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obtencion de levaduras de puña uva y mora
Tipo: Esquemas y mapas conceptuales
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Las frutas son micro hábitats importantes para una variedad de especies de levaduras en la naturaleza debido a su alta concentración de azúcares simples, bajo pH y la constante visita por insectos vectores. Este trabajo tuvo como objetivo principal el aislamiento e identificación de las levaduras encontradas en los zumos de mora, piña y uva. La identificación de las cepas se realizó mediante el uso de técnicas moleculares. JUSTIFICACIÓN: El propósito de esta investigación fue identificar las especies de levaduras más representativas en tres frutas: uva, piña y mora. En este estudio se usaron métodos moleculares para la caracterización de las levaduras nativas presentes en las tres frutas. FUNDAMENTO TEÓRICO O MARCO TEORICO: Las levaduras son hongos unicelulares que pueden ser clasificados en dos grupos filéticos: levaduras ascomicetos asana mórficas y teleomorfas y levaduras basidiomicetos asana mórficas. Debido a su gran diversidad fisiológica pueden crecer en un amplio rango de hábitats. Al ser organismos heterotróficos requieren para su crecimiento nutrientes minerales y una cantidad significativa de carbono orgánico. La variedad de hábitats en los cuales se pueden encontrar levaduras incluye: suelos, insectos, plantas, frutas, exudados de árboles, algas, ambientes marinos y la atmosfera. De igual manera, su presencia también es común en alimentos manufacturados, bebidas fermentadas, en intestinos de animales entre otros Las frutas son micro hábitats importantes para una variedad de especies de levaduras en la naturaleza debido a su alta concentración de azucares simples, bajo pH y la constante visita por insectos vectores.
En estos sustratos la sucesión de levaduras está involucrada en varios procesos bioquímicos y ecológicos, incluyendo el deterioro de las frutas. Esto ocurre debido a la habilidad de las levaduras para utilizar rápidamente azucares simples presentes en los sustratos. La presencia de especies proteolíticas y rápidamente sobre estos sustratos puede cumplir un papel muy importante en el establecimiento y mantenimiento de la comunidad levaduriforme. Durante la colonización de las frutas algunos de estos factores pueden conferirles ventajas adaptativas a algunas especies. La presencia de cepas productoras de b-glucosidasa puede contribuir a mejorar las características aromáticas de las frutas, además de ser de importancia biotecnológica para su aplicación en la industria alimenticia. PROPUESTA DE INVESTIGACIÓN O MARCO PRÁCTICO: Preparación del zumo y aislamiento de las levaduras: El zumo de las frutas (piña, mora y uva) se preparó agregando 10 g de la fruta en 100 mL de agua destilada estéril. Se realizaron 5 preparaciones de cada zumo. Para cada preparación diferente se hizo un muestreo, en cada uno de estos, se realizaron diluciones seriadas (10-1- 10-5) y aislamiento en medio de cultivo YPDA (1% extracto de levadura, 2% peptona micológica, 2% de glucosa, 2% agar) suplementado con 25 mg/L de penicilina y cloranfenicol. Las placas se incubaron a 30°C por 3 días y se aislaron las colonias más representativas. Caracterización fenotípica: Los aislados fueron analizados según criterios morfológicos y fisiológicos de acuerdo a las descripciones realizadas por Boekhout et al. (2004). Se evaluó la morfología celular, modo de reproducción vegetativa y caracterización fisiológica. La habilidad para fermentar (2% de fuente de carbono) y asimilar (0,5% de fuente de carbono) glucosa, maltosa, sacarosa, y fructosa fue evaluada por la acumulación de dióxido de carbono en tubos durhamy turbidez en escala de Wickerham, respectivamente. Finalmente, se evaluó la halo-tolerancia (10, 15% p/v) en medio YNB, y la termo tolerancia (28°C, 30°C y 35°C) en medio YPDA (Boekhout et al., 2004). Todas las pruebas fisiológicas se realizaron a 30°C. Extracción de ADN genómico de levaduras: Para la extracción de ADN genómico de levaduras, se empleó el protocolo de Osorio-Cadavid et al. (2009): se tomó un cultivo fresco que se puso a crecer en medio YPD a 120rpm por 16 horas a 28°C. Posteriormente, se recuperaron las células por centrifugación. (Microcentrífuga Eppendorf) a 8000 rpm durante 5 min en un tubo de microcentrífuga. Luego se Re suspendió el precipitado de células en 0,5 mL de una solución de Sorbitol 1 M, EDTA 0,1 M, (pH 5), que contenía 50 unidades (U) de la enzima Beta-unidades (Sigma-Aldrich). La suspensión se incubó en baño maría a 37°C por 60 minutos, agitando periódicamente. Seguidamente se centrifugó la suspensión a 8000 rpm por 10 minutos y se Re suspendió el precipitado en 0,5 mL
Re suspendió en 28μL de mezcla de PCR: 0,5 μM ITS1, 0,5 μM ITS4, 10 μM dNTPs, 1X NH4+, 1, mM MgCl2, y 1U de Taq Polimerasa. Los amplificados fueron visualizados por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y visualizadas con Bromuro de Etidio a 240 nm. Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados por la empresa Macrogen-USA. Posteriormente, las secuencias (Forward y Reverse) enviadas vía Internet fueron ensambladas y corregidas mediante el programa Chromas Pro v. 1,42 Æ y comparadas con las secuencias reportadas en las bases de datos NCBI y CBS-KNAW usando el algoritmo ìBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)î. BIBLIOGRAFIA: http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v11nspe/v11nespa16.pdf