IMPACTO DE LA ESTRATEGIA DE ALIMENTACIÓN
EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS EN
CULTIVOS FED-BATCH DE YARROWIA LIPOLYTICA:
EN EL ROL DE LA OSMOLARIDAD
Presentado por:
Alexandra Fernández
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vision general sobre las levaduras
Tipo: Diapositivas
2020/2021
1 / 28
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IMPACTO DE LA ESTRATEGIA DE ALIMENTACIÓN
EN LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
HETERÓLOGAS EN
CULTIVOS FED-BATCH DE YARROWIA LIPOLYTICA :
EN EL ROL DE LA OSMOLARIDAD
Presentado por: Alexandra Fernández Valentina Herrera
INTRODUCCIÓN La aplicación de proteínas enzimáticas en numerosas ramas industriales, como la producción de alimentos, productos para el hogar, cosméticos, productos químicos o productos biofarmacéuticos, revolucionó su escenario de mercado, debido a su prestación de preparaciones enzimáticas para el mercado global el cual se realiza principalmente por la producción microbiana, con una contribución significativa de la sobreexpresión heteróloga de proteínas recombinantes. la producción de alto nivel para las enzimas recombinantes se logra mediante la aplicación de diferentes enfoques, incluyendo tanto la manipulación genética del organismo huésped y optimización de las condiciones de bioprocesamiento. Entre las diversas estrategias posibles, se informaron con frecuencia cultivos fed-batch para mejorar producción de proteínas dirigidas enzimáticas, así como los otros bioproductos, incluyendo metabolitos primarios y secundarios.
El Fed-batch es un proceso de fermentacion al que se le añade, continua o secuencialmente medio fresco sin la eliminación del cultivo crecido por lo tanto, el volumen de un cultivo discontinuo alimentado aumenta con el tiempo. Se ha afirmado que el cultivo de alimentación Fed-batch es la estrategia generalmente preferida para la producción a gran escala de proteínas heterólogas por levaduras especialmente, cuando se combina con alta densidad celular cultivo. En el presente estudio, se examinaron diferentes estrategias de provisión de medios de alimentación y se evaluaron sus efectos en la producción de proteínas secretoras heterólogas por la cepa de Yarrowia lipolytica recombinante en cultivos alimentados por lotes, la cepa recombinante tiene un gen heterólogo que codifica la glucoamilasa del hongo termófilo Thermomyces lanuginosus (TlGAMY).
MATERIALES Y MÉTODOS
CEPA
● Utilizaron una cepa derivada de Po1d Y. lipolytica, la cual lleva un gen
heterólogo que codifica para la glucoamilasa de TlGAMY.
PREPARACIÓN DEL CULTIVO
● Se realizaron precultivos para el fed-batch desarrollados a partir stocks de glicerol
almacenados a -80 °C de Y. lipolytica y se realizó la difusión de biomasa en agar
YPD.
● Tras 24 horas se extrajo la biomasa y se transfirió a matraces de 1 litro que
contenían 150 ml de medio YPD.
● Los cultivos fueron incubados en un shaker (BIOSAN) a 250 rpm, 30 ° C, durante
22 h y se utilizaron para la inoculación de los cultivos.
ESTRATEGIAS DE ALIMENTACIÓN EN CULTIVOS FED-BATCH ● (^) Estrategia A) : Suministro intermitente en intervalos regulares de 24 horas; a las 24, 48, y 72h de cultivo, en cantidades iguales (330 g de 5xYPG100). ● (^) Estrategia B) : Suministro intermitente en intervalos regulares de 12 horas; a las 24, 38, y 48 h de cultivo, en cantidades iguales (330 g de 5xYPG100). ● (^) Estrategia C) : Alimentación continua automática (en conjunto 1 L, 5xYPG100) a una velocidad de (28 g de glicerol / h), comenzando a partir de las 24 h de cultivo. ● (^) Estrategia D) : Alimentación automatica (en total 1 L, 5xYPG100) en cascada con control de pO2 (DO = 20%) para mantener el cultivo de glicerol limitado, a partir de 10 h de cultivo.
● Las muestras fueron recolectadas a lo largo del cultivo y almacenadas en -20° C
después de la centrifugación (13,000 rpm, 3 min). La biomasa y el sobrenadante
se almacenaron por separado.
● Se continuaron los cultivos hasta el agotamiento de la fuente de carbono y el
aumento en el consumo del ácido, que es una característica habitual de Y.
lipolytica.
BATCH A PEQUEÑA ESCALA COMPLEMENTADOS CON COMPUESTOS OSMOACTIVOS ● (^) Se llevaron a cabo en botellas de laboratorio (Simax) con volumen de 250 ml y 50 ml de cultivo. ● (^) El medio de cultivo que se utilizó fue YPD compuesto de extracto de levadura, bactopeptona y glucosa. ● (^) Los precultivos se incubaron a 30 ° C durante 22 h a 250 rpm, y se utilizó 1 ml para la inoculación de los cultivos fed-batch, para los que se aplicaron los mismos parámetros de cultivo. ● (^) Después de 10h los cultivos se complementaron con compuestos osmoactivos: ● (^) (a) NaCl (POCH) 2,5% y 5% ● (^) (b) sacarosa (Chempur) 150 y 200 g L - ● (^) (c) sorbitol 50 y 250 g L - ● (^) (d) glicerol (POCH) 200 y 250 g L -1.
Las muestras se analizaron respecto a:
● la actividad extracelular amilolítica (ensayo de actividad enzimática)
● la acumulación de biomasa (densidad óptica a 600 nm)
● la osmolaridad del medio (osmómetro)
● la concentración de los metabolitos principales (HPLC)
Ensayo de la actividad amilolítica
La actividad de la glucoamilasa extracelular se analizó de acuerdo con un protocolo
de macroSNT.
Concentración de compuestos químicos en el medio de cultivo (cromatografía líquida
de alto rendimiento, HPLC).
La concentración de metabolitos y la fuente de carbono contenida en el medio de cultivo, se
midió por HPLC.
Análisis estadístico
Todos los resultados se calcularon y se expresaron como valores medios ± desviación
estándar de al menos dos o tres repeticiones. La presentación gráfica de los datos
obtenidos se realizó utilizando el software Microsoft Excel.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Consumo de glicerol y la osmolaridad del medio de cultivo en fed-batch de la cepa
recombinante Yarrowia lipolytica 8.
● (^) Considerando el consumo de glicerol (Figura 3a), que fue el principal la fuente de carbono y el principal compuesto osmoactivo en el medio de cultivo (Figura 3b), el proceso realizado de acuerdo con la estrategia A fue el más regular. ● Las variantes B y C se caracterizaron por una mayor amplitud de la concentración de glicerol y la osmolaridad media.
● (^) La estrategia D resultó ser inferior en comparación con las otras especialmente en términos de productividad volumétrica ● (^) La alimentación intermitente en intervalos de 24 horas fue la más eficiente en términos de promover la producción de la enzima en lugar de la biomasa. ● (^) La actividad específica y la productividad específica de TlGAMY fueron las más altas para los cultivos realizados de acuerdo con la estrategia A