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Resumen tema 1: Microsco pios
Las propiedades que nos interesan de una célula con vistas a su estudio microscopio son su reducido tamaño y su poco contraste por estar compuestas de átomos ligeros.
La solución:
- Modificar la física del microscopio
- Modificar el contraste de la muestra
Microscopio óptico de campo claro (MCC)
Fundamento: Captación de la luz dispersada por la muestra.
Componentes: Fuente de luz blanca, condensador, muestra, objetivo.
Conceptos a conocer: límite de resolución, apertura numérica, índice de refracción, ángulo de dispersión y poder de resolución.
Material de trabajo: Células muertas teñidas con colorantes o células vidas con pigmentos naturales.
Microscopio óptico de campo oscuro (MCO)
Fundamento: Captación de luz dispersada por la muestra.
Menor poder de resolución (AN=1)
Componentes: Fuente de luz blanca, filtro opaco circular, condensador, muestra, objetivo.
La luz es dirigida por el condensador de forma muy oblicua, por lo que el objetivo solo capta los fotones dispersados por la muestra.
Material de trabajo: Material vivo. Se observa la muestra biológica como un halo luminoso, pero no su interior, sobre un fondo negro.
Microscopio óptico de contraste de fases (MCF)
Fundamento: Pequeñas variaciones en el índice de refracción (retraso de fase) que provocan los componentes celulares.
Mayor resolución pudiéndose observar el interior celular.
Componentes: Fuente de luz blanca, anillo condensador, lente condensadora, muestra, objetivo, plato de fase (retraso de fase extra).
La luz dirigida atraviesa la muestra y sufre un retraso de fase en función de los materiales que es retrasada un poco más por el plato de fase para poder observar la diferencia.
Material de trabajo: Material vivo sin manipular. Se observan zonas claras en los materiales menos densos y zonas más oscuras en los más densos. Además se observa un halo alrededor de las células gracias al anillo condensador. Se observan los orgánulos celulares.
Microscopio de Nomarski o de contraste por interferencia diferencial (DIC)
Fundamento: Pequeñas variaciones que sufre la luz en el índice de refracción al atravesar los componentes celulares.
Componentes: Fuente de luz polarizada y monocromática, prisma, condensador, muestra, objetivo, prisma.
La luz es descompuesta en dos haces paralelos al atravesar el primer prisma y atraviesa la muestra pudiendo sufrir retrasos diferentes en cada haz de luz. Al volver a unirse en el segundo prisma uno llega antes que otro y da lugar a una imagen tridimensional que carece de halos.
Material de trabajo: Material vivo que puede ser grueso. Se aprecian muy bien los límites celulares.
Microscopio de fluorescencia/epifluorescencia (MF)
Fundamento: Capacidad de los fluorocromos para emitir fluorescencia.
Componentes: Fuente de emisión, Filtro de excitación, espejo dicroico, muestra, filtro o barrera de emisión.
El filtro de excitación selecciona la longitud de onda de excitación que es dirigida por un espejo hacia la muestra. Los fluorocromos se excitan y emiten en una longitud de onda seleccionada por el filtro barrera para no tener interferencias.
Conceptos a conocer: Espectro de excitación, espectro de emisión, blanqueamiento o photobleacing y apagado o quenching.
Material de trabajo: Material vivo o muerto que tiene que contener fluorcromos (uno o varios que no solapen su espectro de emisión). La imagen debe de ser combinada con otro tipo de microscopía óptica para situar la fluorescencia.
Microscopía de barrido confocal (MBC)
Fundamento: Capacidad de los fluorocromos para emitir fluorescencia.
Resolución óptica 0,1 μm, resolución digital 15.000 aumentos.
Componentes: Emisor laser, pinhole de excitación, espejo dicroico, muestra, objetivo, pinhole de detección, detector.
El láser pasa a través del pinhole de excitación que lo distribuye, el objetivo la concentra y atraviesa la muestra. Los fluorocromos se excitan y emiten fluorescencia,
