian fluorescencia. Por ejemplo, la clorofila, Vitamina “D”, el pigmento flavina (componente del semen). Artificial: Es aquella que irradian, de manera específica, determinadas estructuras celulares o tisulares cuando son “coloreadas” por fluorocromos y observadas a través del microscopio de fluorescencia. La fluorescencia artificial se aplica mediante procedimientos directos o indirectos, según la naturaleza del fluorocromo. Algunas moléculas fluorescentes son fluoresceína (luz azul (450nm) luz verde (520nm)), rodamina, bromuro de etidio y naranja de acridina. Se emplea en la investigación del efecto ciertas sustancias en células o tejidos específicos. Así también, para la observación de procesos celulares como endocitosis. *Se observan microbios en muestras tisulares. *Se observan sustancias de autofluorescencia. 1.5. M.O. de Luz polarizada: Presenta dos polarizadores constituidos por una hoja de polaroid o por prismas de Nicol de calcita: Condensador: por debajo del condensador. Analizador: por encima de las lentes del objetivo. Permite la observación de materiales celulares anisotrópicos o birrefringentes; es decir, a través de los cuales la velocidad de propagación de la luz polarizada depende de su dirección. Existen dos tipos de birrefringencia: Positiva: nlongitudinal > nperpendicular Negativa: nlongitudinal < nperpendicular Puede ir acoplado a una videocámara.
*Se observan sustancias cristalinas y fibrosas. *Se observan sustancias de amiloide, colágeno, queratina, etc. 1.6. M.O. de Láser Confocal o Confocal de Barrido: Variante del microscopio de fluorescencia. La fuente de la luz proviene de un láser. Es un microscopio que realiza un barrido de luz por toda la muestra resultando en una imagen bidimensional y posteriormente, se procede a recoger la información secuencial de cada punto para obtener un registro en una imagen tridimensional. Es de capacidad limitada ya que no puede obtener imágenes de cortes finos. Presenta una profundidad de campo de 150 nm.
- Permite observar estructuras como las redes del
citoesqueleto.
- M. Electrónico: Emplea haces de electrones como fuente de iluminación. Consiste en emitir los haces de electrones a través del cátodo en todas las direcciones del espacio y para reorientarlos y acelerarlos se emplea el ánodo que genera un alto potencial eléctrico positivo. El cañón de electrones consta de filamentos de tungsteno o wolfiano que emiten estos al ser calentados al vacío.
Tinción positiva: Consiste en realizar cortes finos a la muestra y fijarla (glutaraldehído o t. de osmio) para luego proceder a una congelación mediante hielo vitreo. Una vez realizado ello, se tiñe la muestra (acetato de uranio o citrato de plomo), esto permite ver una imagen oscura. Tinción negativa: Consiste en combinar a la muestra con metales pesados que rodeen la superficie, gracias a ello una lamina densa de electrones rodeará la muestra y permitirá observar una imagen clara en un fondo oscuro. El aumento varía entre 20 000x – 10 000 000x. El corte histológico debe ser de 500nm de espesor como máximo. *Se forman imágenes con zonas iluminadas o claras denominadas electronlúcidas, y otras oscuras o electrondensas. 2.2. M.E. de Barrido o Scanning (MEB o SEM): COMPONENTES El haz de e-^ se emplea para barrer el espécimen y producir la salida de e-^ secundarios que son los que generan la imagen. Los haces secundarios son detectados captados por un detector o fotomultiplicador. La muestra se rota para que se deposite uniformemente. La muestra se coloca por debajo del lente objetivo, en la base del tubo. Imágenes tridimensionales. La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente o monitor. Se emplea para el estudio de las características de la superficie celular.
Se distinguen estructuras de tamaño menor a 0.2μm y mayor a 2. nm. Ofrece imágenes con una resolución que alcanzan de 10nm - 20 nm. *Se observan relieves celulares definidos.
